PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.3.1.1. Đỏnh giỏ khả năng chịu hạn ở giai đoạn cõy non bằng phƣơng phỏp gõy hạn nhõn tạo

Phương phỏp đỏnh giỏ khả năng chịu hạn ở giai đoạn cõy non được tiến hành theo Lờ Trần Bỡnh (1998) [1] và của Đinh Thị Phũng (2001) [13]

- Hạt đậu tương nảy mầm gieo vào chậu (kớch thước 30cm x 30cm) chứa cỏt vàng đó rửa sạch, mỗi chậu trồng 40 cõy, mỗi giống trồng 3 chậu. Thớ nghiệm được lặp lại 3 lần trong điều kiện và chế độ chăm súc như nhau. Thời gian đầu tưới nước

năng chịu hạn của cỏc giống đậu tương bằng cỏch xỏc định tỷ lệ thiệt hại và chỉ số hạn tương đối.

- Xỏc định tỷ lệ cõy sống sút (%), khả năng giữ nước (%) ở giai đoạn cõy lạc 3 lỏ dưới tỏc động của hạn.

Tỷ lệ cõy sống sút =

Số cõy sống Tổng số cõy xử lý

100 (%)

- Xỏc định khả năng giữ nước của đậu tương 3 lỏ trong điều kiện hạn theo cụng thức:

W  W ft

W fc (%)

Trong đú:

W(%): Khả năng giữ nước của cõy sau khi xử lý bởi hạn

Wft(g): khối lượng tươi của cõy sau khi xử lý bởi hạn

Wfc(g): Khối lượng tươi của cõy khụng xử lý

- Tỷ lệ thiệt hại do hạn gõy ra được tớnh theo cụng thức:

a  ( Nob)

NC (%)

Trong đú: a: Tỷ lệ thiệt hạn do hạn gõy ra (%); b: trị số thiệt hại của mỗi cấp;

c: trị số thiệt hại của cấp cao nhất;

No: số cõy của mỗi cấp thiệt hại;

N: tổng số cõy xử lý

Cỏc trị số:

Số cõy chết: trị số 3 Số cõy hộo: trị số 1

Số cõy khụng bị ảnh hưởng: trị số 0.

- Chỉ số chịu hạn tương đối được xỏc định dựa trờn 15 chỉ tiờu phõn tớch và được tớnh theo cụng thức:

Trong đú:

S  1 sin (ab  bc  cd  ...  pa) 2

S: Chỉ số chịu hạn tương đối a, b, c, … Là cỏc chỉ tiờu theo dừi

α: Là gúc tạo bởi 2 trục mang trị số liền nhau α = 3600

/15 15: Là số chỉ tiờu theo dừi

Xỏc định một số chỉ tiờu khỏc chịu tỏc động của hạn

- Chiều dài rễ: Mỗi giống lấy 30 cõy cú rễ dài nhất. Đo chiều dài rễ của mỗi cõy rồi tớnh giỏ trị trung bỡnh.

- Khối lượng tươi của rễ và thõn lỏ: Cắt riờng rễ và thõn lỏ, dựng giấy thấm khụ, rồi cõn trọng lượng tươi trờn cõn phõn tớch.

- Xỏc định khối lượng khụ của rễ và thõn lỏ: Cỏc mẫu được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1000C rồi xỏc định khối lượng khụ tuyệt đối.

- Xỏc định tỉ số chịu hạn

T: Tỉ số khối lượng của rễ/ thõn lỏ khụ

T = Wr/Wtl Wr: Khối lượng khụ của rễ (mg)

Wtl: Khối lượng khụ của thõn lỏ (mg)

2.3.1.2. Xỏc định hàm lƣợng proline

Khi cõy đậu tương được 3 lỏ tiến hành thu mẫu và xử lý hạn, tiếp tục thu mẫu ở 5 ngày hạn và 7 ngày hạn để chiết rỳt và xỏc định hàm lượng prolin. Hàm lượng prolin của thõn, lỏ, rễ được xỏc định theo phương phỏp của Bates và cs (1973) cú cải tiến [17] gồm cỏc bước sau:

(1) Nghiền 0,5g mẫu trong cối và chày sứ.

(2) Thờm 10ml dung dịch axit sunfosalicylic 3%, li tõm 7000 vũng/phỳt, trong 20 phỳt và lọc qua giấy lọc Whatman.

