Khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng vi khuẩn sinh bào tử

Khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng vi khuẩn sinh bào tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

–&—

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN SINH BÀO TỬ

GVHD: ThS Nguyễn Kim Minh Tâm SVTH: Hồ Thị Mỹ Linh

MSSV: 60701279

Tp HCM, tháng 01 năm 2012

LỜI CẢM ƠN

Luận văn đề tài “Khảo sát khả năng sinh amylase ngoại bào của một số chủng vi khuẩn sinh bào tử” được thực hiện từ tháng 9/2011 đến tháng 1/2012 Trong suốt quá trình làm luận văn tôi đã được rất nhiều sự giúp đỡ của:

Thạc sĩ Nguyễn Kim Minh Tâm – Bộ môn Công nghệ Sinh học trường đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn, cung cấp tài liệu và luôn động viên tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn

Các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô giáo trong khoa Kỹ thuật Hóa học Đại học Bách Khoa TpHCM đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức cơ bản để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn

Cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108 và 117 Bộ môn công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử dụng trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Cán bộ phòng thí nghiệm Hữu cơ – Bộ môn Kỹ thuật Hóa hữu cơ, Đại học Bách khoa TpHCM đã cho mượn một số dụng cụ thí nghiệm

Cha, mẹ, anh và em tôi đã động viên tinh thần, giúp đỡ về mặt kinh tế để tôi

có thể an tâm thực hiện luận văn

Các bạn thân và các bạn sinh viên lớp HC07BHS – Đại học Bách Khoa TpHCM – đã cùng tôi học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc

Xin gửi đến những người trên lời cảm ơn chân thành!

TÓM TẮT

Enzyme amylase giúp phân hủy tinh bột hay glycogen, nó rất hữu ích trong nhiều lĩnh vực công nghiệp như thực phẩm, dệt, giấy và y học… Amylase được thu nhận từ nhiều nguồn: động vật, thực vật và vi sinh vật, trong đó amylase từ vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất Trong đất, có rất nhiều loài vi sinh vật có ích có khả năng sinh amylase Do đó, việc phân lập được chúng là bước đầu quan trọng hỗ trợ cho các nghiên cứu về sau Bằng quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã phân lập được một chủng vi khuẩn sinh bào tử có khả năng sinh amylase từ trong đất và khảo sát hoạt tính enzyme amylase của chúng Kết quả thu được cho thấy chủng vi khuẩn này có thể sinh trưởng và phát triển tốt ở 370C và môi trường pH7 Thời gian nuôi cấy để lượng enzyme sinh ra cao nhất là 24 giờ, trong môi trường có 2% tinh bột, nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme trong khoảng 50-700C

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN I TÓM TẮT II MỤC LỤC III DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC BIỂU ĐỒ VIII

