Đánh giá khả năng chịu hạn và nhân gen P5CS của một số giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng

đại học tháI n guyê n Trờng đại học s phạm Hà tiến sỹ ĐáNH GIá KHả NĂNG CHịU HạN Và NHÂN GEN P5CS CủA MộT Số GiốNG ĐậU TƯƠNG ĐịA PHƯƠNG Củ A TỉNH CAO Bằ NG Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60.42.70 Lun vn thc s sinh hc Ngời hớng dẫn khoa học : pgs.ts.Chu hoàng M ậu TháI nguyên - 2007 đại học tháI n guyê n Trờng đại học s phạm H Tin S ĐáNH GIá KHả NĂNG CHịU HạN Và NHÂN GEN P5CS CủA MộT Số GiốNG ĐậU TƯƠNG ĐịA PHƯƠNG CủA TỉNH CAO Bằ NG Lun vn thc s sinh hc TháI nguyên - 2007 MỤC LỤC Lời cam đoan 1 Lời cảm ơn. 2 Mục lục 3 Những chữ viết tắt 5 Danh mục các bảng 6 Danh mục các hình 7 MỞ ĐẦU 8 Ch ƣ ơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 CÂY ĐẬU T Ƣ ƠNG 10 1.1.1. Đặc điểm thực vật học 10 1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam 11 1.1.3. Thành phần hoá sinh hạt đậu tương 12 1.1.3.1. Protein dự trữ và thành phần axit amin 13 1.1.3.2. Lipit, vitamin và một số chất khác 13 1.2. ĐẶC TÍNH CHIỤ HẠN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU T Ƣ ƠNG 14 1.2.1. Ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng 14 1.2.2. Đặc tính chịu hạn và nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây đậu tương 15 1.2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử của tính chịu hạn 17 1.3. GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP PROLINE 21 Ch ƣ ơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PH Ƣ ƠNG PHÁP 25 2.1. NGUYÊN LIỆU 25 2.2. HOÁ CHẤT THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 2.3. PH Ƣ ƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1. Nhóm phương pháp sinh lý, hoá sinh 26 2.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử 31 2.3.3. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 33 Ch ƣ ơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KHỐI L Ƣ ỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU T Ƣ ƠNG NGHIÊN CỨU 34 3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt 34 3.1.2. Hàm lượng lipit và protein ở hạt 35 3.1.3. Kết quả phân tích hàm lượng axit amin liên kết trong hạt 37 3.1.4. Nhận xét về đặc điểm hoá sinh của các giống đậu tương 40 3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU T Ƣ ƠNG NGHIÊN CỨU 41 3.2.1. Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của  - amylase và hàm lượng đường trong giai đoạn hạt nảy mầm 41 3.2.2 Đặc điểm phản ứng của cây đậu tương non đối với hạn 47 3.2.2.1. Tỷ lệ thiệt hại của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non 3 lá dưới tác động của hạn 47 3.2.2.2.Khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non 48 3.2.2.3. Hàm lượng protein và proline của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non 3 lá. 51 3.2.3. Mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên sự biểu hiện của các tính trạng đối với hạn 53 3.2.4. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các giống đậu tương 55 3.3. KẾT QUẢ NHÂN ĐOẠN ADN THUỘC GEN P5CS CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU T Ƣ ƠNG NGHIÊN CỨU 56 3.3.1.Tách chiết ADN tổng số của các giống đậu tương 56 3.3.2. Nhân đoạn ADN thuộc gen P5CS của các giống đậu tương 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA : Axit abscisic (Abscisis acid) ADN: Axit deoxyribonucleic ARN : Axit ribonucleic ASTT: Áp suất thẩm thấu ATP : Adenosin triphosphat ATP – ase : Enzym phân giải ATP AtproT 1 : Arabidopsis proline transporter 1 AtproT 2 : Arabidopsis proline transporter 2 Bp : Cặp bazơ cADN : Sợi ADN bổ sung được tổng hợp từ mARN nhờ enzyme phiên mã ngược dNTP : Deoxynucleotide EDTA : Ethylendiamin tetraacetic acid HSP : Heat shock protein - Protein sốc nhiệt Kb : Kilo bazơ = 1000 bp KTPT : Kích thước phân tử LEA : Late embryogenesis abundant LeproT 1 : The proline transporter 1 LeproT 2 : The proline transporter 2 LeproT 3 : The proline transporter 3 MGPT : Môi giới phân tử - Molecular chaperone MW : Molecular weight - Khối lượng phân tử NaOAC : Natriacetat P 5 C : Deltal - pyrroline - 5- carboxylate P 5 CS : Delta pyrroline - 5 - Carborxylate Synthetase P 5 CR : Deltal pyrroline – 5- Carboxylate reductase PCR : Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polimerase TBE : Tris - Boric acid - EDTA DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Sản lượng đậu tương Thế giới niên vụ 2006 – 2007 12 Bảng 2.1. Nguồn gốc của các giống đậu tương 25 Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR 33 Bảng 3.1. Hình dạng, kích