(3) Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm 20ml, bổ sung 2ml axit axetic và 2ml dung dịch axit ninhydrin (thành phần của dung dịch này gồm cú ninhydrin, axit

axetic, axit photphoric 6M), ủ trong nước ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ, sau đú ủ trong đỏ 5 phỳt.

(4) Bổ sung vào bỡnh phản ứng 4ml toluen, lắc đều và lấy phần dịch cú màu hồng ở trờn do OD ở bước súng 520nm.

(5) Hàm lượng proline được mỏy xỏc định theo đồ thị chuẩn.

2.3.1.3. Xỏc định hoạt độ của - amylase

Hoạt độ của  - amylase được xỏc định theo phương phỏp Heilken (1956) mụ tả trong tài liệu của Nguyễn Lõn Dũng [4].

- Nguyờn tắc: Dựa vào tớnh chất hoà tan của enzyme  - amylase trong dung dịch đệm photphat 0,2 M pH = 6,8.

- Chuẩn bị mẫu: Hạt đậu tương ủ trong dung dịch MS 10% chứa 7% sorbitol ở giai đoạn hạt nảy mầm 1, 3, 5, 7 và 9 ngày tuổi. Hạt nảy mầm búc vỏ lụa, cõn khối lượng, nghiền trong 1,8ml dung dịch đệm photphat citrat pH = 6,8 li tõm 12000 vũng/phỳt trong 15 phỳt ở 4oC. Dịch thu được sử dụng làm thớ nghiệm. Thớ nghiệm phõn tớch hoạt độ  - amylase được tiến hành trờn ống thớ nghiệm và ống kiểm tra, đo trờn mỏy quang phổ ở bước súng 560nm.

- Cỏch tớnh: Đơn vị hoạt độ (ĐVHĐ) của  - amylase chớnh là lượng mg tinh bột bị thuỷ phõn trong thời gian 30 phỳt ở 30oC.

Cụng thức tớnh đơn vị hoạt độ của  - amylase là: ĐVHĐ/mg = (C2 C1 ).HSPL

h

Trong đú: C1: lượng tinh bột cũn lại của mẫu thớ nghiệm

C2: lượng tinh bột cũn lại của mẫu kiểm tra

HSPL: hệ số pha loóng h: khối lượng mẫu (mg)

Phõn tớch định tớnh hoạt độ của  - amylase bằng phương phỏp khuếch tỏn trờn thạch, thành phần hỗn hợp dịch gồm: Thạch agar 0,8%, tinh bột 1%.

2.3.1.4. Xỏc định hàm lƣợng đƣờng tan

- Xỏc định hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm cú bổ sung 7% sorbitol theo phương phỏp vi phõn tớch được mụ tả trong tài liệu của Phạm Thị Trõn Chõu và cs [2].

- Nguyờn tắc: trong mụi trường kiềm, đường khử ferixianua kali thành kali ferixianua với sự cú mặt của gelatin, kali ferixianua kết hợp với sắt sunfat tạo thành phức chất màu xanh bền.

Cõn khối lượng mẫu, nghiền nhỏ, chiết bằng nước cất, li tõm 12000 vũng/phỳt trong 30 phỳt ở 4oC. Dịch chiết đường được giữ lại để nghiờn cứu. Hàm lượng đường tan được đo quang phổ hấp thụ ở bước súng 585nm.

- Tớnh kết quả: X (a.b.HSPL)

m (%)

Trong đú: X: hàm lượng đường tan (%)

a: nồng độ thu được khi đú trờn mỏy (mg/ml) b: số ml dịch chiết

HSPL: hệ số pha loóng m: khối lượng mẫu (mg)

2.3.1.5. Định lƣợng protein

Protein tan tổng số được phõn tớch theo phương phỏp Lowry [2].

Cõn 0,05g mẫu đó nghiền nhỏ, sấy khụ cho vào tube, mỗi mẫu lặp lại 3 lần. Cho vào mỗi tube 1,5ml dung dịch đệm , đảo đều bằng mỏy voltex, để trong tủ lạnh 4oC qua đờm, đem ly tõm thu dịch ở 12000 vũng/phỳt trong 20 phỳt rồi thu lấy dịch. Thớ nghiệm được lặp lại 3 lần .

Dịch chiết được định mức lờn 5 ml và đo hấp thụ quang phổ trờn mỏy quang phổ UV ở bước súng 750 nm với thuốc thử foling. Hàm lượng protein được tớnh theo cụng thức như mụ tả trong tài liệu của Phạm Thị Trõn Chõu [2].