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN 3

1.ĐỊNHNGHĨAVỀENZYME 3

1.1 Enzyme ngoại bào 3

1.2 Enzyme nội bào 3

2.ENZYMEAMYLASE 3

2.1 Định nghĩa 4

2.2 Phân loại 4

2.3 Một số enzyme amylase phổ biến 5

3.NGUỒNTHUNHẬNENZYMEAMYLASE 11

4.ỨNGDỤNGCỦAAMYLASETRONGTHỰCTẾĐỜISỐNGVÀSẢNXUẤT 12

4.1 Ứng dụng của amylase trong công nghệ thực phẩm 12

4.2 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác 14

5.CÁCYẾUTỐẢNHHƯỞNGĐẾNQUÁTRÌNHSINHTỔNGHỢPAMYLASE ỞVISINHVẬT 15

5.1 Nhiệt độ 15

5.2 pH môi trường 16

5.3 Độ thông khí 16

VẬT 17

6.1 Nhiệt độ 17

6.2 pH 18

7.MỘTSỐPHƯƠNGPHÁPXÁCĐỊNHHOẠTTÍNHCỦAAMYLASE 18

7.1 Xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp Wolhgemuth 19

7.2 Phương pháp Heinkel 19

7.3 Phương pháp xác định đường khử tạo thành (phương pháp Nelson) 19

8.PHÂNLẬPVIKHUẨNSINHBÀOTỬCÓKHẢNĂNGSINHAMYLASE 20

8.1 Phân lập vi khuẩn 20

8.2 Đặc điểm của chi vi khuẩn cần phân lập 20

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

1. VẬTLIỆUNGHIÊNCỨU 23

1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

1.2 Môi trường thí nghiệm 23

1.3 Vật liệu thử hoạt tính sinh học 24

1.4 Dụng cụ thí nghiệm 25

2.BỐTRÍTHÍNGHIỆM 26

2.1 Giai đoạn 1 27

2.2 Giai đoạn 2 27

2.3 Giai đoạn 3 27

2.4 Giai đoạn 4 28

3.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 28

3.1 Phương pháp phân lập 28

3.2 Phương pháp kiểm tra khả năng sinh amylase của vi khuẩn 30

3.3 Phương pháp khảo sát khả năng thích nghi của vi khuẩn 31

3.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase ngoại bào của vi khuẩn 31

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

1.PHÂNLẬPVIKHUẨNSINHAMYLASE 35

2.KHẢOSÁTCÁCYẾUTỐẢNHHƯỞNGĐẾNKHẢNĂNGSINHAMYLASE CỦACÁCCHỦNGVIKHUẨN 39

3.KHẢOSÁTNHIỆTĐỘHOẠTĐỘNGTỐIƯUCỦAAMYLASE 45

4.BÀNLUẬN 47

KẾT LUẬN 35

PHỤ LỤC 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

TÀILIỆUTIẾNGVIỆT 54

TÀILIỆUTIẾNGANH 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Cách thực hiện giai mẫu để xác định đường chuẩn tính hoạt độ amylase 32Bảng 2 Các bước pha mẫu để xác định hoạt độ amylase 33Bảng 3 Khả năng sinh amylase ngoại bào và khả năng thích nghi với môi trường của một số chủng vi sinh vật phân lập được 35Bảng 4 Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 19 theo thời gian 39Bảng 5 Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 20 theo thời gian 40Bảng 6 Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 21 theo thời gian 41Bảng 7 Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 24 theo thời gian 42Bảng 8 Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 25 theo thời gian 43Bảng 9 So sánh hoạt tính amylase cực đại của các chủng vi khuẩn 44Bảng 10 Kết quả khảo sát hoạt tính của amylase từ chủng 20 trên tinh bột ở những nhiệt độ khác nhau 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Sơ đồ cấu trúc không gian của α–amylase 5Hình 2 Sơ đồ cấu trúc không gian của β – amylase 8Hình 3 Sơ đồ cấu trúc không gian của enzyme γ – amylase 10Hình 4 Kết quả khảo sát sơ bộ khả năng sinh amylase ngoại bào của một số chủng

vi khuẩn 37Hình 5 Khảo sát sự phát triển của các chủng vi khuẩn trên môi trường có pH khác nhau 37Hình 6 Khảo sát sự phát triển của các chủng vi khuẩn ở nhiệt độ khác nhau 38Hình 7 Kết quả so sánh khả năng sinh amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn 38

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1 Đường chuẩn định lượng tinh bột bằng phương pháp Heinkel 33

Biểu đồ 2 Hoạt tính amylase của chủng 19 theo thời gian 40

Biểu đồ 3 Hoạt tính amylase của chủng 20 theo thời gian 41

Biểu đồ 4 Hoạt tính amylase của chủng 21 theo thời gian 42

Biểu đồ 5 Hoạt tính amylase của chủng 24 theo thời gian 43

Biểu đồ 6 Hoạt tính amylase của chủng 25 theo thời gian 44

Biểu đồ 7 Hoạt tính amylase cực đại của các chủng vi khuẩn khảo sát 45

Biểu đồ 8 Hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 20 ở các nhiệt độ khác nhau 46

MỞ ĐẦU

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú, chúng có mặt ở khắp mọi nơi trong đất, nước, không khí… Ngoài những tác hại như gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của con người và động thực vật, vi sinh vật còn mang lại một nguồn lợi to lớn nếu chúng ta hiểu biết và sử dụng chúng hợp lý Các loài vi sinh vật nói chung

và các loài sinh bào tử nói riêng đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rất nhiều trong các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, công nghiệp và y học… nhờ khả năng sản sinh các loại enzyme thủy phân của chúng

Enzyme là chất xúc tác sinh học, ngoài tính chất của một chất xúc tác nó còn đặc biệt hơn ở chỗ chúng có khả năng xúc tác ở nhiệt độ và áp suất bình thường, có tính đặc hiệu cao Chính vì thế, enzyme ngày càng được sử dụng rộng rãi với quy

mô sản xuất lớn, dẫn đến việc hình thành và phát triển công nghệ enzyme Việc sử dụng enzyme không chỉ mang lợi ích về kinh tế mà còn góp phần giải quyết hiệu quả việc làm sạch và bảo vệ môi trường