thước, màu sắc, khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương nghiên cứu 34 Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipit của 7 giống đậu tương 36 Bảng 3.3. Hàm lượng các axit amin trong hạt của các giống đậu tương 38 Bảng 3.4. Thành phần và hàm lượng axit amin trong protein hạt của các giống đậu tương (g axit amin/100g protein 39 Bảng 3.5. Hàm lượng các axit amin không thay thế trong hạt 40 của 7 giốngđậu tương (g axit amin/100g protein 42 Bảng 3.6. Hoạt độ  - amylase trong các giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 7% (ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm) 42 Bảng 3.7. Hàm lượng đường tan của các giống nghiên cứu ở giai đoạn này mầm 44 Bảng 3.8. Tương quan giữa hoạt độ  - amylase và hàm lượng đường tan ở các giai đoạn hạt nảy mầm…………………………………………… 46 Bảng 3.9. Tỷ lệ thiệt hại của 7 giống đậu tương ở giai đoạn cây non 3 lá 47 Bảng 3.10. Bảng tổng hợp các chỉ tiêu đánh giá khả năng chịu hạn 50 Bảng 3.11. Hàm lượng protein và proline của cây đậu tương 3 lá 52 Bảng 3.12. Hệ số khác nhau giữa các giống đậu tương 54 Bảng 3.13. Hàm lượng và độ tinh sạch của ADN tổng số của 7 giống đậu tương 57 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ mô tả quá trình biến đổi của proline trong tế bào 22 Hình 3.1. Hạt của 7 giống đậu tương nghiên cứu 35 Hình 3.2. Biểu đồ so sánh hàm lượng axit amin không thay thế của các giống đậu tương nghiên cứu với tiêu chuẩn của FAO 40 Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ α - amylase trong các giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý bởi sorbitol 7% ở 7 giống đậu tương 42 Hình 3.4. Hoạt độ của  - amylase ở 7 giống đậu tương trong các giai đoạn hạt nảy mầm 43 Hình 3.5. Hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 7% của 7 giống đậu tương 45 Hình 3.6. Tỷ lệ thiệt hại của 7 giống đậu tương 48 Hình 3.7. Ảnh cây đậu tương non sau 9 ngày hạn .48 Hình 3.8. Chiều dài rễ của 7 giống đậu tương sau 7 ngày hạn 49 Hình 3.9. Đồ thị thể hiện khả năng chịu hạn của 7 giống đậu tương 51 Hình 3.10. Biểu đồ so sánh sự biến động hàm lượng protein trước và sau hạn 53 Hình 3.11. Biểu đồ so sánh sự biến động hàm lượng proline trước và sau hạn 53 Hình 3.12. Sơ đồ quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên sự biểu hiện của các tính trạng đối với hạn 55 Hình 3.13. Hình ảnh điện di ADN tổng số của các giống đậu tương 57 Hình 3.14. Hình ảnh điện di đoạn gen P5CS (1,8kb) được nhân lên bằng kỹ thuật PCR ở các giống đậu tương 58 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây thuộc họ đậu, có hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, đặc biệt giàu protein, nên đậu tương được trồng để làm thức ăn cho người và gia súc. Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, sữa đậu nành, làm bánh kẹo, nước giải khát, nước chấm…đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc [10]. Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định đạm, nên trồng cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác, vì vậy cây đậu tương thường được trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc màu. Ở Việt Nam cây đậu tương có một vị trí quan trọng trong nền sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển. Hiện nay cây đậu tương được gieo trồng tại 43 trong số 61 tỉnh thuộc cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước [10]. Các giống đậu tương ở nước ta hiện nay rất đa dạng phong phú gồm các giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo giống đậu tương đột biến và tập đoàn các giống đậu tương địa phương. Trong những năm gần đây cùng với việc tạo ra các giống đậu tương mới cho năng suất cao, các nhà chọn giống đậu tương còn quan tâm nghiên cứu các giống đậu tương địa phương, những giống này thường có năng suất thấp nhưng chất lượng hạt cao và có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi như nóng, lạnh, hạn… [10]. Địa bàn nước ta chủ yếu là đồi núi, diễn biến khí hậu phức tạp, lượng mưa phân bố không đều giữa các vùng miền và các thời kỳ trong năm, hạn hán thường xuyên xảy ra cùng với những yếu tố môi trường bất lợi khác đã làm giảm năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu của thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng . Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc vào nhóm chịu hạn kém. Cho đến nay, ở nước ta đã có một số công trình nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương [6], [5]. Tiêu biểu là một số nghiên cứu tìm hiểu sở phân tử của các đặc tính này như một số nhóm protein chịu nhiệt LEA, [...]