2.3.1.6. Xỏc định thành phần axit amin

Hàm lượng axit amin được xỏc định trờn mỏy HP - Amino Quant sử dụng ortho-phtalandehyt tạo dẫn xuất đối với cỏc axit amin bậc 1 và 9 - fluoreryl - metyl -

cloroformat đối với cỏc axit amin bậc 2. Mẫu được xử lý theo phương phỏp thuỷ phõn pha lỏng theo hướng dẫn sử dụng mỏy phõn tớch axit amin tự động

2.3.1.7. Xỏc định lipit tổng số

Nguyờn tắc: Dựa vào tớnh chất hoà tan của lipit trong dung mụi hữu cơ (petroleum ether) để chiết rỳt [12].

Mẫu đem sấy khụ, búc vỏ, nghiền mịn. Cõn 0,05g mẫu cho vào mỗi eppendorf (epp) (3 epp/ mẫu). Tiếp theo, cho 1,5ml petroleum ether vào mỗi epp, lắc đảo đều, để ngăn lạnh 4oC trong 24 giờ, đem ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 20 phỳt, bỏ dịch, lặp lại thớ nghiệm 3 lần. Sau đú, sấy khụ mẫu cũn lại trong epp ở 700C đến khi khối lượng khụng đổi rồi cõn mẫu. Hàm lượng lipit được tớnh theo cụng thức

Hàm lượng lipit = A B

(%)

A

A: Khối lượng mẫu ban đầu

B: Khối lượng mẫu sau khi loại lipit

2.3.2. Cỏc phƣơng phỏp sinh học phõn tử

2.3.2.1. Phƣơng phỏp tỏch ADN từ mầm đậu tƣơng

ADN tổng số được tỏch chiết từ mầm đậu tương. Khi mầm đậu tương dài khoảng 1,5cm, tỏch riờng lấy phần thõn mầm rồi bảo quản trong tủ lạnh sõu (-850C). Trỡnh tự tiến hành tỏch chiết ADN ở mầm đậu tương được tiến hành theo Foolad và cs (1995) [21] gồm những khõu chớnh như sau như sau:

(1) Nghiền trong nitơ lỏng khoảng 200mg mầm đậu tương thành dạng bột mịn. Sau đú, mẫu được hoà trong đệm chiết (Tris HCl 0,1M pH 8; EDTA 0,5M pH 8; NaCl 5M; Mecaptoethanol 0,14M; CTAB 4%) ủ 650C trong 90 phỳt để chiết ADN.

(2) Protein và tạp chất được loại bỏ bằng cỏch xử lý dịch chiết bằng một thể tớch tương đương hỗn hợp dung dịch phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 25: 24: 1). Ly tõm để thu lấy pha trờn và tiếp theo là xử lý pha đú bằng dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24: 1). Ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 15 phỳt ở 4oC rồi thu dịch ở pha trờn.

(3) ADN trong dung dịch được tủa bằng isopropanol mix nhẹ và để trờn đỏ qua đờm chờ cú tủa trắng, sau đú ly tõm thu tủa. ADN được rửa lại bằng cồn tuyệt đối hai lần và được làm khụ, hoà tan ADN trong nước khử ion . Điện di kiểm tra ADN thu được trờn gel agarose 0,8%.

2.3.2.2. Phƣơng phỏp kiểm tra ADN bằng quang phổ

Nguyờn tắc của phương phỏp đo quang phổ là dựa vào sự hấp thụ mạnh ỏnh sỏng tử ngoại ở bước súng 260nm và 280nm của cỏc bazơ purin và pirimidin. Một đơn vị OD260nm (Optical Density260nm) tương ứng với nồng độ là 50 àg/ml cho dung dịch ADN sợi đụi. Do đú, nồng độ ADN trong mẫu được tớnh theo cụng thức

CADN (àg/ml) = OD260nm x 50 x độ pha loóng

Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, cú thể đo thờm giỏ trị OD ở 280nm (OD280nm). Dung dịch axit nucleic được xem là sạch (khụng lẫn protein) khi tỉ số OD260nm/ OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.

2.3.2.3. Phƣơng phỏp điện di ADN

Điện di ADN được tiến hành trờn bộ điện di của hóng Bio – Rad sử dụng gel agarose 0,8%. Dung dịch dựng làm đệm để chạy điện di là TBE (Tris – borat 0.045M; EDTA 0.001M; pH 8.0). Điện di chạy với hiệu điện thế là 80V sau đú ADN được nhuộm bằng ethidium brommid, soi dưới đốn UV và chụp ảnh.