Trước kia, enzyme thường được khai thác chủ yếu ở thực vật và động vật, như amylase từ malt, papain từ đu đủ hay các protease từ động vật… Tuy nhiên, việc thu nhận enzyme từ hai nguồn này còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như thời tiết, bệnh tật, năng suất và hơn hết đây chưa phải là sản phẩm chính của ngành trồng trọt

và chăn nuôi của nước ta Vì vậy, việc dùng tế bào động vật và thực vật làm nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme khá hạn chế, thiếu tính kinh tế và khó nâng lên quy

mô công nghiệp

Khắc phục được các nhược điểm trên, enzyme từ vi sinh vật trở thành nguồn thu nhận lý tưởng nhờ hệ enzyme phong phú, nguyên liệu nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm, điều kiện nuôi cấy dễ dàng và đặc biệt enzyme lại có hoạt tính cao Các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật dần thay thế cho các enzyme có nguồn gốc động vật và thực vật

Một trong số các enzyme được ứng dụng nhiều nhất là enzyme amylase Nó xúc tác thủy phân tinh bột thành các đơn vị nhỏ hơn Được nghiên cứu từ những năm đầu thế kỉ 18, đến nay, các nhà khoa học đã biết khá rõ về amylase Sản xuất

amylase công nghiệp đã được chú ý từ rất lâu và ngày càng được phát triển trên thế giới Việt Nam chúng ta cũng là một trong những nước đã và đang có rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng amylase trong công nghiệp, tuy nhiên nền công nghiệp sản xuất enzyme ở nước ta vẫn chưa thực sự phát triển

Xuất phát từ các cơ sở trên, việc chọn được những chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh ra amylase có hoạt tính cao, ứng dụng được trong công nghiệp là một vấn đề hết sức cần thiết

w Mục tiêu cần đạt

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành phân lập và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng vi khuẩn sinh bào tử, xác định hoạt tính amylase thu được để làm tiền đề cho các nghiên cứu về sau

w Nội dung nghiên cứu

Bao gồm nội dung chính:

- Phân lập và tuyển chọn các chủng sinh bào tử có khả năng sản sinh amylase hoạt tính cao trong môi trường đất

- Nghiên cứu hình thái khuẩn lạc, hình thái bào tử của các chủng tuyển chọn

- Khảo sát thời gian nuôi cấy để thu được enzyme có hoạt tính cao

- Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel

- Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme thu được

TỔNG QUAN

cơ chất

1.1 Enzyme ngoại bào [3]

Enzyme tiết vào môi trường xung quanh để phân hủy các cơ chất có cấu tạo cao phân tử, biến những chất này thành những chất có phân tử thấp mà vi sinh vật

có thể đồng hóa được Đây là những enzyme ngoại bào Ví dụ: protease thủy phân protein và polypeptid thành acid amin; amylase thủy phân tinh bột thành maltose và glucose…

1.2 Enzyme nội bào [3]

Enzyme tạo ra trong tế bào cơ thể sống để xúc tác các phản ứng nội bào Muốn thu được các enzyme này ta cần phải phá vỡ cấu trúc tế bào của nó

khoa học người Pháp là Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột đó từ đại mạch nảy mầm Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dịch chiết malt và thu được enzyme ở dạng bột đồng thời đặt tên là diaslase (theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là phân giải) Sau này, theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase [3]

Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn [3] Trong đó, amylase từ vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất nhờ những đặc điểm ưu việt của chúng

Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đặt nền móng cho việc sản xuất các chế phẩm enzyme này và là cơ sở để sử dụng chúng trong sản xuất và đời sống Hiện nay, kỹ thuật nghiên cứu về enzyme amylase đã hoàn thiện hơn và mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới trong việc ứng dụng amylase trong các ngành kinh tế quốc dân

2.1 Định nghĩa [3][10]

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

- Khử gián tiếp là transglucosylase và amylo-1,6-glucosidase

Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

2.3 Một số enzyme amylase phổ biến [3][20]

2.3.1 Enzym α–amylase (EC 3.2.1.1) hay 4-α-D-glucan glucanohydrolase

Hình 1 Sơ đồ cấu trúc không gian của α–amylase [20]

