Đánh giá khả năng chịu hạn và nhân gen P5CS của một số giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây thuộc họ đậu, có hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, đặc biệt giàu protein, nên đậu tương được trồng để làm thức ăn cho người và gia súc. Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, sữa đậu nành, làm bánh kẹo, nước giải khát, nước chấm…đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc vào nhóm chịu hạn kém. Cho đến nay, ở nước ta đã có một số công trình nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương . Tiêu biểu là một số nghiên cứu tìm hiểu sở phân tử của các đặc tính này như một số nhóm protein chịu nhiệt LEA, HSP, axit amin proline...enzyme trong hạt của một số giống đậu tương chịu hạn khác nhau như protein dự trữ protease, amylase. Proline là axit amin có vai trò quan trọng trong quá trình điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào, đồng thời nó còn là một axit amin ưa nước có khả năng giữ và lấy nước cho tế bào. Sự tổng hợp proline trong tế bào có liên quan đến gen detal – pyrroline – 5 – carboxylate synthetase (P5CS). Trên thế giới gen P5CS đã được nghiên cứu ở một số đối tượng như Lúa, Thuốc lá, Arabidopsis thaliana, Ngô, Đậu tương. Tuy nhiên ở Việt Nam việc nghiên cứu về gen P5CS vẫn còn là vấn đề mới mẻ

®¹i häc th¸I nguyªn Tr-êng ®¹i häc s- ph¹m --------------  -------------- Hµ tiÕn sü §¸NH GI¸ KH¶ N¡NG CHÞU H¹N Vµ NH¢N GEN P5CS CñA MéT Sè GièNG §ËU T¦¥NG §ÞA PH¦¥NG CñA TØNH CAO B»NG Chuyªn ngµnh : Di truyÒn häc M· sè : 60.42.70 Luận văn thạc sỹ sinh học Ng-êi h-íng dÉn khoa häc : pgs.ts.Chu hoµng MËu Th¸I nguyªn - 2007 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ®¹i häc th¸I nguyªn Tr-êng ®¹i häc s- ph¹m --------------  -------------- Hà Tiến Sỹ §¸NH GI¸ KH¶ N¡NG CHÞU H¹N Vµ NH¢N GEN P5CS CñA MéT Sè GièNG §ËU T¦¥NG §ÞA PH¦¥NG CñA TØNH CAO B»NG Luận văn thạc sỹ sinh học Th¸I nguyªn - 2007 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cam đoan. .............................................................................................................. 1 Lời cảm ơn. ................................................................................................................. 2 Mục lục........................................................................................................................ 3 Những chữ viết tắt ....................................................................................................... 5 Danh mục các bảng ..................................................................................................... 6 Danh mục các hình ...................................................................................................... 7 MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 8 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 10 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG ......................................................................................... 10 1.1.1. Đặc điểm thực vật học .................................................................................. 10 1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam............................... 11 1.1.3. Thành phần hoá sinh hạt đậu tương ............................................................... 12 1.1.3.1. Protein dự trữ và thành phần axit amin ........................................................ 13 1.1.3.2. Lipit, vitamin và một số chất khác .............................................................. 13 1.2. ĐẶC TÍNH CHIỤ HẠN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG .............................................................................................. 14 1.2.1. Ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng ............................................................ 14 1.2.2. Đặc tính chịu hạn và nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây đậu tương ....... 15 1.2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử của tính chịu hạn ...................... 17 1.3. GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP PROLINE .................................. 21 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .............................................. 25 2.1. NGUYÊN LIỆU .............................................................................................. 25 2.2. HOÁ CHẤT THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................. 25 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 26 2.3.1. Nhóm phương pháp sinh lý, hoá sinh ............................................................. 26 2.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử ................................................................. 31 2.3.3. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu .............................................. 33 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KHỐI LƢỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU ........................ 34 3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt .................................................... 34 3.1.2. Hàm lượng lipit và protein ở hạt ................................................................... 35 3.1.3. Kết quả phân tích hàm lượng axit amin liên kết trong hạt .............................. 37 3.1.4. Nhận xét về đặc điểm hoá sinh của các giống đậu tương ............................... 40 3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 41 3.2.1. Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của  - amylase và hàm lượng đường trong giai đoạn hạt nảy mầm.......................................................................... 41 3.2.2 Đặc điểm phản ứng của cây đậu tương non đối với hạn ................................ 47 3.2.2.1. Tỷ lệ thiệt hại của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non 3 lá dưới tác động của hạn ............................................................................................................. 47 3.2.2.2.Khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non ................ 48 3.2.2.3. Hàm lượng protein và proline của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non 3 lá. ..................................................................................................................... 51 3.2.3. Mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên sự biểu hiện của các tính trạng đối với hạn ....................................................................................................... 53 3.2.4. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ............................... 55 3.3. KẾT QUẢ NHÂN ĐOẠN ADN THUỘC GEN P5CS CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 56 3.3.1.Tách chiết ADN tổng số của các giống đậu tương ......................................... 56 3.3.2. Nhân đoạn ADN thuộc gen P5CS của các giống đậu tương........................... 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 60 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ............................ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA : Axit abscisic (Abscisis acid) ADN: Axit deoxyribonucleic ARN : Axit ribonucleic ASTT: Áp suất thẩm thấu ATP : Adenosin triphosphat ATP – ase : Enzym phân giải ATP AtproT1 : Arabidopsis proline transporter 1 AtproT2 : Arabidopsis proline transporter 2 Bp : Cặp bazơ cADN : Sợi ADN bổ sung được tổng hợp từ mARN nhờ enzyme phiên mã ngược dNTP : Deoxynucleotide EDTA : Ethylendiamin tetraacetic acid HSP : Heat shock protein - Protein sốc nhiệt Kb : Kilo bazơ = 1000 bp KTPT : Kích thước phân tử LEA : Late embryogenesis abundant LeproT1 : The proline transporter 1 LeproT2 : The proline transporter 2 LeproT3 : The proline transporter 3 MGPT : Môi giới phân tử - Molecular chaperone MW : Molecular weight - Khối lượng phân tử NaOAC : Natriacetat P5C : Deltal - pyrroline - 5- carboxylate P5CS : Delta pyrroline - 5 - Carborxylate Synthetase P5CR : Deltal pyrroline – 5- Carboxylate reductase PCR : Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polimerase TBE : Tris - Boric acid - EDTA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Sản lượng đậu tương Thế giới niên vụ 2006 – 2007...........................12 Bảng 2.1. Nguồn gốc của các giống đậu tương ...................................................25 Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR............................................................33 Bảng 3.1. Hình dạng, kích thước, màu sắc, khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương nghiên cứu .......................................................................34 Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipit của 7 giống đậu tương ..............................36 Bảng 3.3. Hàm lượng các axit amin trong hạt của các giống đậu tương.............38 Bảng 3.4. Thành phần và hàm lượng axit amin trong protein hạt của các giống đậu tương (g axit amin/100g protein ................................................39 Bảng 3.5. Hàm lượng các axit amin không thay thế trong hạt ............................40 của 7 giốngđậu tương (g axit amin/100g protein ................................42 Bảng 3.6. Hoạt độ  - amylase trong các giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 7% (ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm) ..........................................................42 Bảng 3.7. Hàm lượng đường tan của các giống nghiên cứu ở giai đoạn này mầm ....44 Bảng 3.8. Tương quan giữa hoạt độ  - amylase và hàm lượng đường tan ở các giai đoạn hạt nảy mầm……………………………………………...46 Bảng 3.9. Tỷ lệ thiệt hại của 7 giống đậu tương ở giai đoạn cây non 3 lá ............... 47 Bảng 3.10. Bảng tổng hợp các chỉ tiêu đánh giá khả năng chịu hạn ...................50 Bảng 3.11. Hàm lượng protein và proline của cây đậu tương 3 lá .......................52 Bảng 3.12. Hệ số khác nhau giữa các giống đậu tương ......................................54 Bảng 3.13. Hàm lượng và độ tinh sạch của ADN tổng số của 7 giống đậu tương .....57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ mô tả quá trình biến đổi của proline trong tế bào .....................22 Hình 3.1. Hạt của 7 giống đậu tương nghiên cứu ...............................................35 Hình 3.2. Biểu đồ so sánh hàm lượng axit amin không thay thế của các giống đậu tương nghiên cứu với tiêu chuẩn của FAO .......................................40 Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ α - amylase trong các giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý bởi sorbitol 7% ở 7 giống đậu tương .................................42 Hình 3.4. Hoạt độ của  - amylase ở 7 giống đậu tương trong các giai đoạn hạt nảy mầm ............................................................................................43 Hình 3.5. Hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 7% của 7 giống đậu tương.......................................................................45 Hình 3.6. Tỷ lệ thiệt hại của 7 giống đậu tương ..................................................48 Hình 3.7. Ảnh cây đậu tương non sau 9 ngày hạn .............................................48 Hình 3.8. Chiều dài rễ của 7 giống đậu tương sau 7 ngày hạn.............................49 Hình 3.9. Đồ thị thể hiện khả năng chịu hạn của 7 giống đậu tương ..................51 Hình 3.10. Biểu đồ so sánh sự biến động hàm lượng protein trước và sau hạn ...53 Hình 3.11. Biểu đồ so sánh sự biến động hàm lượng proline trước và sau hạn ..53 Hình 3.12. Sơ đồ quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên sự biểu hiện của các tính trạng đối với hạn ......................................................................55 Hình 3.13. Hình ảnh điện di ADN tổng số của các giống đậu tương ..................57 Hình 3.14. Hình ảnh điện di đoạn gen P5CS (1,8kb) được nhân lên bằng kỹ thuật PCR ở các giống đậu tương ..............................................................58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây thuộc họ đậu, có hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, đặc biệt giàu protein, nên đậu tương được trồng để làm thức ăn cho người và gia súc. Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, sữa đậu nành, làm bánh kẹo, nước giải khát, nước chấm…đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc [10]. Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định đạm, nên trồng cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác, vì vậy cây đậu tương thường được trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc màu. Ở Việt Nam cây đậu tương có một vị trí quan trọng trong nền sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển. Hiện nay cây đậu tương được gieo trồng tại 43 trong số 61 tỉnh thuộc cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước [10]. Các giống đậu tương ở nước ta hiện nay rất đa dạng phong phú gồm các giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo giống đậu tương đột biến và tập đoàn các giống đậu tương địa phương. Trong những năm gần đây cùng với việc tạo ra các giống đậu tương mới cho năng suất cao, các nhà chọn giống đậu tương còn quan tâm nghiên cứu các giống đậu tương địa phương, những giống này thường có năng suất thấp nhưng chất lượng hạt cao và có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi như nóng, lạnh, hạn… [10]. Địa bàn nước ta chủ yếu là đồi núi, diễn biến khí hậu phức tạp, lượng mưa phân bố không đều giữa các vùng miền và các thời kỳ trong năm, hạn hán thường xuyên xảy ra cùng với những yếu tố môi trường bất lợi khác đã làm giảm năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu của thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng . Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc vào nhóm chịu hạn kém. Cho đến nay, ở nước ta đã có một số công trình nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương [6], [5]. Tiêu biểu là một số nghiên cứu tìm hiểu sở phân tử của các đặc tính này như một số nhóm protein chịu nhiệt LEA, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 http://www.lrc-tnu.edu.vn HSP, axit amin proline...enzyme trong hạt của một số giống đậu tương chịu hạn khác nhau như protein dự trữ protease, amylase [7], [8], [9], [11], [12]. Proline là axit amin có vai trò quan trọng trong quá trình điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào, đồng thời nó còn là một axit amin ưa nước có khả năng giữ và lấy nước cho tế bào. Sự tổng hợp proline trong tế bào có liên quan đến gen detal – pyrroline – 5 – carboxylate synthetase (P5CS). Trên thế giới gen P5CS đã được nghiên cứu ở một số đối tượng như Lúa, Thuốc lá, Arabidopsis thaliana, Ngô, Đậu tương [20], [28], [31], [35]. Tuy nhiên ở Việt Nam việc nghiên cứu về gen P5CS vẫn còn là vấn đề mới mẻ. Xuất phát từ những lý do trên tôi đã tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là: "Đánh giá khả năng chịu hạn và nhân gen P5CS của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng của tỉnh Cao Bằng". 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - So sánh khả năng chịu hạn và phân tích cơ sở hoá sinh của tính chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng. - Phân lập gen P5CS của các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Phân tích đặc điểm hình thái hạt (màu sắc, hình dạng, kích thước hạt) và khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương nghiên cứu. -Xác định hàm lượng protein, lipit và thành phần axit amin của các giống đậu tương nghiên cứu. - Xác định hoạt độ của - amylase và hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm. - Phân tích một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh của cây đậu tương non 3 lá trong điều kiện hạn nhân tạo. - Xác định mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên phản ứng của kiểu gen trước tác động của hạn. - Nhân đoạn ADN thuộc gen P5CS của các giống đậu tương bằng kỹ thuật PCR. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1. Đặc điểm thực vật học Đậu tương có tên khoa học là (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (papilionoi dea). Cây đậu tương có nguồn gốc từ Đông Bắc Trung Quốc vào khoảng thế kỷ thứ XI trước công nguyên. Từ Trung Quốc cây đậu tương được phân bố đến nhiều nước trên thế giới như: Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Mỹ, Brazin, Acgentina… ở Việt Nam cây đậu tương được du nhập từ Trung Quốc rất sớm [7], [10]. Trong thời gian gần đây người ta phát hiện ra được nhiều giá trị của cây đậu tương cũng như việc áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật mới trong sản xuất đậu tương. Về hình thái, rễ đậu tương là rễ cọc gồm rễ cái và rễ bên, trên bộ rễ của cây đậu tương có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium Japonicum có khả năng cố định nitơ từ khí trời cung cấp đạm cho cây có vai trò cải tạo đất [4]. Thân đậu tương có hình tròn, thân non có màu xanh hoặc tím, mầu thân non có mối tương quan chặt chẽ với màu sắc hoa, thân có khả năng phân nhiều cành từ 3 - 8 cành, khi quả chín thì thân ngả sang màu vàng nâu. Lá đậu tương gồm 3 loại lá: lá mầm, lá đơn và lá kép (có 3 lá chét đôi khi có 4-5 lá chét). Hoa mọc thành chùm ở nách lá, mỗi chùm hoa có từ 10-15 hoa, có màu trắng hoặc tím. Hoa đậu tương tự thụ phấn hoàn toàn. Quả có thể thẳng hoặc cong có nhiều lông. Mỗi chùm hoa có từ 2-20 quả và có tới 400 quả trên một cây. Một quả chứa từ 1-5 hạt nhưng thông thường là 2-3, vỏ hạt đậu tương có màu nâu, đen, vàng, xanh. Khối lượng hạt rất đa dạng từ 20-400 mg/hạt. Hạt đậu tương không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh phôi và 2 lá mầm. Căn cứ vào thời gian sinh trưởng của cây đậu tương người ta chia làm 3 loại: Chín sớm (75-85 ngày) trung bình (80-100 ngày), muộn (110-120 ngày). Thời gian sinh trưởng là một yếu tố quan trọng để lựa chọn cây trồng luân canh tăng vụ [10]. Đậu tương là loại cây trồng tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh. Trong tập đoàn đậu tương có những giống chỉ trồng vào vụ hè, có những giống chỉ trồng vào vụ đông [10]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và Việt Nam Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cung cấp dầu quan trọng bậc nhất trong các cây lấy dầu. Ngoài ra trồng đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất vì vậy mà đậu tương được trồng ở khắp các châu lục, theo thống kê của FAO từ năm 1980 trở lại đây sản lượng đậu tương trên thế giới đã tăng lên 2 lần chủ yếu nhờ vào tăng diện tích và năng suất. Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, năng suất bình quân tăng cao 23 tạ/ha. Các nước sản xuất đậu tương đứng đầu thế giới là: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới [10], bảng 1.1 cho thấy trong niên vụ 2006 – 2007 sản lượng đậu tương của thế giới là 236,1 triệu tấn trong đó Mỹ có sản lượng cao nhất 86,8 triệu tấn, tiếp đến là Brazil và Argentina. Trong một vài năm trở lại đây thời tiết không thuận lợi, hạn hán và các yếu tố môi trường xấu khác đã có ảnh hưởng mạnh đến sản lượng đậu tương toàn cầu. Theo Oil World các nước sản xuất đậu tương hàng đầu thế giới đều giảm sản lượng đậu tương trong niên vụ 2006- 2007, Brazil giảm 7,5%, Argentina giảm 6% , còn ở Mỹ giảm hơn 10% so với vụ trước [35]. Ở Việt Nam cây đậu tương chiếm một vị trí quan trọng trong nền sản xuất nông nghiệp đặc biệt là những vùng nông thôn nghèo. Trước Cách mạng Tháng 8 năm 1945 diện tích gieo trồng đậu tương khoảng 3000 ha, năng suất chỉ đạt 4,1tạ/ha [10], được phân bố chủ yếu ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Giang… Sau khi thống nhất đất nước diện tích đậu tương của nước ta đã tăng lên 39954 ha năng suất 5,1 tạ/ha. Hiện nay cây đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu 4 2,3% và vùng duyên hải miền Trung 1,6%[10]. Mặc dù sản lượng đậu tương ở nước ta có tăng nhưng vẫn còn thấp hơn nhiều so với năng suất trung bình của thế giới (thế giới năm 2004 đạt 22,531 tạ/ha, ở Việt Nam năm 2004 đạt 12,632 tạ/ha). Đặc biệt trong thời gian gần đây hạn hán thường xuyên xảy ra ở nhiều nơi đã gây ra nhiều thiệt hại cho ngành sản xuất đậu tương ở nước ta, chính vì vậy mà hàng năm nước ta phải nhập khoảng 400 – 500.000 tấn đậu tương để chế biến dầu ăn và thức ăn chăn nuôi [35]. Bởi vậy nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông sinh học của các giống đậu tương địa phương và tạo giống mới có năng suất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 http://www.lrc-tnu.edu.vn cao, thích nghi với điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau là yêu cầu cấp thiết đặt ra cho ngành chọn giống đậu tương. Bảng 1.1. Sản lượng đậu tương thế giới niên vụ 2006 – 2007 (Theo Oil World ) Đơn vị tính: triệu tấn Thế giới Mỹ Brazil Argentina Paraguay Bolivia Uruguay Trung Quốc Hàn Quốc Triều Tiên Nhật Bản Ấn Độ Canada Ukraine Liên bang Nga Indonesia Việt nam Thái lan Myanma Italy Pháp Nam Phi Nigeria Uganda Serbia and Montenegro Romania Iran Các nước khác 236,1 86,8 59,0 47,2 6,5 1,7 0,8 16,2 0,2 0,2 0,2 7,7 3,5 0,9 0,7 0,8 0,3 0,2 0,2 0,6 0,1 0,2 0,4 0,2 0,4 0,1 0,4 0,8 1.1.3. Thành phần hoá sinh hạt đậu tƣơng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.3.1. Protein dự trữ và thành phần axit amin Hàm lượng protein trong hạt chiếm từ 12-55%, thực tế cho thấy tuy kiểu gen và điều kiện canh tác làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein nhưng chúng vẫn lớn hơn hàm lượng protein của các loài thực vật khác [10]. Protein được dự trữ trong các bào quan và có chức năng duy nhất là cung cấp nguồn axit amin và nitơ cho quá trình nảy mầm của hạt, protein dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là albumin và globulin. Dựa vào hệ số lắng, người ta chia protein của hạt đậu tương thành 3 loại: 11S legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin. Những loại protein chính trong hạt đậu tương là: protein dự trữ (chiếm 70% tổng số protein), các enzim, các chất ức chế proteaza và lectin. Thành phần của protein gồm có albumin (9,5%), globulin tan trong nước (75,8%), globulin chỉ tan trong NaCl là 3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [8], [12]. Protein dự trữ trong hạt đậu tương bao gồm hai thành phần: Conglyxinin (7,9S ) và Glyxinin (12,2 S). Conglyxinin còn có tên gọi khác là Vixilin và có hệ số lắng là 7,9S. Đây là loại protein dự trữ phổ biến trong hạt. Conglyxinin tách biệt ra trong các thể protein và được dự trữ trong suốt quá trình phát triển của hạt. Nó được thuỷ phân sau khi hạt nảy mầm để cung cấp nguồn cacbon và nitơ cho hạt phát triển. Có thể nói, protein của cây họ đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng được coi là có chất lượng tốt nhất trong các loại protein của thực vật bởi vì chúng chứa tất cả các axit amin không thay thế và cần thiết cho cơ thể. Hơn nữa protein cuả cây họ đậu còn có hàm lượng lyzin rất cao so với protein từ các loại ngũ cốc khác. Tuy vậy, hàm lượng các axit amin chứa gốc SH như metionin, xystein vẫn còn thấp [10] 1.1.3.2. Lipit, vitamin và một số chất khác Lipit là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không có khả năng hoà tan trong nước, nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, benzen, toluen, ete dầu hoả… Lipit còn là thành phần quan trọng của màng sinh học, là nguồn năng lượng cung cấp cho cơ thể. Ở đậu tương hàm lượng lipit chiếm từ 12 25% khối lượng khô, chất lượng lipit của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Hạt đậu tương còn có các loại vitamin tan trong lipit, đặc biệt là vitamin E = 200 mg/100g lipit [10], ngoài ra trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 http://www.lrc-tnu.edu.vn hạt đậu tương còn chứa một số chất khác như hydrat cacbon, muối khoáng, axit nucleic, kích thích sinh trưởng [10]. Tóm lại, hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng rất cao, giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protein và lipit, trong đó hàm lượng protein dự trữ và chất lượng của chúng là yếu tố quyết định làm cho đậu tương trở thanh nguồn thực phẩm quan trọng cho người và gia súc, hạt đậu tương có thể chế biến ra 600 sản phẩm khác nhau, ngoài ra đậu tương còn dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt nhất là hạt đậu tương có màu đen. 1.2. ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.2.1. Ảnh hƣởng của hạn đối với cây trồng Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong cơ thể thực vật. Hạn là một trong những nguyên nhân chính ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng, tuỳ vào mức độ của hạn mà có ảnh hưởng khác nhau đến cây trồng nếu hạn nhẹ thì làm giảm năng suất, hạn nặng thì phá huỷ cây cối và mất mùa. Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể làm giảm thiểu mức độ tổn thương do mức độ thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn Khô hạn có thể phân biệt thành hai trường hợp: (1) Hiện tượng khô xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ở những giai đoạn nhất định trong chu kỳ sống của thực vật (hạt, tạo phấn, bào tử), hiện tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây. Đây là quá trình biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di truyền [18]. Trong giai đoạn hình thành hạt, tế bào bị mất nước, khả năng chịu hạn tăng lên. Khả năng này đạt cực đại ở thời kỳ hạt chín và có chiều hướng giảm dần khi hạt nảy mầm. Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt các điều kiện ngoại cảnh bất lợi khác như nhiệt độ, gió... (2) Hạn do tác động của môi trường chịu sự tác động của bên ngoài rất lớn, gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể dẫn đến huỷ hoại cây cối và mất mùa, hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu nước đến mức áp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 http://www.lrc-tnu.edu.vn suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước vào tế bào. Những yếu tố bất lợi này chính là các thành phần như thổ nhưỡng, nhiệt độ, gió nóng hay thời tiết và khí hậu. Có hai loại hạn do môi trường tác động là hạn đất và hạn không khí [1], [6]. Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến mức làm cho rễ cây không cạnh tranh được nước của đất. Sự tác động này được biểu hiện qua sự điều tiết các hoocmon giúp cho cây chống chịu được điều kiện cực đoan. Hạn không khí thường tác động chủ yếu lên các bộ phận bên trên mặt đất như lá, hoa. Hạn do tác động của môi trường dẫn đến hiện tượng mất nước trong cây ở các bộ phận mô, tế bào khác nhau. Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây. Nước là yếu tố giới hạn đối với cây trồng, vừa là sản phẩm khởi đầu vừa là sản phẩm trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh học. Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra, do vậy việc cung cấp nước cho cây trồng và hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là mục tiêu thường xuyên được quan tâm của ngành chọn giống. Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì càng ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hoá tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết. Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng hạn ảnh hưởng tới hai giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đó là giai đoạn cây non và giai đoạn ra hoa. Như vậy, ảnh hưởng cực đoan của hạn ở bất cứ ở giai đoạn sinh trưởng nào của cây trồng cũng ảnh hưởng đến các yếu tố cấu thành năng suất làm giảm năng suất của cây trồng. 1.2.2. Đặc tính chịu hạn và nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác. Đó chính là do trong hạt và cây đậu tương có hàm lượng protein và lipit rất cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500 - 530 kg nước. Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi đó ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [10]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 http://www.lrc-tnu.edu.vn Khi nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu về phương diện sinh lý và di truyền đã cho thấy rằng, các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Tính chịu hạn của cây đậu tương là tính trạng đa gen. Chúng có sự biểu hiện khác về sự phát triển của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia thành hai nhóm. - Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây. - Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của cây. Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn, đậu tương có thể dễ vượt qua hơn, còn ở những giai đoạn sau như giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp hạn thì sẽ dẫn đến năng suất giảm đáng kể. Với mục tiêu là tạo ra những giống đậu tương có năng suất cao và có khả năng chống chịu tốt, hàng loạt các tổ chức, mạng lưới nghiên cứu, cải tạo đậu tương quốc tế được thành lập: Chương trình nghiên cứu đậu tương Quốc tế ở Mỹ (INTSOY - International Soybean Program), Viện Nông nghiệp nghiệt đới ở Nigeria (IMA - Institute of Tropical Agriculture), Trung tâm phát triển rau màu Châu Á (AVRDC - Asian Vegetable Research Devlopment Center) ở Đài Loan, Viện nghiên cứu lúa quốc tế ở Philippin (IRRI - International Rice Research Institute). Trong đó, Trung tâm phát triển rau màu Châu á là nơi nghiên cứu và đánh giá tập đoàn gen đậu tương sớm nhất thế giới. Tại đây đã thiết lập hệ thống đánh giá đậu tương (ASET - AVRDC Soybean Evaluation Trial), kết quả đã chọn lọc thành công 24 giống đậu tương có năng suất cao, thích ứng với điều kiện trồng trọt và sinh thái của nhiều quốc gia. Công tác nghiên cứu giống đậu tương trên thế giới đang hướng tới những mục đích: thứ nhất là nhập nội giống sau đó chọn lọc, thử nghiệm với điều kiện của các vùng sinh thái khác nhau; thứ hai là khảo nghiệm các giống ở các vùng sinh thái khác nhau để tìm ra khả năng thích ứng cho các vùng sinh thái đó; thứ ba là tạo tính trạng mới bằng lai hữu tính và dùng các tác nhân vật lý, hoá học, chọn lọc ra những dòng, giống tốt nhất phục vụ cho sản xuất; thứ tư là xác định nguồn địa bàn trồng đậu tương trên thế giới và các nước trồng đậu tương đạt năng suất và sản lượng cao. Để đạt được những mục tiêu trên trong tình hình khí hậu trái Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn đất có xu hướng ngày càng nóng lên, thì vấn đề nghiên cứu khả năng chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh đặc biệt là tính chịu hạn phải được đặt lên hàng đầu. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có nhiều thành công khi nghiên cứu sâu hơn về tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương. Maitra và Cushman (1994) đã phân lập được cDNA của dehydrin từ lá đậu tương khi bị mất nước, ngoài ra các tác giả còn phân lập được cDNA của LEA nhóm D - 95 từ lá và rễ cây đậu tương khi bị hạn [30]. Nghiên cứu của porcel và cộng sự (2005), đã chỉ ra rằng, gen mã hoá protein dehydrin (LEA-DII) có vai trò với khả năng chống chịu của đậu tương. Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương, tiêu biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [6], nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103 [7], phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị Phương Liên và cs (1999) [7], [8], [9], nâng cao tính chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm của Chu Hoàng Mậu (2001) [11], [12]. 1.2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử của tính chịu hạn Để chống lại khô hạn thực vật có những biến đổi về sinh lý, sinh hoá nhằm không để mất nước. Có 2 cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trên môi trường thiếu nước là cơ chế tránh mất nước và cơ chế chịu mất nước. Cơ chế tránh mất nước có liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái của bộ rễ, bộ rễ dài khoẻ, mập có sức xuyên sẽ giúp cây hút được nước ở những vùng khô hạn, hay những vùng sâu hơn, xa hơn. Hạn tác động mạnh lên bộ rễ của cây gây ra các biểu hiện thích ứng tại vùng xảy ra các nhân tố cực đoan (stress) - LAS (local adaption symsptom) và mức độ cao hơn thì sẽ biểu hiện ra ở mức độ toàn bộ cơ thể. Thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng, khi ở giai đoạn cây non chịu tác động mạnh của hạn vì bộ rễ chưa phát triển đầy đủ còn yếu. Để giảm tối thiểu sự mất nước tế bào thực vật còn có khả năng tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua việc tích luỹ các chất hoà tan, các protein… như prolin, fluctose, mannitol, ion K+… Cơ chế chịu mất nước còn liên quan đến những thay đổi sinh hoá trong tế bào nhằm sinh tổng hợp ra các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm (ASTT) có liên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 http://www.lrc-tnu.edu.vn quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước của tế bào rễ cây đối với đất. Trong điều kiện ASTT tăng lên giúp cho tế bào có thể thu nhận được những phân tử nước ít ỏi từ đất. Bằng cơ chế như vậy, thực vật có thể vượt qua tình trạng hạn cục bộ [1]. Khi tế bào mất nước, các chất hoà tan trong cơ thể thực vật sẽ được tích luỹ dần trong tế bào chất nhằm chống lại việc giảm tiềm năng nước và tăng khả năng giữ nước của nguyên sinh chất. Hầu hết các loại chất hữu cơ hoà tan có tác dụng điều chỉnh ASTT được sinh ra ngay trong quá trình đồng hoá và trao đổi chất. Những thay đổi hoá sinh khác do hạn gây ra cũng đã được nghiên cứu, chẳng hạn như giảm cố định CO2, giảm tổng hợp protein và axit nucleic, tăng hoạt tính ribonucleaza, làm tăng hàm lượng ABA và prolin, tăng nồng độ các chất hoà tan như betaine [1], [20]. Khả năng chịu mất nước dựa trên những thay đổi tinh vi trong chu trình chuyển hoá của tế bào, dẫn đến sự xuất hiện và tích luỹ các chất hoà tan, protein, axit amin đặc hiệu. Hiện tượng này xảy ra rất nhanh khi tế bào bị mất nước. Các chất đó bao gồm : ion K+, axit amin prolin, estoin, các chất đường như sucaroza, manitol. Ngoài ra glycine betaine và alanine betaine cũng tham gia vào quá trình này. Các chất điều chỉnh ASTT có 2 chức năng: (1) Giữ và lấy nước vào tế bào và ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ (2) Thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hoá, tương tác với lipit hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein [1], [7]. Một số công trình nghiên cứu về cơ chế chịu hạn của cây trồng đã cho thấy vai trò của một số chất đối với khả năng tăng cường tính chống chịu ở điều kiện cực đoan [1], [3], [13], [16], [18]. Hướng nghiên cứu tính chịu hạn thông qua hàm lượng đường tan và hoạt độ của - amylase, protease cũng được nhiều tác giả quan tâm. Đường tan ở thực vật là một trong những chất tham gia điều chỉnh ASTT trong tế bào, sự gia tăng hàm lượng đường tan làm tăng khả năng chịu hạn ở cây trồng . Đỗ Thị Dương (2001) nghiên cứu một số đặc điểm hoá sinh của 5 giống lúa cạn đã cho thấy khả năng chịu hạn có tương quan thuận với hàm lượng đường tan và protein. Nguyễn Thị Sâm (2002) và Ngô Thị Liêm (2006) khi nghiên cứu tính trạng hình thái hoá sinh hạt của một số giống lạc cũng nhận thấy có mối tương quan giữa hàm lượng đường, protein, và hoạt độ enzyme với khả năng chịu hạn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 http://www.lrc-tnu.edu.vn Enzyme là chất xúc tác sinh học, có hiệu quả cao. Mỗi loại enzyme xúc tác cho một quá trình chuyển hoá theo một kiểu phản ứng nhất định. Trần Thị Phương Liên (1999) đã nhận xét rằng, protease trong quá trình nảy mầm của hạt ở tất cả các giống đậu tương nghiên cứu rất đa dạng, có hoạt tính cao, có khả năng phân giải hoàn toàn protein dự trữ tạo nguyên liệu để tổng hợp protein cho cơ thể mới . Xử lý nhiệt độ cao chỉ ảnh hưởng đến hoạt tính protease ở một số giống chịu hạn, không ảnh hưởng đến các giống chịu nóng, còn ở điều kiện áp suất thẩm thấu cao đều ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này ở tất cả các giống. Nguyễn Thị Kim Dung (2003) nghiên cứu sự biến động hoạt độ enzyme protease ở giai đoạn hạt nảy mầm đã rút ra kết luận, protease trong giai đoạn hạt nảy mầm có xu hướng tăng từ 1 đến 5 ngày tuổi sau đó có xu hướng giảm dần ở 7 và 9 ngày tuổi. Cũng nghiên cứu về loại enzyme này Nguyễn Thị Hoa Lan (2004) lại cho rằng giống có hàm lượng protease cao thì hoạt độ enzyme protease cũng cao, giống có hàm lượng protein thấp thì có hoạt độ protease thấp, có thể tồn tại mối tương quan giữa hàm lượng protein và hoạt độ enzyme protease. Khi nghiên cứu về α – amylase các tác giả cho rằng , trong giai đoạn nảy mầm, - amylase có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá các chất để cung cấp năng lượng cho quá trình nảy mầm của hạt. Enzyme này tham gia vào quá trình thuỷ phân tinh bột thành dextrin và mantose. Sự gia tăng hoạt độ α- amylase làm tăng hàm lượng đường tan trong cây vì vậy làm tăng ASTT trong tế bào nên khả năng chịu hạn của cây trồng tăng lên. Nghiên cứu về tính chịu hạn ở thực vật theo cơ chế chịu mất nước, các nhà khoa học nhận thấy rằng các nhóm chất liên quan đến việc bảo vệ cấu trúc tế bào và điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào có vai trò đặc biệt quan trọng. Những nhóm chất đó bao gồm protein sốc nhiệt, môi giới phân tử, LEA... Protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) có hầu hết ở các loại thực vật như lúa mì, lúa mạch, lúa gạo, ngô, đậu, hành tỏi… chúng chiếm 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này. Ngoài ra HSP còn tìm thấy ở vi khuẩn và động vật bậc cao. HSP được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực đoan như hạn, nhiệt độ cao, độ muối cao. Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá huỷ do stress nóng và mở rộng giá trị ngưỡng với sự chống chịu nhiệt độ cao. Trong các tế bào thực vật HSP tế bào chất tập trung thành các hạt sốc nhiệt (HSG-Heat Shock Granules). Người ta cho rằng các HSP gắn kết trên các ARN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 http://www.lrc-tnu.edu.vn polymease để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mARN trong quá trình bị stress nóng. Sau sốc nóng các hạt này phân tán và liên kết dày đặc với các ribôxôm hoạt động sinh tổng hợp protein [8]. HSP có thể chia thành 6 nhóm dựa trên khối lượng phân tử khác nhau: HSP 110, HSP 100, HSP 90, HSP 70, HSP 60, HSP 8,5. Trong đó nhóm HSP 70 và HSP 60 có đại diện của chất MGPT, HSP 8,5 (Ubiquitin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhưng không phải là MGPT, chúng có hoạt tính proteaza và thực hiện chức năng phân giải các protein không có hoạt tính enzym, ngăn chặn các protein này gây độc cho tế bào. Ubiquitin có MW thấp, ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, nên chúng có vai trò tự sửa chữa khi gặp các yếu tố cực đoan, nhất là nhiệt độ cao [8]. Môi giới phân tử (MGPT) là một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau, nhưng chúng đều có chức năng tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein trong tế bào. Phần lớn các chất MGPT có hoạt tính ATP-ase, có chức năng: (1) Giữ ổn định chuỗi polypeptit khi đang tổng hợp và tạo cấu trúc không gian đúng cho chúng, (2) Tạo lại cấu trúc không gian của protein sau khi vận chuyển qua màng tế bào, (3) Lắp ráp các chuỗi polipeptit vào phức để tạo cấu trúc bậc 4, (4) MGPT được tăng cường nhờ quá trình tổng hợp trong điều kiện cực đoan do nhu cầu cấp thiết của tế bào, nhất là sốc nhiệt. MGPT có thể chia thành một số nhóm như sau: HSP 70 là nhóm MGPT có hoạt tính ATP-ase và có tính bảo thủ cao. Trong điều kiện cực đoan HSP có thể ngăn chặn sự co cụm và kết tụ protein. HSP 60 (chaperonin) là loại protein cấu tạo từ các tiểu đơn vị có khối lượng 60 kDa và cũng có hoạt tính ATP-ase. Các nhóm HSP 100, HSP 90 đều có tính bảo thủ cao và có hoạt tính ATP-ase. Một số tìm thấy trong tế bào bình thường, nhưng phần lớn chúng sinh ra khi gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như hạn, nóng, lạnh. Chức năng chính của chúng là ngăn chặn sự co cụm của protein và tái hoạt hoá các protein biến tính [8]. Protein LEA (Late embryogenesis abudant protein-LEA) là một trong những nhóm protein quan trọng liên quan đến điều kiện mất nước của tế bào, nhóm gen mã hoá loại protein LEA còn đóng vai trò quan trọng trong sự chịu khô hạn của hạt. Khi hiện tượng mất nước xảy ra, ARN của chúng xuất hiện trong hạt đang hình thành và dần trở thành một lượng lớn gồm nhiều loại ARN thông tin khác nhau trong hạt chín và bị phân giải hết trong quá trình nảy mầm. Ngoài ra LEA không Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 http://www.lrc-tnu.edu.vn những điều chỉnh quá trình mất nước sinh lý khi hạt chín, mà còn hạn chế sự mất nước bắt buộc do các điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra [8], [9] . LEA được chia thành các nhóm sau: nhóm 2-D19, nhóm 2-D11 (còn gọi là dehydrin), nhóm 3-D7; nhóm 4-D113; nhóm 5-D29; nhóm 6 -D95 [8] . Khi điều kiện mất nước xảy ra, protein LEA được tổng hợp với số lượng lớn, trong đó dehydrin có thể chiếm tới 1% tổng số protein hoà tan của hạt [8]. Ngày nay người ta phân lập được 30 gen khác nhau thuộc thành viên của các nhóm gen dehydrin ở những cây trồng khác nhau [8]. Gen mã hoá protein dehydrin ở đậu tương đã được nghiên cứu tại một số phòng thí nghiệm trên thế giới và cho đến nay đã có một số trình tự gen dehydrin đậu tương và một số thực vật khác đã được công bố trên ngân hàng trình tự gen quốc tế . Axit amin proline có vai trò quan trọng trong quá trình điều hoà áp suất thẩm thấu (ASTT) của tế bào, đồng thời nó còn là một axit amin ưa nước có khả năng giữ và lấy nước cho tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, tương tác với protein màng và lipit màng, ngăn chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein khác. Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy khi cây trồng gặp hạn thì cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng hợp prolin [31, [29], [16]. Theo thông báo của Chen và Muranta (2002) [19]. sức chống chịu của thực vật tăng lên khi được chuyển các gen mã hoá enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp prolin trong tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tích luỹ prolin có thể tăng từ 10 đến 100 lần ở thực vật dưới tác động của ASTT. Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Cường và cs cho rằng sự gia tăng hàm lượng prolin của các giống lúa nghiên cứu có mối tương quan thuận với tính chống chịu lạnh, mặn và hạn [3]. 1.3. GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP PROLINE Soulages và cs (2003) [31] đã chứng minh ngoài vai trò tăng cường khả năng chịu hạn thì chuỗi axit amin L-prolin nhóm II còn có khả năng chống lại tác động bất lợi của nhiệt độ thấp đối với cây đậu tương. Sự gia tăng hàm lượng proline ở thực vật khi gặp phải những điều kiện bất lợi như do nước, do mặn có liên quan đến các gen tổng hợp proline và các gen điều khiển quá trình vận chuyển proline. Khi môi trường đất thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của tế bào không thể cạnh tranh được với áp suất của đất thì các gen tham gia vào quá trình tổng hợp proline sẽ được hoạt hoá xúc tiến việc tổng hợp proline Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 http://www.lrc-tnu.edu.vn và vận chuyển proline đến các mô, tế bào có nhu cầu proline. Proline trong tế bào được tổng hợp từ axit glutamic qua ba phản ứng với sự xúc tác của hai enzyme là detal - pyrroline - 5- carboxylate synthetase (P5CS) và detal - pyrroline - 5 carboxylate - reductase (P5CR). GSA P5C Không có stress Glutamate Proline Stress P5CR P5C P5CS GSA Hình 1 .1. Sơ đồ mô tả quá trình biến đổi của proline trong tế bào Sơ đồ trên cho thấy khi cây ở tình trạng bình thường thì proline trong cây sẽ được chuyển hóa thành glutamate. Còn khi cây rơi vào tình trạng thiếu nước do hạn thì glutamate sẽ được biến đổi thành proline qua ba phản ứng . Đầu tiên là enzyme P5CS sẽ xúc tác cho phản ứng biến đổi glutamate thành GSA rồi từ GSA biến đổi thành P5C, từ P5C sẽ chuyển hoá thành proline dưới sự xúc tác của enzyme P5CR. Như vậy trong quá trình tổng hợp proline hai enzyme giữ vai trò quyết định là P5CS và P5CR. Enzyme P5CS là enzyme đầu tiên xúc tác cho phản ứng biến đổi glutamate thành proline. Theo nghiên cứu của Verma DPS và cs (1992) [33] và Yoshiba (1995) [36], khi cây rơi vào tình trạng thiếu nước do hạn hoặc do nồng độ muối cao đến một mức nhất định, thì gen mã hoá cho enzyme P5CS sẽ được biểu hiện mạnh, làm tăng hoạt tính của enzyme P5CS xúc tác cho phản ứng biến đổi glutamic thành proline. Nên có thể nói gen mã hoá cho enzyme P5CS ( gen P5CS) là nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng hợp proline ở thực vật trong điều kiện bất lợi do hạn và do mặn gây nên [33], [32]. Đã có nhiều công trình công bố liên quan đến gen P5CS [31], [33], [34], [36] . Gen P5CS đã được tìm ra ở một số loài thực vật do Kreuger, Treichel (1986) [26]. và Larosa (1991) [27].. Rayapati (1989) đã phát hiện ra enzyme này ở trong lục lạp của cây đậu (pea). Hiện nay trên ngân hàng gen quốc tế có một số trình tự nucleotit của gen P5CS được công bố. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 http://www.lrc-tnu.edu.vn Na và cs (2007) của Trung Quốc đã phân lập được mARN của gen P5CS ở Sacchrum arundinaceum với kích thước 2563bp. Trên đối tượng Nasonia vitripenis Igarashi, Yoshiba và cs (2007) của Nhật Bản đã phân lập được mARN của gen P5CS với kích thước 2677bp. Huang và cs (2007) của Trung Quốc đã phân lập được mARN của gen P5CS ở đối tượng Saccharum officinarum với kích thước 2151bp và đoạn ADN chứa gen P5CS dài 2016bp. Trên đối tượng Arabidopsis thaliana đã có nhiều tác giả nghiên cứu về gen này. Năm 2006 nhóm nghiên cứu gồm Strizhov và cộng sự (cs) của Trường Đại học Columbia đã phân lập được gen P5CSB từ phân tử ADN có kích thước 5789bp trong cấu trúc của gen này có 2512bp intron và 3277bp exon. Nhóm tác giả Zhang,Y.và Li,C (2006) của Trung Quốc cũng đã phân lập được đoạn gen P5CS từ mARN của Ngô với kích thước 2043bp. Ở đậu tương năm 2004 nhóm nghiên cứu gồm Huang và cs của Trường Đại học tự nhiên và kỹ thuật Pingtung Đài Loan đã phân lập được gen P5CS từ mARN với kích thước 2148bp [35]. Theo Schwacke (1999) ngoài các gen tham gia vào quá trình tổng hợp proline sự gia tăng hàm lượng proline của cây trong điều kiện hạn do thiếu nước còn liên quan đến các gen điều khiển sự vận chuyển proline. Người ta đã phân lập được 3 gen vận chuyển proline ở cà chua là LeProT1 , LeProT2 và LeProT3 trong số 3 gen này thì gen LeProT1 được nghiên cứu nhiều nhất, người ta thấy rằng gen này được biểu hiện mạnh trong quá trình hình thành quả và hạt, ngoài vai trò vận chuyển proline gen này còn vận chuyển cả glycine betain tới các mô để làm tăng áp suất thẩm thấu của các mô , tế bào trong điều kiện thiếu nước. Hai gen LeProT2 và LeProT3 còn được nghiên cứu ít chưa biết hết được chức năng, nhưng chúng được biết đến là những gen tham gia vận chuyển các chất hữu cơ trong quá trình gia hoa và tạo quả ở thực vật trong điều kiện thiếu nước do hạn hoặc do muối. Theo Rentch (1996) đã phân lập được 2 gen vận chuyển proline ở cây Arabidopsis Thaliana là gen AtProT1 và AtProT2, gen AtProT1 được biểu hiện liên tục ở mức thấp trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển còn gen AtProT2 cũng được biểu hiện trong điều kiện bình thường nhưng nó được biểu hiện mãnh liệt trong điều kiện cây gặp phải tình trạng stress nước và muối [35]. Người ta cũng đã phát hiện ra gen vận chuyển proline ở lúa và thuốc lá [27], [37]. Sự phát hiện ra các gen liên quan đến việc tổng hợp và vận chuyển proline có ý nghĩa to lớn trong việc nghiên cứu tính chịu hạn ở thực vật, điều này mở ra triển vọng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 http://www.lrc-tnu.edu.vn cho công tác chọn giống tạo ra những cây trồng chuyển gen có khả năng chịu hạn và chịu muối bằng việc chuyển gen tổng hợp proline và gen vận chuyển proline. Người ta đã thành công trong việc chuyển gen tổng hợp proline ở lúa, cà chua , thuốc lá và đậu tương kết quả cho thấy khả năng chịu hạn của các giống này đều tăng lên khi được chuyển các gen này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU Sử dụng 6 giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng làm nguyên liệu nghiên cứu đó là: Cao Bằng 4, Quảng Hoà – Cao Bằng, Vàng Cao Bằng, Hạ Lang Cao Bằng, Đông Khê – Cao Bằng, Trà Lĩnh – Cao Bằng và sử dụng giống đậu tương DT84 làm đối chứng (bảng 2.1). Bảng 2.1. Nguồn gốc của các giống đậu tương Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc Cao Bằng 4 CB4 Giống địa phương - Cao Bằng Hạ Lang HL Giống địa phương Hạ Lang - Cao Bằng Quảng Hoà QH Giống địa phương Quảng Hoà - Cao Bằng Vàng Cao Bằng VCB Giống địa phương - Cao Bằng Trà Lĩnh TL Giống địa phương Trà Lĩnh – Cao Bằng Đông Khê ĐK Giống địa phương Đông Khê – Cao Bằng DT84 DT84 Giống đột biến từ dòng 8 - 33 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hoá chất Sử dụng các loại hoá chất mua của các hãng Anh, Đức, Mỹ, Trung Quốc...cho các thí nghiệm phân tích hoá sinh và sinh học học phân tử. Bis acrylamid, Tris, EDTA (Ethylendiamine tetra acetic acid), glycin, CTAB (Cetylmethylammonium bromide), Taq DNA polymeraza (hãng Bio - Lad), ( mecaptoethanol, phenol, chloroform: isoamyl alcohol (24:1), CH3COONa, ethanol (70%, 100%), dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), agarose, ethidium bromide (EtBr), toluene, axit citric, NaOH, NaCl, và nhiều hoá chất thông dụng khác. 2.2.2. Thiết bị Các thiết bị chính được sử dụng để phân tích hoá sinh và sinh học phân tử gồm: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 http://www.lrc-tnu.edu.vn - Máy quang phổ Uvvis Cintra 40 (Australia) - Bộ nguồn điện di PewerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ) - Máy phân tích axit amin tự động - HP amino Quan SeriesII (Hewlett Parkard, Mỹ) - Bể ổn nhiệt (Techne, OSI) - Pipetman các loại (Gilson) - Tủ sấy ( Anh) - Cân điện tử (Đức, Thuỵ Sỹ) - Tủ lạnh sâu – 850C ( Sanyo, Nhật Bản) - Nồi khử trùng (ToMy- Nhật) - Máy PCR (AB System) - Máy soi ADN (Mini - transllumminator. Bio-Rad, Mỹ) - Máy li tâm lạnh (Đức) - Máy khuấy trộn Voltex - Máy đo pH (Metter Toledo) 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Di truyền học và Công nghệ gen Khoa Sinh- KTNN, Trường Đại học Sư phạm -Đại học Thái Nguyên. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nhóm phƣơng pháp sinh lý, hoá sinh 2.3.1.1. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non được tiến hành theo Lê Trần Bình (1998) [1] và của Đinh Thị Phòng (2001) [13] - Hạt đậu tương nảy mầm gieo vào chậu (kích thước 30cm x 30cm) chứa cát vàng đã rửa sạch, mỗi chậu trồng 40 cây, mỗi giống trồng 3 chậu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trong điều kiện và chế độ chăm sóc như nhau. Thời gian đầu tưới nước cho đủ ẩm, khi cây đậu tương được 3 lá tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 http://www.lrc-tnu.edu.vn năng chịu hạn của các giống đậu tương bằng cách xác định tỷ lệ thiệt hại và chỉ số hạn tương đối. - Xác định tỷ lệ cây sống sót (%), khả năng giữ nước (%) ở giai đoạn cây lạc 3 lá dưới tác động của hạn. Tỷ lệ cây sống sót = Số cây sống Tổng số cây xử lý 100 (%) - Xác định khả năng giữ nước của đậu tương 3 lá trong điều kiện hạn theo công thức: W  W ft W fc (%) Trong đó: W(%): Khả năng giữ nước của cây sau khi xử lý bởi hạn Wft(g): khối lượng tươi của cây sau khi xử lý bởi hạn Wfc(g): Khối lượng tươi của cây không xử lý - Tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra được tính theo công thức: a Trong đó:  ( N b) o NC (%) a: Tỷ lệ thiệt hạn do hạn gây ra (%); b: trị số thiệt hại của mỗi cấp; c: trị số thiệt hại của cấp cao nhất; No: số cây của mỗi cấp thiệt hại; N: tổng số cây xử lý Các trị số: Số cây chết: trị số 3 Số cây héo: trị số 1 Số cây không bị ảnh hưởng: trị số 0. - Chỉ số chịu hạn tương đối được xác định dựa trên 15 chỉ tiêu phân tích và được tính theo công thức: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 http://www.lrc-tnu.edu.vn S 1 sin  (ab  bc  cd  ...  pa) 2 Trong đó: S: Chỉ số chịu hạn tương đối a, b, c, … Là các chỉ tiêu theo dõi α: Là góc tạo bởi 2 trục mang trị số liền nhau α = 3600/15 15: Là số chỉ tiêu theo dõi Xác định một số chỉ tiêu khác chịu tác động của hạn - Chiều dài rễ: Mỗi giống lấy 30 cây có rễ dài nhất. Đo chiều dài rễ của mỗi cây rồi tính giá trị trung bình. - Khối lượng tươi của rễ và thân lá: Cắt riêng rễ và thân lá, dùng giấy thấm khô, rồi cân trọng lượng tươi trên cân phân tích. - Xác định khối lượng khô của rễ và thân lá: Các mẫu được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1000C rồi xác định khối lượng khô tuyệt đối. - Xác định tỉ số chịu hạn T: Tỉ số khối lượng của rễ/ thân lá khô T = Wr/Wtl Wr: Khối lượng khô của rễ (mg) Wtl: Khối lượng khô của thân lá (mg) 2.3.1.2. Xác định hàm lƣợng proline Khi cây đậu tương được 3 lá tiến hành thu mẫu và xử lý hạn, tiếp tục thu mẫu ở 5 ngày hạn và 7 ngày hạn để chiết rút và xác định hàm lượng prolin. Hàm lượng prolin của thân, lá, rễ được xác định theo phương pháp của Bates và cs (1973) có cải tiến [17] gồm các bước sau: (1) Nghiền 0,5g mẫu trong cối và chày sứ. (2) Thêm 10ml dung dịch axit sunfosalicylic 3%, li tâm 7000 vòng/phút, trong 20 phút và lọc qua giấy lọc Whatman. (3) Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm 20ml, bổ sung 2ml axit axetic và 2ml dung dịch axit ninhydrin (thành phần của dung dịch này gồm có ninhydrin, axit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 http://www.lrc-tnu.edu.vn axetic, axit photphoric 6M), ủ trong nước ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ, sau đó ủ trong đá 5 phút. (4) Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều và lấy phần dịch có màu hồng ở trên do OD ở bước sóng 520nm. (5) Hàm lượng proline được máy xác định theo đồ thị chuẩn. 2.3.1.3. Xác định hoạt độ của  - amylase Hoạt độ của  - amylase được xác định theo phương pháp Heilken (1956) mô tả trong tài liệu của Nguyễn Lân Dũng [4]. - Nguyên tắc: Dựa vào tính chất hoà tan của enzyme  - amylase trong dung dịch đệm photphat 0,2 M pH = 6,8. - Chuẩn bị mẫu: Hạt đậu tương ủ trong dung dịch MS 10% chứa 7% sorbitol ở giai đoạn hạt nảy mầm 1, 3, 5, 7 và 9 ngày tuổi. Hạt nảy mầm bóc vỏ lụa, cân khối lượng, nghiền trong 1,8ml dung dịch đệm photphat citrat pH = 6,8 li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm. Thí nghiệm phân tích hoạt độ  - amylase được tiến hành trên ống thí nghiệm và ống kiểm tra, đo trên máy quang phổ ở bước sóng 560nm. - Cách tính: Đơn vị hoạt độ (ĐVHĐ) của  - amylase chính là lượng mg tinh bột bị thuỷ phân trong thời gian 30 phút ở 30oC. Công thức tính đơn vị hoạt độ của  - amylase là: ĐVHĐ/mg = (C2  C1 ).HSPL h Trong đó: C1: lượng tinh bột còn lại của mẫu thí nghiệm C2: lượng tinh bột còn lại của mẫu kiểm tra HSPL: hệ số pha loãng h: khối lượng mẫu (mg) Phân tích định tính hoạt độ của  - amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, thành phần hỗn hợp dịch gồm: Thạch agar 0,8%, tinh bột 1%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.1.4. Xác định hàm lƣợng đƣờng tan - Xác định hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm có bổ sung 7% sorbitol theo phương pháp vi phân tích được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs [2]. - Nguyên tắc: trong môi trường kiềm, đường khử ferixianua kali thành kali ferixianua với sự có mặt của gelatin, kali ferixianua kết hợp với sắt sunfat tạo thành phức chất màu xanh bền. Cân khối lượng mẫu, nghiền nhỏ, chiết bằng nước cất, li tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC. Dịch chiết đường được giữ lại để nghiên cứu. Hàm lượng đường tan được đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 585nm. - Tính kết quả: X  (a.b.HSPL) m (%) Trong đó: X: hàm lượng đường tan (%) a: nồng độ thu được khi đó trên máy (mg/ml) b: số ml dịch chiết HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg) 2.3.1.5. Định lƣợng protein Protein tan tổng số được phân tích theo phương pháp Lowry [2]. Cân 0,05g mẫu đã nghiền nhỏ, sấy khô cho vào tube, mỗi mẫu lặp lại 3 lần. Cho vào mỗi tube 1,5ml dung dịch đệm , đảo đều bằng máy voltex, để trong tủ lạnh 4oC qua đêm, đem ly tâm thu dịch ở 12000 vòng/phút trong 20 phút rồi thu lấy dịch. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần . Dịch chiết được định mức lên 5 ml và đo hấp thụ quang phổ trên máy quang phổ UV ở bước sóng 750 nm với thuốc thử foling. Hàm lượng protein được tính theo công thức như mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu [2]. 2.3.1.6. Xác định thành phần axit amin Hàm lượng axit amin được xác định trên máy HP - Amino Quant sử dụng ortho-phtalandehyt tạo dẫn xuất đối với các axit amin bậc 1 và 9 - fluoreryl - metyl - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 http://www.lrc-tnu.edu.vn cloroformat đối với các axit amin bậc 2. Mẫu được xử lý theo phương pháp thuỷ phân pha lỏng theo hướng dẫn sử dụng máy phân tích axit amin tự động 2.3.1.7. Xác định lipit tổng số Nguyên tắc: Dựa vào tính chất hoà tan của lipit trong dung môi hữu cơ (petroleum ether) để chiết rút [12]. Mẫu đem sấy khô, bóc vỏ, nghiền mịn. Cân 0,05g mẫu cho vào mỗi eppendorf (epp) (3 epp/ mẫu). Tiếp theo, cho 1,5ml petroleum ether vào mỗi epp, lắc đảo đều, để ngăn lạnh 4oC trong 24 giờ, đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút, bỏ dịch, lặp lại thí nghiệm 3 lần. Sau đó, sấy khô mẫu còn lại trong epp ở 700C đến khi khối lượng không đổi rồi cân mẫu. Hàm lượng lipit được tính theo công thức Hàm lượng lipit = A B (%) A A: Khối lượng mẫu ban đầu B: Khối lượng mẫu sau khi loại lipit 2.3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.3.2.1. Phƣơng pháp tách ADN từ mầm đậu tƣơng ADN tổng số được tách chiết từ mầm đậu tương. Khi mầm đậu tương dài khoảng 1,5cm, tách riêng lấy phần thân mầm rồi bảo quản trong tủ lạnh sâu (-850C). Trình tự tiến hành tách chiết ADN ở mầm đậu tương được tiến hành theo Foolad và cs (1995) [21] gồm những khâu chính như sau như sau: (1) Nghiền trong nitơ lỏng khoảng 200mg mầm đậu tương thành dạng bột mịn. Sau đó, mẫu được hoà trong đệm chiết (Tris HCl 0,1M pH 8; EDTA 0,5M pH 8; NaCl 5M; Mecaptoethanol 0,14M; CTAB 4%) ủ 650C trong 90 phút để chiết ADN. (2) Protein và tạp chất được loại bỏ bằng cách xử lý dịch chiết bằng một thể tích tương đương hỗn hợp dung dịch phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 25: 24: 1). Ly tâm để thu lấy pha trên và tiếp theo là xử lý pha đó bằng dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24: 1). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC rồi thu dịch ở pha trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 http://www.lrc-tnu.edu.vn (3) ADN trong dung dịch được tủa bằng isopropanol mix nhẹ và để trên đá qua đêm chờ có tủa trắng, sau đó ly tâm thu tủa. ADN được rửa lại bằng cồn tuyệt đối hai lần và được làm khô, hoà tan ADN trong nước khử ion . Điện di kiểm tra ADN thu được trên gel agarose 0,8%. 2.3.2.2. Phƣơng pháp kiểm tra ADN bằng quang phổ Nguyên tắc của phương pháp đo quang phổ là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm và 280nm của các bazơ purin và pirimidin. Một đơn vị OD260nm (Optical Density260nm) tương ứng với nồng độ là 50 µg/ml cho dung dịch ADN sợi đôi. Do đó, nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức CADN (µg/ml) = OD260nm x 50 x độ pha loãng Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, có thể đo thêm giá trị OD ở 280nm (OD280nm). Dung dịch axit nucleic được xem là sạch (không lẫn protein) khi tỉ số OD260nm/ OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0. 2.3.2.3. Phƣơng pháp điện di ADN Điện di ADN được tiến hành trên bộ điện di của hãng Bio – Rad sử dụng gel agarose 0,8%. Dung dịch dùng làm đệm để chạy điện di là TBE (Tris – borat 0.045M; EDTA 0.001M; pH 8.0). Điện di chạy với hiệu điện thế là 80V sau đó ADN được nhuộm bằng ethidium brommid, soi dưới đèn UV và chụp ảnh. 2.3.2.4. Phƣơng pháp nhân bản đoạn ADN thuộc gen mã hoá cho P5CS Đoạn ADN thuộc gen P5CS của đậu tương được khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi Pro Soy2R, Pro Soy2F được thiết kế dựa trên trình tự cDNA thuộc gen P5CS ở đậu tương đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế và được tổng hợp tại hãng Invitrogen.Trình tự cặp mồi như sau Pro Soy 2R: 5‟ - TCA TAT AGA AAG GTC TCT GTG AG – 3 „ Pro Soy 2F: 5‟ - AGA GCA GCT AGG GAC TGT TCC AG – 3‟ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ Lượng (µl) Nước khử ion vô trùng 8,5 Dung dịch đệm cho Taq-polymerase 10 lần 5 dNTP 10mM 2 Pro Soy2F 10pmol/µl 2 Pro Soy2R 10pmol/µl 2 ADN khuôn 100ng/ µl 5 5U/ µl 0,5 Taq – polymerase Tổng thể tích 25 µl Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR được tiến hành theo chương trình Bước 1: 940C 3 phút Bước 2: 940C 1 phút Bước 3: 560C 1 phút Bước 4: 720C 1phút 30 giây Bước 5: 720C 8 phút Bước 6: Lưu giữ ở 40C Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 30 chu kỳ. Sản phảm PCR được điện di trên gel agarose 1% 2.3.3. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định trị số thống kê như trung bình mẫu (x ) , phương sai (2), và sai số trung bình mẫu ( S x ) với n  30,  = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [15]. Xác định khoảng cách và thiết lập mối quan hệ giữa các giống đậu tương bằng chương trình NTSYS pc 2.02i. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KHỐI LƢỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lƣợng 1000 hạt Bảng 3.1 trình bày đặc điểm hình thái của 7 giống đậu tương nghiên cứu như: Hình dạng hạt, màu sắc hạt, màu sắc rốn hạt, khối lượng 1000 hạt và kích thước hạt. Màu sắc hạt gồm màu vàng, vàng nhạt, xanh, đen nhưng màu vàng là phổ biến hơn cả. Màu sắc rốn hạt gồm có màu đen, nâu, nâu nhạt, đây là một đặc tính quan trọng trong việc giám định giống. Hình dạng hạt là một tính trạng tương đối ổn định, các giống đậu tương nghiên cứu đều có hình trứng, hình oval với mức độ phồng, dẹp khác nhau. Bảng 3.1. Hình dạng, kích thước, màu sắc, khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương nghiên cứu STT Giống Kích thước hạt Màu sắc hạt Màu sắc rốn hạt Hình dạng hạt Khối lượng 1000hạt(g) Dài(mm) Rộng(mm) 1 CB4 Đen Đen Trứng 147,31 ± 0,09 5,10 ± 0,10 4,35 ± 0,08 2 HL Xanh Nâu Trứng 123,45 ± 0,09 5,05 ± 0,11 3,25 ± 0,07 3 QH Vàng Đen Ôvan 87,58 ± 0,09 4,35 ± 0,05 3,10 ± 0,06 4 VCB Vàng nhạt Nâu nhạt Ôvan 141,46 ± 0,09 5,09 ± 0,05 4,25 ± 0,04 5 TL Vàng Nâu Ôvan 121,35 ± 0,06 4,95 ± 0,09 3,85 ± 0,06 6 ĐK Vàng nhạt Nâu đen Ôvan 117,51 ± 0,06 4,85 ± 0,09 3,50 ± 0,06 7 DT84 Vàng Nâu Ôvan 165,14 ± 0,08 7,70 ± 0,05 6,70 ± 0,04 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng có đặc điểm hình thái rất đa dạng và phong phú, có những giống có đặc điểm rất khác với giống phổ biến, nhất là giống Cao Bằng 4 có màu sắc hạt đen giống như hạt đỗ đen. Hình 3.1. Hạt của 7 giống đậu tương nghiên cứu 1 – HL; 2 – CB4; 3 – VCB; 4 – QH; 5 –TL; 6 – ĐK; 7 - DT84 Khối lượng hạt là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá năng suất của giống.Các giống đậu tương nghiên cứu có kích thước và khối lượng hạt hoàn toàn khác nhau. Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy giống Cao Bằng 4 là giống có khối lượng 1000 hạt cao nhất (147.31g ± 0.09), và có kích thước hạt lớn nhất (dài/rộng = 5,10/ 4,35) trong số các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng, giống có khối lượng 1000 hạt thấp nhất là Quảng Hoà (87.58g ± 0.09) và kích thước hạt cũng nhỏ nhất (dài/rộng = 4,35/ 3,10). Khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương nghiên cứu được sắp xếp theo thứ tự từ cao đến thấp như sau: DT84 > Cao Bằng4 > Vàng Cao Bằng> Hạ Lang Cao Bằng > Trà Lĩnh Cao Bằng > Đông Khê Cao Bằng > Quảng Hoà Cao Bằng. 3.1.2. Hàm lƣợng protein và lipit trong hạt của các giống đậu tƣơng nghiên cứu Thành phần các chất dinh dưỡng trong hạt đậu tương gồm: Lipit, protein, hydrat cacbon và các chất khoáng, vitamin nhưng có hai thành phần quan trọng nhất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 http://www.lrc-tnu.edu.vn được sử dụng để đánh giá chất lượng hạt trên phương diện hoá sinh là hàm lượng protein và hàm lượng lipit. Bảng 3.2 thể hiện kết quả phân tích hàm lượng protein và lipit của 7 giống đậu tương. Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipit của 7 giống đậu tương Giống Hàm lượng protein (% KL khô ) Hàm lượng lipit (% KL khô) CB4 33,89 ± 0,08 15,24 ± 0,03 HL 32,56 ± 0,05 18,89 ± 0,04 QH 34,20 ± 0,07 17,05 ± 0,04 VCB 34,78 ± 0,06 15,16 ± 0,05 TL 35,18 ± 0,08 15,09 ± 0,04 ĐK 37,16 ± 0,09 14,18 ± 0,08 DT84 33,01 ± 0,20 17,55 ± 0,16 Trong các cây họ đậu, hạt đậu tương có hàm lượng protein cao nhất. Protein là một trong hai chỉ tiêu quyết định chất lượng hạt của đậu tương. Đậu tương thuộc loại cung cấp nhiều protein hơn là lipit. Mặc dù điều kiện canh tác và yếu tố bất lợi của ngoại cảnh có thể làm ảnh hưởng đến năng suất của đậu tương, song hàm luợng protein của hạt đậu tương vẫn cao hơn hàm lượng protein của các loại ngũ cốc khác. Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy hàm lượng protein của các giống dao động trong khoảng 32,56% – 37,16%. So với hàm lượng protein của các giống đậu tương ở Nepal (42% - 45%), ở Bắc Mỹ (39%) thì hàm lượng protein của các giống trên thuộc vào loại trung bình. Hàm lượng protein thay đổi tùy theo giống, chế độ bón phân và mùa vụ của cây trồng. Giống Đông Khê có hàm lượng protein cao nhất trong các giống địa phương của tỉnh Cao Bằng (37,16%), giống Hạ Lang có hàm lượng protein thấp nhất (32,56%). Hàm lượng protein của các giống được xếp theo thứ tự giảm dần như sau: ĐK > TL > VCB > QH > CB4 >DT84 > HL. Phân tích hàm lượng lipit trong hạt của 7 giống đậu tương ở bảng 3.2 cho thấy, hàm lượng lipit của các giống dao động từ 14,18% – 18,89 % , so với hàm lượng lipit của các giống đậu tương trên thế giới (12% – 25 %) thì hàm lượng lipit của các giống nghiên cứu thuộc vào loại trung bình. Giống ĐK có hàm lượng lipit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 http://www.lrc-tnu.edu.vn thấp nhất (14,18 %) nhưng lại có hàm lượng protein cao nhất (36,12 %). Giống HL có hàm lượng lipit cao nhất (18,89 %) nhưng lại có hàm lượng protein thấp nhất (32,56 %). Như vậy hàm lượng lipit và hàm lượng protein trong hạt đậu tương có mối tương quan nghịch. Kết quả này phù hợp với những công bố trước đây của Trần Thị Phương Liên (1999), của Trần Đình Long (2000) và Chu Hoàng Mậu (2001) [8], [11], [9]. Với đậu tương dùng để lấy dầu thì cần có hàm lượng lipit cao [10], nhưng nếu dùng để chế biến thành các món ăn cho những người béo phì thì những giống đậu tương có hàm lượng lipit thấp lại rất được ưa chuộng. Đậu phụ là loại thực phẩm được chế biến từ hạt đậu tương là món ăn rất tốt cho sức khoẻ, chất lượng đậu phụ ngon do nhiều yếu tố quyết định nhưng một trong những yếu tố quan trọng nhất là hàm lượng lipit thấp và hàm lượng protein cao, hàm lượng dầu càng thấp chất lượng đậu phụ càng ngon. Nhìn chung, hàm lượng protein và lipit của các giống đậu tương trồng ở nước ta là không cao, chỉ đạt vào mức trung bình trên thế giới. Hàm lượng protein ở đậu tương còn là một chỉ tiêu rất có ý nghĩa thực tiễn trong vấn đề cung cấp chất dinh dưỡng cho con người và gia súc. Protein tổng số trong hạt đậu tương chủ yếu là protein dự trữ. Tuy nhiên, trong tế bào vẫn có những enzyme như protease, amylase... Các enzyme này tham gia vào quá trình chuyển hoá tinh bột và protein dự trữ trong hạt, những yếu tố tham gia vào quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu của hạt trong giai đoạn nảy mầm như LEA (Late Embryogenesis abundant) protein, protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) [7]. Vì vậy, phân tích hàm lượng protein trong hạt là một chỉ tiêu cho phép xác định mức độ chống chịu của giống trên phương diện hoá sinh. 3.1.3. Kết quả phân tích hàm lƣợng axit amin liên kết trong hạt Thành phần axit amin là chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng protein của hạt. Bằng cách sử dụng phương pháp phân tích hàm lượng axit amin trong hạt trên hệ máy HP- Amino Quant và dựa vào sắc ký đồ, chúng tôi đã xác định được hàm lượng axit amin trong hạt (g axit amin/100g mẫu) và được thể hiện ở bảng 3.3. Chúng tôi đã xác định được 17 loại axit amin có trong hạt của các giống đậu tương. Trong đó, không có tryptophan vì loại axit amin này bị phân hủy trong quá trình thủy phân bởi HCl 6N, cysteine và cystine ở dạng hỗn hợp không phân tách Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 http://www.lrc-tnu.edu.vn được, còn glutamin và asparagin chuyển hóa thành axit glutamic và axit aspactic. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng các axit amin chứa nhóm SH rất thấp: Met từ 0,35 đến 0,48g/100g protein, Cys + Cys từ 0,28 đến 0,51g/100g protein. Giống CB4 có hàm lượng axit amin chứa nhóm SH thấp nhất và giống DT84 có hàm lượng axit amin chứa nhóm SH cao nhất . Bảng 3.3. Hàm lượng các axit amin trong hạt của các giống đậu tương (g axit amin/100g mẫu) STT Axit amin CB4 HL QH VCB TL ĐK DT84 1 Asp 3,54 3,68 3,92 3,86 4,01 4,30 3,90 2 Glu 5,67 5,58 5,82 6,13 5,59 6,52 5,84 3 Ser 1,77 1,69 1,72 1,80 1,96 1,99 1,78 4 His 1,23 1,21 1,31 1,10 1,19 1,33 1,16 5 Gly 1,60 1,51 1,47 1,60 1,79 1,68 1,39 6 Thr 1,34 1,33 1,33 1,34 1,44 1,52 1,35 7 Ala 1,42 1,38 1,42 1,45 1,57 1,62 1,42 8 Arg 2,25 2,06 2,48 2,44 2,53 2,47 2,36 9 Tyr 1,15 1,16 1,18 1,23 1,29 1,33 1,18 10 Cys+ Cys 0,28 0,34 0,41 0,33 0,35 0,50 0,51 11 Val 1,42 1,38 1,45 1,54 1,59 1,71 1,58 12 Met 0,36 0,40 0,35 0,39 0,48 0,42 0,42 13 Phe 1,78 1,69 1,77 1,92 1,86 2,03 1,81 14 Ile 1,51 1,45 1,46 1,52 1,65 1,72 1,46 15 Leu 2,62 2,49 2,59 2,73 2,86 2,89 2,61 16 Lys 4,33 3,98 3,71 4,27 4,77 4,01 2,98 17 Pro 1,57 1,06 1,15 1,18 1,73 1,34 0,73 Tổng số 33,84 32,39 33,54 34,83 36,66 37,38 32,48 Chất lượng của protein cũng được tính theo tỷ lệ của từng axit amin trong phân tử protein (tính bằng gam axit amin/100g protein tổng số) (bảng 3.4). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.4. Thành phần và hàm lượng axit amin trong protein hạt của các giống đậu tương (g axit amin/100g protein) STT Axit amin CB4 HL QH VCB TL ĐK DT84 1 Asp 10,46 11,36 11,69 11,08 10,94 11,50 12,01 2 Glu 16,76 17,23 17,35 17,60 15,25 17,44 17,98 3 Ser 5,23 5,22 5,13 5,17 5,35 5,32 5,48 4 His 3,63 3,74 3,91 3,16 3,25 3,56 3.57 5 Gly 4,73 4,66 4,38 4,59 4,88 4,49 4,28 6 Thr 3,96 4,11 3,97 3,85 3,93 4,07 4,16 7 Ala 4,20 4,26 4,23 4,16 4,28 4,33 4,37 8 Arg 6,65 6,36 7,39 7,01 6,90 6,61 7,27 9 Tyr 3,40 3,58 3,52 3,53 3,52 3,56 3,63 10 Cys+ Cys 0,83 1,05 1,22 0,95 0,95 1,34 1,57 11 Val 4,20 4,26 4,32 4,42 4,34 4,57 4,86 12 Met 1,06 1,23 1,04 1,12 1,31 1,12 1,29 13 Phe 5,26 5,22 5,28 5,51 5,07 5,43 5,57 14 Ile 4,46 4,48 4,35 4,36 4,50 4,60 4,50 15 Leu 7,74 7,69 7,72 7,84 7,80 7,73 8,04 16 Lys 12,80 12,29 11,06 12,26 13,01 10,73 9,17 17 Pro 4,64 3,27 3,43 3,39 4,72 3,58 2,25 Đậu tương được coi là loại đậu chứa protein có chất lượng tốt nhất trong số các loại protein thực vật. Tất cả các loại axit amin không thay thế như: Thr, Val, Met, Phe, Ile, Leu, Lys đều có trong thành phần axit amin của protein của các giống đậu tương nghiên cứu. Khi so sánh hàm lượng axit amin không thay thế của các giống đậu tương nghiên cứu với tiêu chuẩn của FAO (1976), chúng tôi thấy một số axit amin không thay thế như Thr, Phe, Ile, Leu, Lys đều có tỷ lệ cao hơn, chỉ có Met là thấp hơn so với tiêu chuẩn của FAO (bảng 3.5 và hình 3.2). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.5. Thành phần và hàm lượng các axit amin không thay thế trong hạt của 7 giống đậu tương (g axit amin/100g protein) STT Axit amin FAO CB4 HL QH VCB TL ĐK DT84 1 Thr 2,8 3,96 4,11 3,97 3,85 3,93 4,07 4,16 2 Val 4,2 4,20 4,26 4,32 4,42 4,34 4,57 4,86 3 Met 2,2 1,06 1,23 1,04 1,12 1,31 1,12 1,29 4 Phe 2,8 5,26 5,22 5,28 5,51 5,07 5,43 5,57 5 Ile 4,2 4,46 4,48 4,35 4,36 4,50 4,60 4,50 6 Leu 4,2 7,74 7,69 7,72 7,84 7,80 7,73 8,04 7 Lys 4,2 12,80 12,29 11,06 12,26 13,01 10,73 9,17 % 14 12 10 8 6 4 2 0 Thr Val Met Phe Ile Leu Lys Axit amin FAO CB4 HL QH VCB TL ĐK DT84 Hình 3.2. Biểu đồ so sánh hàm lượng axit amin không thay thế của các giống đậu tương nghiên cứu với tiêu chuẩn của FAO 3.1.4. Nhận xét về đặc điểm hình thái, hoá sinh hạt của các giống đậu tƣơng Từ kết quả phân tích một số đặc điểm hình thái, hoá sinh hạt ở 6 giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng và giống DT84 có thể rút ra một số nhận xét sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 http://www.lrc-tnu.edu.vn Các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng và giống đối chứng DT84, biểu hiện sự đa dạng về các tính trạng màu sắc hạt, rốn hạt, hình dạng, kích thước và khối lượng 1000 hạt Hàm lượng protein trong hạt của các giống đậu tương dao động từ 32,56% – 37,16%. Các giống ĐK, TL, QH, VCB, CB4 có hàm lượng protein trong hạt cao hơn giống DT84 từ 0,88 % đến 4,15%. Hàm lượng lipit trong hạt của các giống đậu tương dao động từ 14,18 % – 18,89 %. Hàm lượng protein và hàm lượng lipit có mối tương quan nghịch. Hàm lượng và thành phần axit amin không thay thế trong protein của các giống đậu tương nghiên cứu đều cao hơn tiêu chuẩn của FAO (trừ Met). 3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Ảnh hƣởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của α - amylase và hàm lƣợng đƣờng trong giai đoạn hạt nảy mầm Amylase là enzyme phân giải tinh bột, gồm hai loại là  - amylase và α amylase, α- amylase được tổng hợp mạnh trong quá trình nảy mầm của hạt, giúp cho quá trình phân giải tinh bột diễn ra mạnh để tạo ra năng lượng cung cấp cho quá trình nảy mầm của hạt. Vì vậy, làm cho hàm lượng đường tan tăng lên, dẫn đến làm tăng áp suất thẩm thấu của tế bào, nhờ đó mà thực vật có khả năng chống lại sự mất nước ở giai đoạn nảy mầm. Đây là điều rất có ý nghĩa đối với quá trình nảy mầm của hạt vì nó đảm bảo cho sự phát triển của mầm và cây non trong điều kiện thiếu nước. Xuất phát từ cơ sở trên nên chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương thông qua sự thay đổi hoạt độ của α - amylase và sự biến động hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm trong điều kiện gây hạn sinh lý bằng cách bổ sung sorbitol 7%. Hoạt độ của  - amylase được xác định thông qua lượng tinh bột bị thuỷ phân ở 30oC trong 30 phút dựa vào đồ thị chuẩn với giá trị OD được đo ở bước sóng 560nm. Kết quả phân tích sự biến động hoạt độ  - amylase ở giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý bởi dung dịch sorbitol 7% được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.3. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.6. Hoạt độ của  - amylase trong các giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý bởi sorbitol 7% (ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm) Hoạt độ của - amylase STT Giống 1ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 1 TL 0,53  0,021 1,39  0,031 2,15  0,046 3,18  0,040 1,82  0,15 2 HL 0,41  0,025 1,19  0,060 1,96  0,264 2,90  0,193 1,30  0,06 3 VCB 0,45  0,010 1,23  0,035 2,01  0,084 2,98  0,068 1,54  0,14 4 CB4 0,46  0,021 1,25  0,055 2,05  0,052 3,04  0,055 1,44  0,05 5 QH 0,47  0,015 1,26  0,035 2,09  0,060 3,08  0,119 1,93  0,12 6 ĐK 0,54  0,025 1,36  0,050 2,34  0,058 3,21  0,036 1,97  0,09 7 DT84 0,40  0,017 1,02  0,050 1,85  0,123 2,55  0,081 1,67  0,12 §VH§/mg h¹t n¶y mÇm 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 1ngày TL XHL 3ngày VCB 5ngày CB4 7ngày QH 9ngày ĐK Ngµy tuæi DT84 Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ của α - amylase trong các giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý bởi sorbitol 7% ở 7 giống đậu tương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.4. Hoạt độ của  - amylase ở 7 giống đậu tương trong các giai đoạn hạt nảy mầm 1-CB4 ; 2-HL ; 3-QH ; 4-VCB ; 5-TL ; 6 -ĐK ; 7-DT84 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.3 cho thấy hoạt độ của  - amylase có sự khác nhau giữa các giống đậu tương và giữa các ngày tuổi. Xu hướng chung của sự biến động này là hoạt độ của  - amylase tăng từ giai đoạn 1 ngày tuổi và cao nhất ở 7 ngày tuổi sau đó giảm dần ở 9 ngày tuổi. Giống ĐK có hoạt độ của  - amylase cao nhất so với các giống còn lại ở tất cả các ngày tuổi được nghiên cứu và thấp nhất là giống (DT84). Kết quả trên chứng tỏ sorbitol đã ảnh hưởng đến hoạt độ của  amylase ở giai đoạn nảy mầm của các giống đậu tương. Sự ảnh hưởng của sorbitol đến hoạt độ  - amylase của các giống đậu tương là có sự khác nhau và phụ thuộc vào khả năng chịu hạn của từng giống. Đường trong tế bào có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong dịch bào khi gặp điều kiện bất lợi. Vì vậy chúng tôi khảo sát hàm lượng đường ở giai đoạn hạt nảy mầm với mục đích tìm mối liên quan đến khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Hàm lượng đường tan của các giống đậu tương nghiên cứu ở giai đoạn nảy mầm Hàm lượng đường tan (%) STT Giống 1ngày 3ngày 5ngày 7ngày 9ngày 3,15  0,046 5,01  0,050 7,89  0,083 8,56  0,143 6,25  0,047 1 TL 2 HL 2,41  0,101 4,60  0,100 7,12  0,057 7,97  0,090 5,56  0,052 3 VCB 2,68  0,118 4,34  0,057 7,40  0,029 7,99  0,079 6,72  0,068 4 CB4 2,86  0,150 4,60  0,050 7,10  0,066 8,31  0,098 5,85  0,061 5 QH 2,94  0,445 4,83  0,051 7,94  0,087 8,40  0,103 6 ĐK 3,34  0,072 4,96  0,061 8,25  0,038 8,89  0,113 7,10  0,070 6,5  0,108 7 DT84 2,34  0,059 3,67  0,082 6,12  0,133 7,75  0,038 5,67  0,116 Kết quả cho thấy trong quá trình nảy mầm của hạt hàm lượng đường tan đều tăng ở giai đoạn hạt nảy mầm 1 ngày tuổi và tăng cao nhất ở giai đoạn 7 ngày tuổi, sau đó giảm dần ở giai đoạn 9 ngày tuổi. Sự biến động hàm lượng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 http://www.lrc-tnu.edu.vn đường ở các giống đậu tương là khác nhau và được sắp xếp theo thứ tự sau: Hµm l-îng ®-êng tan (%) ĐK > TL> QH > CB4 > VCB> HL > DT84. 10 8 6 4 2 0 1ngày TL XHL 3ngày VCB 5ngày CB4 7ngày 9ngày Ngµy tuæi QH ĐK DT84 Hình 3.5. Hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 7% của 7 giống đậu tương Hàm lượng đường tan trong cây liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu như chịu lạnh, chịu hạn. Khi tế bào bị mất nước`, Các chất hoà tan sẽ dần được tích luỹ trong tế bào chất nhằm chống lại sự mất nước và tăng khả năng giữ nước của chất nguyên sinh. Quá trình thuỷ phân cacbon hydrat dự trữ sẽ cung cấp chất tan cho quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào trong điều kiện mất nước. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi về hàm lượng đường tan trong giai đoạn nảy mầm của các giống đậu tương khi xử lý sorbitol 7% phù hợp với những nhận định trước đây về tăng áp suất thẩm thấu của tế bào thông qua các phân tử đường tan làm tăng khả năng chịu hạn. Khảo sát mối tương quan giữa hoạt độ của  - amylase và hàm lượng đường được trình bày ở bảng 3.8. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.8. Tương quan giữa hoạt độ của  - amylase và hàm lượng đường tan ở các giai đoạn hạt nảy mầm Hệ số tương STT Giống Phương trình hồi quy 1 TL Y = 2,16X + 2,26 R 2 HL Y = 2,25X + 2,04 R = 0,96 3 VCB Y = 2,27X + 2,02 R = 0,98 4 CB4 Y = 2,15X + 2,20 R = 0,97 5 QH Y = 2,22X + 2,20 R = 0,96 6 ĐK Y = 2,24X + 2,29 R = 0,97 7 DT84 Y = 2,58X + 1,24 R = 0,99 quan (R) = 0,96 Kết quả nghiên cứu về mối tương quan giữa hoạt độ  - amylase và hàm lượng đường tan được trình bày ở bảng 3.8 cho thấy hệ số tương quan (R) của các giống nghiên cứu đều nằm trong khoảng 0.9 < R < 1. Điều này chứng tỏ hàm lượng đường tan và hoạt độ của  - amylase có sự tương quan thuận chặt chẽ và trong phạm vi nghiên cứu chúng tôi thấy hàm lượng đường tan phụ thuộc tuyến tính vào hoạt độ của  - amylase. Hoạt độ của  - amylase càng cao thì hàm lượng đường tan được hình thành do quá trình phân giải tinh bột càng lớn, cung cấp cho quá trình nảy mầm của hạt, sự sinh trưởng mầm cũng như điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào trong điều kiện cực đoan. Trong điều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn, nóng, lạnh,…) tế bào mất nước nhanh dẫn đến sự điều chỉnh áp suất dịch bào. Nên khi xử lý bởi hạn, tế bào điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng cách tăng hoạt độ của  - amylase và làm tăng hàm lượng đường tan để chống sự mất nước của tế bào. Từ kết quả nghiên cứu về hàm lượng đường tan và hoạt độ của  - amylase ở giai đoạn nảy mầm khi xử lý bởi dung dịch sorbitol 7% cho thấy rằng hoạt độ của  amylase và hàm lượng đường tan có mối tương quan thuận chặt chẽ và có sự khác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 http://www.lrc-tnu.edu.vn nhau giữa các giống, điều này liên quan đến khả năng chịu hạn của mỗi giống. Giống ĐK có khả năng chịu hạn tốt nhất và kém nhất là giống DT84. 3.2.2. Đặc điểm phản ứng của cây đậu tƣơng non đối với hạn Đánh giá sự phản ứng của cây đậu tương non 3 lá chét đối với hạn được tiến hành thông qua việc xác định tỷ lệ thiệt hại, tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước, khả năng phục hồi, chiều dài rễ, tỷ lệ khối lượng rễ/ thân lá, % cây không héo của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non 3 lá. 3.2.2.1. Tỷ lệ thiệt hại của các giống đậu tƣơng ở giai đoạn cây non 3 lá dƣới tác động của hạn Phân tích ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương thông qua tính tỷ lệ cây héo và tỷ lệ cây chết. Chúng tôi đã xác định được tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra ở 7 giống đậu tương nghiên cứu (bảng 3.9 và hình 3.6). Kết quả cho thấy tỷ lệ thiệt hại của các giống đậu tương tăng theo thời gian gây hạn và có sự khác nhau giữa các giống. Giống có tỷ lệ thiệt hại cao nhất là giống DT84 dao động trong khoảng 17,78% (hạn 3 ngày) đến 95,56% (hạn 7 ngày) và thấp nhất là giống ĐK (hạn 3 ngày thiệt hại 5,56% ; hạn 7 ngày thiệt hại 80,00%). Bảng 3.9. Tỷ lệ thiệt hại của 7 giống đậu tương ở giai đoạn cây non 3 lá (%) Hạn 3 ngày Hạn 5 ngày Hạn 7 ngày Hạn 9 ngày (%) (%) (%) (%) TL 8,89 50,00 84,44 97,78 VCB 14,14 71,11 93,33 100,00 HL 16,67 76,67 94,44 100,00 QH 10,00 63,33 88,89 100,00 CB4 13,33 70,00 91,11 100,00 ĐK 5,56 45,56 80,00 95,56 DT84 17,78 82,22 95,56 100,00 Giống Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 http://www.lrc-tnu.edu.vn Tû lÖ thiÖt h¹i (%) 120 100 80 60 40 20 Ngµy h¹n 0 3 TL 5 VCB XHL 7 QH 9 CB4 ĐK DT84 Hình 3.6. Tỷ lệ thiệt hại của 7 giống đậu tương 3.2.2.2. Khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng ở giai đoạn cây non Khi bị hạn, lượng nước trong tế bào giảm gây tổn thương cho cây. Các giống khác nhau sẽ có những đáp ứng khác nhau để làm giảm hoặc tránh bị tổn thương [8]. Kết quả ở bảng 3.10 và hình 3.7 cho thấy ở 3 ngày sau khi xử lý bởi hạn các cây đậu tương đã bắt đấu bị ảnh hưởng, lá non bắt đầu quăn lại, còn thân và rễ không bị ảnh hưởng gì. Sau 5 ngày xử lý mức độ ảnh hưởng đã tăng lên rõ rệt. Sau 7 ngày thì tất cả các giống đều bị héo với mức độ khác nhau và sau 9 ngày thì tất cả 7 giống đều bị héo, số lượng cây bị chết cũng tăng lên cao, để đánh giá mức độ bị ảnh hưởng do thiếu nước gây ra và khả năng hồi phục của của các giống đậu tương sau một thời gian bị hạn chúng tôi đã tiến hành tưới nước trở lại kết quả cho thấy giống ĐK có tỉ lệ cây không bị héo, tỉ lệ cây hồi phục và khả năng giữ nước của cây là cao nhất và thấp nhất là giống DT84. Điều này chứng tỏ khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu ở giai đoạn cây non 3 lá là khác nhau. Hình 3.7. Ảnh cây đậu tương non sau 7 ngày hạn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 http://www.lrc-tnu.edu.vn Thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng, bộ rễ dài và mập có vai trò quan trọng trong việc tránh mất nước do hạn. Kết quả ở bảng 3.10 và hình 3.8 cho thấy giống ĐK có bộ rễ dài nhất, có tỉ lệ rễ/thân lá tươi và khô lớn nhất chính vì vậy mà khả năng chịu hạn của giống này tốt hơn các giống khác. Tính chống chịu của cây trồng nói chung và khả năng chịu hạn nói riêng là tính trạng đa gen. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu là: % cây không héo, % cây hồi phục, tỷ số chịu han (T), tỉ số khối lượng giữa rễ và thân lá tươi, chiều dài rễ của cây đậu tương 3 lá. Sau khi xử lý hạn 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày sau đó nuôi phục hồi 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày. Bảng 3.10 thể hiện kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương thông qua 15 chỉ tiêu phân tích. Hình 3.8. Chiều dài rễ của 7 giống đậu tương sau 7 ngày hạn 1-CB4; 2-HL; 3QH; 4-VCB; 5-TL; 6- ĐK; 7-DT84 Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, các giống có các chỉ tiêu nghiên cứu tương đối khác nhau. Giống có chỉ tiêu phân tích đạt giá trị cao nhất là giống ĐK có 12/15 chỉ tiêu phân tích đạt giá trị cao nhất và giống DT84 có 11/15 các chỉ tiêu phân tích đạt giá trị thấp nhất .Giống có chỉ số chịu hạn tương đối (Sn) cao nhất là giống ĐK (Sn= 7756,78) tiếp đến là các giống TL, QH, CB4, VCB, HL và giống có chỉ số chịu hạn tương đối thấp nhất là giống DT84 ( Sn= 2473,65). Khả năng chịu hạn của các giống còn được biểu diễn trên đồ thị hình rada 15 chiều liên quan đến 15 chỉ tiêu nghiên cứu. Hình 3.9 cho thấy giống ĐK có khả năng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn chịu hạn tốt nhất (diện tích hình rada lớn nhất) và giống có khả năng chịu hạn kém nhất là giống DT84 (diện tích hình rada nhỏ nhất). Bảng 3.10. Bảng tổng hợp các chỉ tiêu đánh giá khả năng chịu hạn Giống CB4 HL QH VCB TL ĐK DT84 % KH 3 ngày 60,00 50,00 70,00 56,67 73,33 83,33 46,67 % KH 5 ngày 10,00 3,33 3,33 6,67 10,00 30,00 6,67 % KH 7 ngày 3,33 3,33 3,33 3,33 6,67 13,33 3,33 % HP 3 ngày 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 % HP 5 ngày 33,33 31,03 51,72 35,71 66,67 52,38 17,86 % HP 7 ngày 7,14 3,45 13,33 10,00 14,29 11,54 6,67 % HP 9 ngày 0,00 0,00 0,00 0,00 3,33 6,67 0,00 R/TLt 5 ngày 33,73 34,71 31,37 20,58 28,84 35,19 14,26 R/TLt 7 ngày 79,71 81,82 73,58 72,15 82,12 87,01 68,19 T(5ngày) 27,10 29,55 29,67 28,87 28,00 32,22 22,22 T(7ngày) 31,46 37,89 44,19 34,43 44,19 46,53 30,82 Lrễ(7ngày) 26,50 21,00 26,50 23,00 23,50 27,50 21,50 KNGN 3ngày 76,70 93.50 86.34 79.79 96.00 96.08 85.44 KNGN 5ngày 68.00 62.00 75.00 68.54 71.20 79.38 27.64 KNGN 7ngày 35.00 41.00 40.00 39.00 42.00 52.00 19.00 5280,60 4531,21 5856,57 4734,81 6483,53 7756,78 2473,65 Chỉ số chịu hạn tương đối % KH (3 ,5,7 ngày) : % cây không héo sau 3, 5, 7 ngày hạn % HP (3,5,7,9 ngày ) : % cây hồi phục sau 3,5,7,9 ngày hạn R/TLt(5 ngày):Tỉ số khối lượng giữa rễ tươi với thân lá tươi 5 ngày hạn (%) R/TLt(7 ngày): Tỉ số khối lượng giữa rễ tươi với thân lá tươi 7 ngày hạn (%) T(5 ngày): Tỉ số khối lượng giữa rễ và thân lá khô 5 ngày hạn (%) T(7 ngày): Tỉ số khối lượng giữa rễ và thân lá khô 7 ngày hạn (%) Lrễ (7 ngày): Chiều dài của rễ sau 7 ngày hạn (cm) KNGN (3ngày, 5 ngày,7 ngày): Khả năng giữ nước sau 3, 5, 7 ngày hạn (%) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 http://www.lrc-tnu.edu.vn a p 100 b 80 o c 60 40 n d 20 0 m e l f k TL VCB g I h XHL QH CB4 DK DT84 Hình 3.9. Đồ thị thể hiện khả năng chịu hạn của 7 giống đậu tương a,b,c : % cây không héo sau 3, 5 , 7 ngày hạn d, e, f : Khả năng giữ nước sau 3, 5, 7 ngày hạn g, h, i, k : Khả năng hồi phục sau 3, 5, 7, 9 ngày hạn l, m : Tỷ lệ khối lượng rê/ thân lá tươi 5, 7 ngày hạn n, o : Tỷ lệ khối lượng rễ/ thân lá khô 5, 7 ngày hạn p : Chiều dài rễ sau 7 ngày hạn 3.2.2.3. Hàm lƣợng protein và proline của các giống đậu tƣơng ở giai đoạn cây non 3 lá. Để có thêm cơ sở đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu ở giai đoạn cây non 3 lá, chúng tôi đã tiến hành phân tích hàm lượng protein và proline trong thân, lá và rễ trong điều điện hạn nhân tạo ở ba thời điểm: trước khi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 http://www.lrc-tnu.edu.vn gây hạn, hạn 5 ngày và hạn 7 ngày. Kết quả phân tích hàm lượng protein và prolin ở 7 giống đậu tương được trình bày ở bảng 3.11. Bảng 3.11. Hàm lượng protein và proline của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non 3 lá Hàm lượng protein (% KL tươi) Giống Trước hạn Hạn 5 ngày Hạn 7 ngày Hàm lượng proline (mM/g KL tươi) Trước hạn Hạn 5 ngày Hạn 7 ngày CB4 9,45 ± 0,154 8,18 ± 0,609 6,15 ± 0,042 1,79 ± 0,052 4,12 ± 0,055 5,67 ± 0,026 HL 8,17 ± 0,051 7,12 ± 0,004 6,20 ± 0,137 1,85 ± 0,051 3,24 ± 0,072 4,78 ± 0,111 QH 9,50 ± 0,104 8,85 ± 0,009 7,14 ± 0,050 2,03 ± 0,056 4,77 ± 0,186 6,12 ± 0,049 VCB 9,21 ± 0,070 8,09 ± 0,008 7,18 ± 0,072 2,3 ± 0,031 4,03 ± 0,049 5,12 ± 0,096 2,69 ± 0,065 4,67 ± 0,021 5,86 ± 0,102 TL 10,03 ± 0,110 8,56 ± 0,005 7,25 ± 0,038 ĐK 10,13 ± 0,127 8,96 ± 0,005 7,64 ± 0,067 2,34 ± 0,115 4,89 ± 0,079 6,17 ± 0,083 DT84 8,12 ± 0,117 7,05 ± 0,011 7,85 ± 0,242 1,90 ± 0,042 3,15 ± 0,359 4,32 ± 0,206 Bảng 3.11 cho thấy hàm lượng protein của cây đậu tương non ở tất cả các giống khi bị hạn 5, 7 ngày đã giảm so với thời điểm trước khi bị hạn. Tuy nhiên hàm lượng proline lại có sự gia tăng khi thời gian gây hạn kéo dài và sự gia tăng này là khác nhau giữa các giống. Giống ĐK có hàm lượng proline tăng cao nhất (trước hạn là 2,34mM/g hạn 5 ngày là 4,89mM/g và 7 ngày là 6,17mM/g). Giống DT84 có hàm lượng proline thấp nhất (trước hạn là 1,90 mM/g hạn 5 ngày là 3,15mM/g và hạn 7 ngày là 4,32mM/g ). Sự tăng cường tổng hợp proline là một chỉ tiêu quan trọng phản ánh khả năng chống chịu của cây khi gặp điều kiện hạn hán, phản ứng này giúp cây duy trì được áp lực thẩm thấu và cấu trúc thành tế bào, đảm bảo sự trao đổi nước khi cây sống ở môi trường khô hạn. Ở tất cả các giống đậu tương, khi cây bị hạn thì hàm lượng protein giảm và hàm lượng proline tăng. Sự gia tăng hàm lượng proline và giảm hàm lượng protein của các giống đậu tương sau khi gây hạn đã chứng tỏ các cây đậu tương có phản ứng một cách tích cực trước sự thay đổi của điều kiện môi trường. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hµm l-îng protein (% KL t-¬i) 12 10 8 6 4 2 0 CB4 HL Truoc han QH VCB Han 5 ngay TL ĐK DT84 Gièng Han 7 ngay H.l-îng proline (mM/g) Hình 3.10. Biểu đồ so sánh sự biến động hàm lượng protein trước và sau hạn 7 6 5 4 3 2 1 0 CB4 HL QH VCB TL ĐK DT84 Gièng Truoc han Han 5 ngay Han 7 ngay Hình 3.11. Biểu đồ so sánh sự biến động hàm lượng proline trước và sau hạn 3.2.3. Mối quan hệ giữa các giống đậu tƣơng dựa trên sự biểu hiện của các tính trạng đối với hạn Bằng chương trình NTSYS pc 2.02i chúng tôi đã xác định được khoảng cách và thiết lập được mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên những phân tích về sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn biểu hiện các tính trạng của các giống đậu tương trong điều kiện hạn (Bảng 3.12, Hình 3.12). Bảng 3.12. Hệ số khác nhau giữa các giống đậu tương TL HL VCB CB4 QH DK TL 0,00 HL 1,78 0,00 VCB 3,76 5,13 0,00 CB4 2,83 1,76 2,63 0,00 QH 2,23 2,93 1,52 1,15 0,00 DK 1,74 2,61 1,05 1,23 5,06 0,00 DT84 1,14 6,85 8,18 4,19 7,18 6,52 DT84 0,00 Bảng 3.12 cho thấy hệ số khác nhau giữa các giống đậu tương dao động từ 1,05 đến 8,18 và được chia làm 5 mức khác biệt. Hai giống ĐT84 và VCB có khoảng cách lớn nhất (8,18), còn hai giống VCB và ĐK có khoảng cách nhỏ nhất (1,05). Hình 3.12 cho thấy các giống đậu tương phân thành 4 nhóm. Nhóm I gồm 2 giống TL và HL; nhóm II có 3 giống VCB, ĐK, QH; nhóm III chỉ có giống CB4; nhóm IV chỉ có giống ĐT84. Từ kết quả phân tích sự phản ứng của kiểu gen ở các giống đậu tương đối với hạn có thể chia 7 giống đậu tương ở 4 mức chịu hạn khác nhau. Mức chịu hạn cao nhất gồm hai giống ĐK và VCB; mức II có 3 giống TL, HL, QH; mức III có giống CB4; mức IV có giống ĐT84. Vấn đề còn tiếp tục nghiên cứu là so sánh cấu trúc gen liên quan đến tính chịu hạn của các giống đậu tương ở các nhóm chịu hạn trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.12. Sơ đồ quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên sự phản ứng của kiểu gen trước tác động của hạn 3.2.4. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng Hoạt độ của α – amylase và hàm lượng đường trong hạt nảy mầm tăng từ giai đoạn 1 đến 7 ngày tuổi và bắt đầu giảm ở 9 ngày tuổi. Mức độ chịu tác động của sorbitol của các giống đậu tương là khác nhau, giống ĐK có hoạt độ của α amylase và hàm lượng đường ở giai đoạn hạt nảy mầm là cao nhất và thấp nhất là giống DT84. Hoạt độ của α - amylase và hàm lượng đường có mối tương quan thuận chặt chẽ, hệ số tương quan là 0,96 - 0,99. Kiểu gen của các giống đậu tương nghiên cứu có sự phản ứng khác nhau đối với hạn, biểu hiện ở các chỉ tiêu theo dõi như tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước… chỉ số chịu hạn tương đối của từng giống. Giống ĐK có chỉ số chịu hạn cao nhất và thấp nhất là giống DT84. Khả năng chịu hạn của cây đậu tương liên quan đến hàm lượng proline. Khi gặp hạn cây đậu tương cường tổng hợp proline và giảm tổng hợp protein. Sự gia tăng proline có mối tương quan thuận chặt chẽ với khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non. Tổng hợp đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn hạt nảy mầm và cây non dựa trên phương diện sinh ý, hoá sinh đã xác định được 4 mức chịu hạn khác nhau. Hai giống ĐK và VCB có khả năng chịu hạn cao nhất, giống ĐT84 có khả năng chịu kém nhất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3. KẾT QUẢ NHÂN ĐOẠN ADN THUỘC GEN P5CS LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP PROLINE Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 3.3.1. Tách chiết ADN tổng số của các giống đậu tƣơng Mọi nghiên cứu trên hệ gen đều bắt đầu từ việc tách chiết được ADN hệ gen ở dạng tinh sạch. Đậu tương có hàm lượng protein và ARN cao, cho nên nghiên cứu tách chiết để thu nhận dung dịch ADN tinh sạch sẽ gặp khó khăn hơn so với các đối tượng khác. Chúng tôi sử dụng mầm 3 ngày tuổi của 7 giống đậu tương để tách chiết ADN tổng số bao gồm các giống: Cao Bằng 4, Hạ Lang – Cao Bằng, Quảng Hoà – Cao Bằng, Vàng - Cao Bằng, Trà Lĩnh – Cao Bằng, Đông Khê – Cao Bằng và giống DT84. Mầm được tách khỏi lá mầm, giữ ở -85°C cho đến khi sử dụng. Mầm được nghiền thành dạng bột mịn trong nitơ lỏng và hoà tan trong dung dịch đệm chiết có chứa Tris HCL 1M, pH 8,0; EDTA 0,5M pH 8,0; NaCL 6M, CTAB 4% . CTAB ở trong đệm chiết sẽ làm màng tế bào bị phá vỡ hoàn toàn tạo điều kiện cho ADN và các thành phần nội bào giải phóng ra ngoài. Dung dịch đệm chiết có pH kiềm (pH 8) làm ADN dễ tan và ổn định cấu trúc hơn do bản chất tích điện âm của ADN. Đồng thời, môi trường kiềm làm giảm tương tác tĩnh điện giữa ADN với các protein kiềm như histon. Dung dịch muối NaCl 6M nồng độ cao sẽ loại bỏ tương tác ion giữa ADN và catrion, phân tách hoàn toàn phức hệ ADN protein. Đặc biệt với đậu tương tế bào của chúng chứa nhiều protein nên chúng tôi còn loại bỏ protein và các tạp chất khỏi dung dịch bằng cách sử dụng một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol tỷ lệ (25: 2: 1) để ADN có đủ độ tinh sạch. Tiếp theo, dung dịch phenol:chloroform được sử dụng để làm biến tính và kết tủa các protein hoà tan. Từ 0,5g mỗi loại chúng tôi thu được 200l dịch chiết ADN. Các mẫu ADN có độ tinh sạch được kiểm tra trên máy quang phổ ở bước sóng  = 260/280 nm và có đỉnh cực đại ở bước sóng 260nm. Sau khi xác định nồng độ, chúng tôi kiểm tra chế phẩm ADN bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả cho thấy, chỉ có một băng chính tập trung các phân tử ADN, có phân tử lượng lớn (hình 3.14). Điều này chứng tỏ, ADN được tách chiết từ các giống đậu tương đều tương đối sạch, không bị đứt gãy, ít tạp chất và đảm bảo cho nghiên cứu tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn M 1 2 3 4 5 6 7 p  Hình 3.13. Hình ảnh điện di ADN tổng số của các giống đậu tương M- Thang DNA chuẩn; 1 – CB4; 2 - HL; 3 - QH; 4 - VCB; 5 - TL; 6 - ĐK; 7 – DT84 Sau khi điện di kiểm tra các mẫu ADN trên gel agarose, chúng tôi tiến hành định lượng các mẫu bằng quang phổ kế ở bước sóng 260nm (OD260nm) và 280nm (OD280nm). Phương pháp này còn cho phép xác định nồng độ ADN có trong mẫu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.13. Bảng 3.13. Hàm lượng và độ tinh sạch của ADN tổng số của 7 giống đậu tương STT Tên Mẫu Hàm lượng ADN (ng/l) Tỉ số OD260/ OD280 1 CB4 268,0 1,87 2 HL 241,6 1,93 3 QH 237,7 1,91 4 VCB 254,6 1,85 5 TL 247,3 1,94 6 ĐK 239,5 1,86 7 DT84 267,3 1,85 Kết quả bảng 3.13 cho thấy các mẫu ADN được tách có nồng độ từ 237,7 đến 268,0 ng/l tỷ lệ OD260nm/ OD280nm từ 1,85 đến 1,94. Như vậy có thể một lần nữa khẳng định các mẫu ADN đều đã đáp ứng đủ yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch để có thể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.2. Nhân đoan ADN thuộc gen P5CS từ các giống đậu tƣơng Khi gặp hạn thực vật tăng cường quá trình tổng hợp proline. Sự tổng hợp proline trong tế bào từ axit glutamic được xúc tác bởi hai enzyme là P5CS và P5CR. Gen mã hoá cho enzym P5CS được biểu hiện mạnh khi cây rơi vào tình rạng thiếu nước nên có thể nói gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng hợp proline ở thực vật khi bị hạn. Trên cơ sở xác định được nồng độ khuôn tối ưu cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành nhân gen P5CS của 7 giống đậu tương (Cao Bằng 4, Hạ Lang Cao Bằng, Quảng Hoà Cao Bằng, Vàng Cao Bằng, Trà Lĩnh Cao Bằng, Đông Khê Cao Bằng và giống DT84). Sử dụng ADN hệ gen làm khuôn để nhân gen P5CS với cặp mồi Pro Soy2R và Pro Soy2F được thiết kế dựa trên trình tự nucleotit của cADN thuộc gen mã hoá cho P5CS ở đậu tương được công bố trên ngân hàng gen quốc tế. Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và chúng tôi nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ưu trong điều kiện bổ sung 2,5µl 10Mm MgCl2 , nhiệt độ gắn mồi là 560C. Sau 30 chu kỳ phản ứng, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và chụp ảnh (hình 3.14 ) M 1 2 3 4 2 kb 5 6 7 1,8 kb Hình 3.14. Hình ảnh điện di đoạn ADN thuộc gen P5CS (1,8kb) được nhân lên bằng kỹ thuật PCR ở các giống đậu tương M; Thang ADN chuẩn; 1- CB4; 2 – HL; 3 – QH; 4 – VCB; 5 – TL; 6 – ĐK; 7- DT84 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết quả nhân gen cho thấy, cả 7 giống đậu tương đều thu được sản phẩm PCR với kích thước phân tử khoảng 1,8kb . So sánh với trình tự đoạn cDNA thuộc gen P5CS có kích thước 1,2kb của giống đậu tương được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế thì sản phẩm PCR của chúng tôi thu được có nhiều hơn 600bp. Có thể do chúng tôi tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn ADN thuộc gen P5CS từ ADN hệ gen nên đoạn ADN thuộc gen P5CS này có chứa intron dài 600 bp.Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn đoạn ADN này có thuộc gen P5CS không thì cần phải tiến hành giải trình tự. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng có sự biểu hiện đa dạng về các đặc điểm hình thái và hoá sinh hạt. Hàm lượng protein của 5 giống đậu tương này đều cao hơn giống DT84. Hàm lượng protein và hàm lượng lipit có mối tương quan nghịch. Hàm lượng axit amin không thay thế trong protein của các giống đậu tương nghiên cứu đa số cao hơn tiêu chuẩn của FAO (trừ Met). 1.2. Hoạt độ của α - amylase và hàm lượng đường có xu hướng tăng từ 1, 3, 5, 7, ngày tuổi và bắt đầu giảm ở 9 ngày tuổi. Giữa hàm lượng đường và hoạt độ của amylase có mối tương quan thuận chặt chẽ, hệ số tương quan là 0,96-0,99. Các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng đều có hoạt độ của - amylase và hàm lượng đường tan cao hơn giống DT84, giống ĐK có hàm lượng đường và hoạt độ của - amylase cao nhất. 1.3. Ở giai đoạn cây non 3 lá, các giống đậu tương đã phản ứng khác nhau đối với hạn. 6 giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng có khả năng chịu hạn cao hơn giống DT84, cao nhất là giống ĐK ( chỉ số chịu hạn là Sn= 7756,78) 1.4. Tổng hợp đánh giá khả năng chịu hạn cho thấy các giống đậu tương nghiên cứu phân bố thành 4 nhóm tương ứng với 4 mức chịu hạn khác nhau. Mức 1 chịu hạn cao nhất gồm hai giống ĐK và VCB, mức 2 gồm 3 giống TL, HL, QH; mức 3 có giống CB4; mức 4 là giống DT84 có khả năng chịu hạn kém nhất. 1.5. Bằng kỹ thuật PCR chúng tôi đã nhân được đoạn ADN thuộc gen P5CS từ hệ gen của các giống đậu tương với cặp mồi Pro Soy2F và Pro Soy2R, ước tính kích thước của đoạn ADN này khoảng 1,8kb 2. Đề nghị 2.1. Đề tài cần tiếp tục tách dòng và giải trình tự gen P5CS và so sánh với các trình tự gen này đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế. 2.2. Giống ĐK có khả năng chịu hạn cao nhất trong số các giống nghiên cứu, nên có thể tuyển chọn giống này làm vật liệu cho công tác chọn giống đậu tương chịu hạn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Chu Hoàng Mậu - Hà Tiến Sỹ (2007), “Đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) địa phương của tỉnh Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, số 3(43), Tr 13 - 19. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Trần Bình , Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội. 2. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền ,Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hoá sinh học, Nxb Giáo dục, 54 -55. 3. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội Lê Trần Bình (2003), "Mối Tương quan giữa hàm lượng proline và tính chống chịu ở cây lúa ”, Tạp chí Công Nghệ sinh học, 1(1), Tr 85 – 95. 4. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb KHKT Hà Nội,Tập 3, 116 -120. 5. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hương (2005), "Nghiên cứu đặc điểm hình thái, hoá sinh và nhân gene dehydrrin của một số giống đậu tương địa phương vùng núi phía Bắc Việt Nam". Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc - Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống- Đại học Y Hà Nội. NXB KHKT Hà Nội, 1224-1227. 6. Nguyễn Huy Hoàng (1992), Nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội ở miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ, Hà Nội. 7. Trần Thị Phương Liên và cs (1999), "Phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương”. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, 1348 – 1349. 8. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 9. Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (1998), ” Phân lập gen chaperonin ở giống đậu tương chịu nóng M103 ”, Tạp chí khoa học công nghệ, 36(5), 8 – 14 10. Trần Đình Long và cs (1999), Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp 11. Chu Hoàng Mậu, Nông Thị Man, Lê Trần Bình (2000), “Đánh giá một số tính trạng kinh tế quan trọng và khả năng chịu hạn của các dòng đậu tương (Glycine Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn max (L.) Merrill) đột biến”, Tạp chí khoa học và công nghệ, 1(13), Đại học Thái Nguyên, 16-21. 12. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội. 13. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học , Hà Nội. 14. Nguyễn Thị Tâm, Lê Trần Bình (2003), “Ảnh hưởng của nhiệt độ cao lên hoạt độ α- amylase và hàm lượng đường tan ở hạt nảy mầm của một số giống và dòng lúa chọn lọc từ mô sẹo chịu nóng”, Tạp chí công nghệ sinh học, 1(1), Tr. 101 – 108. 15. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm ngư nghiệp trên máy tính, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. TIẾNG ANH 16. Aral B, Schlenzig J-S, liu G, Kamoun P (1996), “Database cloning of human delta1 - pyrroline -5- carboxylate synthetase (P5CS) cDNA: a bifunctional enzyme catalyzing the first 2 steps in proline biosynthesis”, C.R.Acad. Sci Paris 319: 171-178. 17. Bates L.S.(1973), Rapid determination of free protem for water –stress studies, Plant and soil ,39, 205 -207. 18. Bray E.A.(1997),“Plant responses to water deficit”,Trend Plant Sci,2( 2) 47 - 54 19. Chen T.H., Muranta N. (2002), “Enhancement of tolerance of a family of plant dehydrin proteins”, Physiol. Plant, pp. 795 – 803. 20. Delauney AJ, Verma DPS (1990), “A soybean delta1 - pyrroline-5-carboxylate reductase gene was isolated by functional complementation in Escherichia coli and is found to be osmoregulated”, Mol.Gen. Genet. 221: 299-305. 21. Foolad, M.R. SIVaA, and Rodriguer L.R,(1995), Appliction polymerase chain reaction ( PCR) to plant genom analyis , In:Tissue ADN organ culture . Fundamental methods. Springer verlag, Berlin, Heidelerg, 281-298. 22. Hare PD, Cres WA (1997), Metabolic implications of stress-induced proline accumulation in plants, Plant Growth Regulation 21: 79 * 102. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn 23. Hu CA, Delauney AJ, Verma DP (1992), “A bifunctional enzyme (delta1pyrroline-5-carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants”, Proc. Natl. Acad.Sci. u.S.A.89:9354-9358. 24. Hua X-J, van de Cottte B, Van Monatgu M, Verbruggen N (1997) , “Developmental regulation of pyrroline-5-carboxylate reductase gene expression in Arabodopsis”, Plant Physiol.1215 - 1224. 25. Kishor PBK, Hong Z, Miao G - H, Hu C-AA, Verma DPS (1995) ,”Overexpression of delta1 - pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants”, Plant physiol. 108: 1387 - 1394. 26. Krueger R, Jager HJ, Hintz M, Pahlich E (1986 ), “purification to homogeneity of pyrroline-5-carboxylate reductase of barley” Plant Physiol. 80: 142 - 144. 27. LaRosa PC, Rhodes D, Rhodes JC, Bressan RA, Csonka LN (1991), “Elevated accumulation of proline in NaCl-adapted tobacco cells is not due to altered delta1-pyrroline-5-carboxylate reductase” Plant physiol. 96: 245 - 250. 28. Lodata RF, Smith RJ, Valle D, phang JM, Aoki TT (1981), “Regulation of proline biosynthesis: the inhibition of pyrroline-5-carboxylate synthase activity by ornithine”, Metabolism 30: 908 - 913. 29. Lyer S, Caplan A (1998), “Products of proline catabolism can induce osmotically regulated genes in rice”, Plant physiol. 116: 203 - 211. 30. Maitra N and Cushman J, C. (1994), “Ioslation and characterization drought – induced Soybean cDNA encoding a D95 famyly late – embryogennesis – abudant protein”, Plant physiol., 106, 805 - 806 31. Soulage .JL, Kim K, Arrese EL, Walters C, Cushman JC.(2003), “Conformation of a group 2 late embryogennesis abudant protein from Soybean. Evidence of poly ( L – proline) – Type II Structure Plant”, Physiol., 131 (3), 963 –75 32. Szoke A, Miao GH, hong Z, verma DPS (1992), “Subcellular location of delta1pyrroline-5-carboxylate reductase in root/nodule and leaf of soybean”, Plant physoil. 99: 1642 - 1649. 33. Verma DPS, Hu C-AA, Delauney AJ, Miao G-H, Hong Z (1992), Deciphering proline biosynthesis pathway in plants by direct, trans-, and cocomplementation in bacteria. In “Biosynthesis and Molecular Regulation of Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn Amino Acids in Plants (BK Singh, HE Flores, JC Shannon eds), American Society of Plant Physiologists, Warerly Press, Baltimore, MD, pp, 128-138. 34. Wakabayashi Y, Jones ME (1983), “Pyrroline-5-carboxylate synthesis from glutamate by rat intestinal mucosa. J. biol”, Chem.258: 3865-3872. 35. www. worldoil.com 36. Yoshiba Y, Kiyosue T, Katagiri T, Ueda H, Mizoguchi T, Yamaguchi-Shinozaki K. Wada k, Harada Y, Shinizaki K (1995), “Correlation between the induction of a gene for delta1-pyrroline-5-carboxylate synthetase and the accumulation of proline in Arabidopsis thaliana under osmotic stress”. Plant J. 7: 751 - 760. 37. Yoshiba, Y.,Sanada,Yamaguchi – Shinozaki, Wada,K and Shinozaki,K (1997), “Characterization of the gene for P5CS and correlation between the expression of the gene and salt tolerance in Oryza sativa L”. Plant Mol. Biol. 33(5), 857 865. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng làm nguyên liệu nghiên cứu đó là: Cao Bằng 4, Quảng Hoà – Cao Bằng, Vàng Cao Bằng, Hạ Lang Cao Bằng, Đông Khê – Cao Bằng, Trà Lĩnh – Cao Bằng và sử dụng giống đậu tương DT84 làm đối chứng (bảng 2.1) Bảng 2.1 Nguồn gốc của các giống đậu tương Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc Cao Bằng 4 CB4 Giống địa phương - Cao Bằng Hạ Lang HL Giống địa phương Hạ Lang - Cao Bằng. .. có một số tác giả nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương, tiêu biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [6], nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103 [7], phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị Phương Liên và cs (1999)... http://www.lrc-tnu.edu.vn năng chịu hạn của các giống đậu tương bằng cách xác định tỷ lệ thiệt hại và chỉ số hạn tương đối - Xác định tỷ lệ cây sống sót (%), khả năng giữ nước (%) ở giai đoạn cây lạc 3 lá dưới tác động của hạn Tỷ lệ cây sống sót = Số cây sống Tổng số cây xử lý 100 (%) - Xác định khả năng giữ nước của đậu tương 3 lá trong điều kiện hạn theo công thức: W  W ft W fc (%) Trong đó: W(%): Khả năng giữ nước của. .. Hoà QH Giống địa phương Quảng Hoà - Cao Bằng Vàng Cao Bằng VCB Giống địa phương - Cao Bằng Trà Lĩnh TL Giống địa phương Trà Lĩnh – Cao Bằng Đông Khê ĐK Giống địa phương Đông Khê – Cao Bằng DT84 DT84 Giống đột biến từ dòng 8 - 33 2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.2.1 Hoá chất Sử dụng các loại hoá chất mua của các hãng Anh, Đức, Mỹ, Trung Quốc cho các thí nghiệm phân tích hoá sinh và sinh... các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng có đặc điểm hình thái rất đa dạng và phong phú, có những giống có đặc điểm rất khác với giống phổ biến, nhất là giống Cao Bằng 4 có màu sắc hạt đen giống như hạt đỗ đen Hình 3.1 Hạt của 7 giống đậu tương nghiên cứu 1 – HL; 2 – CB4; 3 – VCB; 4 – QH; 5 –TL; 6 – ĐK; 7 - DT84 Khối lượng hạt là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá năng suất của giống. Các giống. .. tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương Maitra và Cushman (1994) đã phân lập được cDNA của dehydrin từ lá đậu tương khi bị mất nước, ngoài ra các tác giả còn phân lập được cDNA của LEA nhóm D - 95 từ lá và rễ cây đậu tương khi bị hạn [30] Nghiên cứu của porcel và cộng sự (2005), đã chỉ ra rằng, gen mã hoá protein dehydrin (LEA-DII) có vai trò với khả năng chống chịu của đậu tương Ở Việt Nam đã có một. .. Khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương nghiên cứu được sắp xếp theo thứ tự từ cao đến thấp như sau: DT84 > Cao Bằng4 > Vàng Cao Bằng> Hạ Lang Cao Bằng > Trà Lĩnh Cao Bằng > Đông Khê Cao Bằng > Quảng Hoà Cao Bằng 3.1.2 Hàm lƣợng protein và lipit trong hạt của các giống đậu tƣơng nghiên cứu Thành phần các chất dinh dưỡng trong hạt đậu tương gồm: Lipit, protein, hydrat cacbon và các chất khoáng,... gen có khả năng chịu hạn và chịu muối bằng việc chuyển gen tổng hợp proline và gen vận chuyển proline Người ta đã thành công trong việc chuyển gen tổng hợp proline ở lúa, cà chua , thuốc lá và đậu tương kết quả cho thấy khả năng chịu hạn của các giống này đều tăng lên khi được chuyển các gen này Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG... giống. Các giống đậu tương nghiên cứu có kích thước và khối lượng hạt hoàn toàn khác nhau Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy giống Cao Bằng 4 là giống có khối lượng 1000 hạt cao nhất (147.31g ± 0.09), và có kích thước hạt lớn nhất (dài/rộng = 5,10/ 4,35) trong số các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng, giống có khối lượng 1000 hạt thấp nhất là Quảng Hoà (87.58g ± 0.09) và kích thước hạt... nghiên cứu và đánh giá tập đoàn gen đậu tương sớm nhất thế giới Tại đây đã thiết lập hệ thống đánh giá đậu tương (ASET - AVRDC Soybean Evaluation Trial), kết quả đã chọn lọc thành công 24 giống đậu tương có năng suất cao, thích ứng với điều kiện trồng trọt và sinh thái của nhiều quốc gia Công tác nghiên cứu giống đậu tương trên thế giới đang hướng tới những mục đích: thứ nhất là nhập nội giống sau đó ... Ngun gc Cao Bng CB4 Ging a phng - Cao Bng H Lang HL Ging a phng H Lang - Cao Bng Qung Ho QH Ging a phng Qung Ho - Cao Bng Vng Cao Bng VCB Ging a phng - Cao Bng Tr Lnh TL Ging a phng Tr Lnh Cao Bng... ging u tng nghiờn cu c sp xp theo th t t cao n thp nh sau: DT84 > Cao Bng4 > Vng Cao Bng> H Lang Cao Bng > Tr Lnh Cao Bng > ụng Khờ Cao Bng > Qung Ho Cao Bng 3.1.2 Hm lng protein v lipit ht ca... tng a phng ca tnh Cao Bng lm nguyờn liu nghiờn cu ú l: Cao Bng 4, Qung Ho Cao Bng, Vng Cao Bng, H Lang Cao Bng, ụng Khờ Cao Bng, Tr Lnh Cao Bng v s dng ging u tng DT84 lm i chng (bng 2.1) Bng