2.3.2.4. Phƣơng phỏp nhõn bản đoạn ADN thuộc gen mó hoỏ cho P5CS

Đoạn ADN thuộc gen P5CS của đậu tương được khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi Pro Soy2R, Pro Soy2F được thiết kế dựa trờn trỡnh tự cDNA thuộc gen P5CS ở đậu tương đó cụng bố trờn ngõn hàng gen quốc tế và được tổng hợp tại hóng Invitrogen.Trỡnh tự cặp mồi như sau

Pro Soy 2R: 5‟- TCA TAT AGA AAG GTC TCT GTG AG – 3 „ Pro Soy 2F: 5‟- AGA GCA GCT AGG GAC TGT TCC AG – 3‟

Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR

Thành phần phản ứng Nồng độ Lượng (àl)

Nước khử ion vụ trựng 8,5

Dung dịch đệm cho Taq-polymerase 10 lần 5

dNTP 10mM 2

Pro Soy2F 10pmol/àl 2

Pro Soy2R 10pmol/àl 2

ADN khuụn 100ng/ àl 5

Taq – polymerase 5U/ àl 0,5

Tổng thể tớch 25 àl

Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR được tiến hành theo chương trỡnh Bước 1: 940 C 3 phỳt Bước 2: 940 C 1 phỳt Bước 3: 560 C 1 phỳt Bước 4: 720 C 1phỳt 30 giõy Bước 5: 720 C 8 phỳt Bước 6: Lưu giữ ở 40

C

Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 30 chu kỳ.

Sản phảm PCR được điện di trờn gel agarose 1%

2.3.3. Phƣơng phỏp xử lý kết quả và tớnh toỏn số liệu

Mỗi thớ nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toỏn thống kờ để xỏc định trị số thống kờ như trung bỡnh mẫu ( x) , phương sai (2

), và sai số trung bỡnh mẫu (S x )

với n  30,  = 0,05. Cỏc số liệu được xử lý trờn mỏy vi tớnh bằng chương trỡnh Excel [15]. Xỏc định khoảng cỏch và thiết lập mối quan hệ giữa cỏc giống đậu tương bằng chương trỡnh NTSYS pc 2.02i.

Chƣơng 3

KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM HèNH THÁI, KHỐI LƢỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIấN CỨU

3.1.1. Đặc điểm hỡnh thỏi và khối lƣợng 1000 hạt

Bảng 3.1 trỡnh bày đặc điểm hỡnh thỏi của 7 giống đậu tương nghiờn cứu như: Hỡnh dạng hạt, màu sắc hạt, màu sắc rốn hạt, khối lượng 1000 hạt và kớch thước hạt. Màu sắc hạt gồm màu vàng, vàng nhạt, xanh, đen nhưng màu vàng là phổ biến hơn cả. Màu sắc rốn hạt gồm cú màu đen, nõu, nõu nhạt, đõy là một đặc tớnh quan trọng trong việc giỏm định giống. Hỡnh dạng hạt là một tớnh trạng tương đối ổn định, cỏc giống đậu tương nghiờn cứu đều cú hỡnh trứng, hỡnh oval với mức độ phồng, dẹp khỏc nhau.

Bảng 3.1. Hỡnh dạng, kớch thước, màu sắc, khối lượng 1000 hạt của cỏc giống đậu tương nghiờn cứu

STT Giống Màu sắc hạt Màu sắc rốn hạt Hỡnh dạng hạt Khối lượng 1000hạt(g) Kớch thước hạt Dài(mm) Rộng(mm) 1 CB4 Đen Đen Trứng 147,31 ± 0,09 5,10 ± 0,10 4,35 ± 0,08 2 HL Xanh Nõu Trứng 123,45 ± 0,09 5,05 ± 0,11 3,25 ± 0,07 3 QH Vàng Đen ễvan 87,58 ± 0,09 4,35 ± 0,05 3,10 ± 0,06 4 VCB Vàng nhạt Nõu nhạt ễvan 141,46 ± 0,09 5,09 ± 0,05 4,25 ± 0,04 5 TL Vàng Nõu ễvan 121,35 ± 0,06 4,95 ± 0,09 3,85 ± 0,06 6 ĐK Vàng

nhạt Nõu đen ễvan 117,51 ± 0,06 4,85 ± 0,09 3,50 ± 0,06 7 DT84 Vàng Nõu ễvan 165,14 ± 0,08 7,70 ± 0,05 6,70 ± 0,04

Bảng 3.1 và hỡnh 3.1 cho thấy cỏc giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng cú đặc điểm hỡnh thỏi rất đa dạng và phong phỳ, cú những giống cú đặc điểm rất khỏc với giống phổ biến, nhất là giống Cao Bằng 4 cú màu sắc hạt đen giống như hạt đỗ đen.