... Lĩnh – Cao Bằng và sử dụng giống đậu tương DT84 làm đối chứng (bảng 2.1) Bảng 2.1 Nguồn gốc của các giống đậu tương Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc Cao Bằng 4 CB4 Giống địa phương - Cao Bằng Hạ Lang HL Giống địa phương Hạ Lang - Cao Bằng Quảng Hoà QH Giống địa phương Quảng Hoà - Cao Bằng Vàng Cao Bằng VCB Giống địa phương - Cao Bằng Trà Lĩnh TL Giống địa phương Trà Lĩnh – Cao Bằng Đông Khê ĐK Giống địa phương. .. - So sánh khả năng chịu hạn và phân tích cơ sở hoá sinh của tính chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng - Phân lập gen P5CS của các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Phân tích đặc điểm hình thái hạt (màu sắc, hình dạng, kích thước hạt) và khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương nghiên cứu -Xác định hàm lượng protein, lipit và thành phần... biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [6], nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103 [7], phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị Phương Liên và cs (1999) [7], [8], [9], nâng cao tính chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến... chuyển gen tổng hợp proline ở lúa, cà chua , thuốc lá và đậu tương kết quả cho thấy khả năng chịu hạn của các giống này đều tăng lên khi được chuyển các gen này Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU Sử dụng 6 giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng làm nguyên liệu nghiên cứu đó là: Cao Bằng 4, Quảng Hoà – Cao Bằng, Vàng Cao Bằng, Hạ Lang Cao Bằng, Đông Khê – Cao Bằng, ... phần axit amin của các giống đậu tương nghiên cứu - Xác định hoạt độ của - amylase và hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm - Phân tích một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh của cây đậu tương non 3 lá trong điều kiện hạn nhân tạo - Xác định mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên phản ứng của kiểu gen trước tác động của hạn - Nhân đoạn ADN thuộc gen P5CS của các giống đậu tương bằng kỹ thuật... (P5CS) Trên thế giới gen P5CS đã được nghiên cứu ở một số đối tượng như Lúa, Thuốc lá, Arabidopsis thaliana, Ngô, Đậu tương [20], [28], [31], [35] Tuy nhiên ở Việt Nam việc nghiên cứu về gen P5CS vẫn còn là vấn đề mới mẻ Xuất phát từ những lý do trên tôi đã tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là: "Đánh giá khả năng chịu hạn và nhân gen P5CS của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng của tỉnh Cao Bằng" 2 MỤC TIÊU... được cDNA của dehydrin từ lá đậu tương khi bị mất nước, ngoài ra các tác giả còn phân lập được cDNA của LEA nhóm D - 95 từ lá và rễ cây đậu tương khi bị hạn [30] Nghiên cứu của porcel và cộng sự (2005), đã chỉ ra rằng, gen mã hoá protein dehydrin (LEA-DII) có vai trò với khả năng chống chịu của đậu tương Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương, tiêu... (1998) [1] và của Đinh Thị Phòng (2001) [13] - Hạt đậu tương nảy mầm gieo vào chậu (kích thước 30cm x 30cm) chứa cát vàng đã rửa sạch, mỗi chậu trồng 40 cây, mỗi giống trồng 3 chậu Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trong điều kiện và chế độ chăm sóc như nhau Thời gian đầu tưới nước cho đủ ẩm, khi cây đậu tương được 3 lá tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương bằng cách... lệ thiệt hại và chỉ số hạn tương đối - Xác định tỷ lệ cây sống sót (%), khả năng giữ nước (%) ở giai đoạn cây lạc 3 lá dưới tác động của hạn Số cây sống Tỷ lệ cây sống sót = 100 (%) Tổng số cây xử lý - Xác định khả năng giữ nước của đậu tương 3 lá trong điều kiện hạn theo công thức: W  W ft W fc (%) Trong đó: W(%): Khả năng giữ nước của cây sau khi xử lý bởi hạn Wft(g): khối lượng tươi của cây sau... màu đen 1.2 ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.2.1 Ảnh hƣởng của hạn đối với cây trồng Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong cơ thể thực vật Hạn là một trong những nguyên nhân chính ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng, tuỳ vào mức độ của hạn mà có ảnh hưởng . ph ƣ ơng của tỉnh Cao Bằng& quot;. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - So sánh khả năng chịu hạn và phân tích cơ sở hoá sinh của tính chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng. -. phạm H Tin S ĐáNH GIá KHả NĂNG CHịU HạN Và NHÂN GEN P5CS CủA MộT Số GiốNG ĐậU TƯƠNG ĐịA PHƯƠNG CủA TỉNH CAO Bằ NG Lun vn thc s. sỹ ĐáNH GIá KHả NĂNG CHịU HạN Và NHÂN GEN P5CS CủA MộT Số GiốNG ĐậU TƯƠNG ĐịA PHƯƠNG Củ A TỉNH CAO Bằ NG Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60.42.70