α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn α-amylase phân cắt tinh bột ở vị trí ngẫu nhiên trên chuỗi carbohydrate, sản phẩm cuối cùng là các maltotriose và maltose từ amylose hoặc maltose, glucose và "dextrin giới hạn" từ amylopectin

Nó có thể hoạt động ở bất kì vị trí nào trên cơ chất, do đó xu hướng tác động của α-amylase nhanh hơn so với β-amylase

Ở động vật, α-amylase là enzyme tiêu hóa chính và pH tối ưu là 6.7-7.0 Đối với con người, α-amylase được tìm thấy trong nước bọt và trong tuyến tụy Ngoài

ra, nó còn được tìm thất trong thực vật, nấm (Ascomycetes và Basidiomycetes) và vi khuẩn (Bacillus)

2.3.1.1 Cơ chế tác dụng

Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn:

- Giai đoạn dextrin hóa: chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

Tinh bột à dextrin phân tử lượng thấp

- Giai đoạn đường hóa: các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide

Dextrin à tetra- và trimaltose à di- và monosaccharide

Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide (gồm 6-7 gốc glucose) Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose

Amylose à oligosaccharide à polyglucose à maltotetrose à maltotriose à maltose

Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6- glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α- amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì

vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

2.3.1.2 Đặc tính

α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp đặc hiệu riêng α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme α-amylase có ít methionine và có khoảng 7 – 10 gốc cysteine

Trọng lượng phân tử của α- amylase malt: 59.000 kDa (Knin 1956; Fisher, Stein, 1960)

Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4.2 – 5.7 (Bernfeld P., 1951)

α-amylase là một metaloenzyme Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme Ca còn có vai trò duy trì

sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+ Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+,

Ag+, Hg2+…

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau Biên độ pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với α-amylase từ vi sinh vật

Ví dụ: pH tối thích cho α-amylase từ malt là 5.3 (khoảng hoạt động từ pH 5.4), α-amylase từ nấm sợi là 4.8 (khoảng hoạt động từ pH từ 4.5-5.8)

4.7-Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau

Ví dụ: α-amylase của A.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn B.subtilis

Độ bền của α-amylase cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH Tuy nhiên, so với các loại enzyme amylase khác thì α-amylase có độ bền nhiệt hơn

Ví dụ: Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt Nhiệt độ tối thích của nó là 50o

C và bị vô hoạt ở 70oC (Kozmina, 1991)

Trong dung dịch đệm pH= 4,7 thì α-amylase của A.oryzae rất nhạy với tác động của

nhiệt độ cao, thậm chí ở 40oC trong 3 giờ hoạt tính dextrin hóa của nó chỉ còn 29%, hoạt tính đường hóa còn 27-85% Ở 50oC trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự)

22-2.3.2 Enzyme β – amylase (EC 3.2.1.2) hay 4-α -D-glucan maltohydrolase

Hình 2 Sơ đồ cấu trúc không gian của β – amylase [20]

β–amylase được tổng hợp từ vi khuẩn, nấm và thực vật β–amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh các liên kết α-1,4-glucoside trong tinh bột, glycogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch Maltose tạo thành do sự xúc tác của β–amylase có cấu hình β

Trong quá trình chín của trái cây, β–amylase thủy phân tinh bột thành đường maltose tạo vị ngọt cho trái Cả α-amylase và β-amylase đều có mặt trong hạt

giống nhưng β-amylase hoạt động trước khi hạt nảy mầm, trong khi đó amylase xuất hiện khi hạt đã nảy mầm

α-2.3.2.1 Cơ chế tác dụng:

β–amylase xúc tác từ đầu không khử của mạch, thủy phân các liên kết glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng

1,4-Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết 1,6-glucoside, gọi là β–dextrin

α-Tác dụng của β–amylase lên tinh bột như sau:

Tinh bột à maltose (54-58 %) + β–dextrin (42-46 %) Nếu tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α-amylase và β–amylase thì lượng tinh bột bị thủy phân lên tới 95%

2.3.2.2 Đặc tính

β–amylase là một albumin, tâm phản ứng có chứa nhóm –SH, nhóm –COOH

và vòng imidazol của các gốc histodine

β–amylase không bền khi có Ca2+, β–amylase bị kìm hãm bởi Cu2+

, urea, iodoacetamide, iodin, ozon…

β–amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid hơn β–amylase

bị bất hoạt ở nhiệt độ 70 oC Nhiệt độ hoạt động tối thích là 55 oC, pH 5.1-5.5

2.3.3 Enzyme γ - amylase (EC 3.2.1.3) hay 4- α-D-glucan glucohydrolase

Hình 3 Sơ đồ cấu trúc không gian của enzyme γ – amylase

γ - amylase có khả năng thủy phân liên kết α -1,4 lẫn α-1,6-glucoside từ đầu không khử của mạch