Hỡnh 3.1. Hạt của 7 giống đậu tương nghiờn cứu

1 – HL; 2 – CB4; 3 – VCB; 4 – QH; 5 –TL; 6 – ĐK; 7 - DT84

Khối lượng hạt là một chỉ tiờu quan trọng để đỏnh giỏ năng suất của giống.Cỏc giống đậu tương nghiờn cứu cú kớch thước và khối lượng hạt hoàn toàn khỏc nhau. Kết quả ở bảng 3.1 và hỡnh 3.1 cho thấy giống Cao Bằng 4 là giống cú khối lượng 1000 hạt cao nhất (147.31g ± 0.09), và cú kớch thước hạt lớn nhất (dài/rộng = 5,10/ 4,35) trong số cỏc giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng, giống cú khối lượng 1000 hạt thấp nhất là Quảng Hoà (87.58g ± 0.09) và kớch thước hạt cũng nhỏ nhất (dài/rộng = 4,35/ 3,10). Khối lượng 1000 hạt của cỏc giống đậu tương nghiờn cứu được sắp xếp theo thứ tự từ cao đến thấp như sau: DT84 > Cao Bằng4 > Vàng Cao Bằng> Hạ Lang Cao Bằng > Trà Lĩnh Cao Bằng > Đụng Khờ Cao Bằng > Quảng Hoà Cao Bằng.

3.1.2. Hàm lƣợng protein và lipit trong hạt của cỏc giống đậu tƣơng nghiờn cứu

Thành phần cỏc chất dinh dưỡng trong hạt đậu tương gồm: Lipit, protein, hydrat cacbon và cỏc chất khoỏng, vitamin nhưng cú hai thành phần quan trọng nhất

được sử dụng để đỏnh giỏ chất lượng hạt trờn phương diện hoỏ sinh là hàm lượng protein và hàm lượng lipit. Bảng 3.2 thể hiện kết quả phõn tớch hàm lượng protein và lipit của 7 giống đậu tương.

Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipit của 7 giống đậu tương

Giống Hàm lượng protein (% KL khụ ) Hàm lượng lipit (% KL khụ)

CB4 33,89 ± 0,08 15,24 ± 0,03 HL 32,56 ± 0,05 18,89 ± 0,04 QH 34,20 ± 0,07 17,05 ± 0,04 VCB 34,78 ± 0,06 15,16 ± 0,05 TL 35,18 ± 0,08 15,09 ± 0,04 ĐK 37,16 ± 0,09 14,18 ± 0,08 DT84 33,01 ± 0,20 17,55 ± 0,16

Trong cỏc cõy họ đậu, hạt đậu tương cú hàm lượng protein cao nhất. Protein là một trong hai chỉ tiờu quyết định chất lượng hạt của đậu tương. Đậu tương thuộc loại cung cấp nhiều protein hơn là lipit. Mặc dự điều kiện canh tỏc và yếu tố bất lợi của ngoại cảnh cú thể làm ảnh hưởng đến năng suất của đậu tương, song hàm luợng protein của hạt đậu tương vẫn cao hơn hàm lượng protein của cỏc loại ngũ cốc khỏc.

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy hàm lượng protein của cỏc giống dao động trong khoảng 32,56% – 37,16%. So với hàm lượng protein của cỏc giống đậu tương ở Nepal (42% - 45%), ở Bắc Mỹ (39%) thỡ hàm lượng protein của cỏc giống trờn thuộc vào loại trung bỡnh. Hàm lượng protein thay đổi tựy theo giống, chế độ bún phõn và mựa vụ của cõy trồng. Giống Đụng Khờ cú hàm lượng protein cao nhất trong cỏc giống địa phương của tỉnh Cao Bằng (37,16%), giống Hạ Lang cú hàm lượng protein thấp nhất (32,56%).