Ngoài ra, γ - amylase còn có khả năng thủy phân liên kết α -1,2-glucoside và α -1,3-glucoside Do đó, nó có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin… thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại enzyme amylase khác

γ – amylase hoạt động hiệu quả trong môi trường acid, pH 3.5-5.5, ở nhiệt độ

50 oC Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, aceton

2.3.4 Pullulanase (EC 3.2.1.41) hay α-dextrin 6–glucosidase

Pullulanase có khả năng thủy phân liên kết α -1,6-glucoside trong các polyose

và oligosaccharide kiểu tinh bột và glucogen

Cơ chất đặc trưng của enzyme này là pullulan-một polysaccharide tách ra từ

giả nấm men Aureobasidium pullulana

Phân tử lượng là 145.000 Da, pH hoạt động tối ưu là pH = 5, nhiệt độ tối ưu là 47.5 oC

2.3.5 Transglucosyldase (EC 2.4.1.3) hay 4-α-glucanotransferase

Trans-glucosyldase có cả hoạt tính tranferase lẫn hoạt tính thủy phân Nó thực hiện việc chuyển các gốc glucosyl sang nhóm mono, di- và oligosaccharide, xúc tác tạo thành các liên kết α -1,4 và α -1,6 glucoside

Trans-glucosyldase không những thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izotriose và panose, tức là khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác nhau bằng liên kết α -1,6 glucoside thành panose và izomaltose

3 NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE [3][20]

Amylase có trong nhiều nguồn khác nhau như động vật (enzyme pancreatic trong tụy tạng), thực vật (malt đại mạch, tiểu mạch, lúa, ngô…) và vi sinh vật

So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có những ưu thế quan trọng như:

- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh

- Enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao, có khả năng chuyển hóa khối lượng vật chất rất lớn

- Nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẻ tiền và dễ kiếm

- Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết và điều kiện địa lý như nuôi, trồng động vật và thực vật

- Hoàn toàn có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất

Do đó nó đã trở thành đối tượng được quan tâm và nghiên cứu nhiều nhất để thu nhận enzyme

Những chủng vi sinh vật sinh nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn trong tự nhiên Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi,

Vi khuẩn thường sử dụng các chủng như Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis, Baccillus diastaticus, Bacillus stearothemophilus, Bacillus circulans…

Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus và Rihzopus… Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces,

Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylase

Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng

có một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt như Micromonospora vugaris có khả năng tạo

một lượng nhỏ α-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và các enzyme khác

4 ỨNG DỤNG CỦA AMYLASE TRONG THỰC TẾ ĐỜI

SỐNG VÀ SẢN XUẤT [2][3]

Ngày nay do nhận thấy được các nhược điểm của việc thủy phân bằng acid như gây hư tổn thiết bị, gây ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm cũng như sức khỏe con người, do đó amylase trở thành nguồn enzyme chủ đạo để tham gia các quá trình thủy phân quan trọng trong các quá trình sản xuất công nghiệp đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm

4.1 Ứng dụng của amylase trong công nghệ thực phẩm

4.1.1 Ứng dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì

Trong sản xuất bánh mì, người ta sử dụng cả α-amylase và β–amylase Các enzyme này tham gia thủy phân tinh bột thành đường Nhờ đó, nấm men

Saccharomyces cerevisiae dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn, CO2 làm tăng thể tích bánh và tạo ra hương vị, màu sắc tốt cho bánh

4.1.2 Ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo

Mục đích đưa enzyme vào sản xuất bánh quy là làm tăng mùi vị của bánh Amylase hoạt động làm tăng lượng đường khử, đường này sẽ tham gia phản ứng oxy hóa khử và kết quả tạo bánh quy có màu và mùi hấp dẫn

4.1.3 Ứng dụng trong sản xuất bia

Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử dụng enzyme amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai

đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces sp

Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm (malt), enzyme amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng

và vật chất cho sự tạo thành mầm Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ enzyme của chính nó Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra lượng enzyme amylase vừa đủ để phân hủy lượng tinh bột có trong hạt Như thế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở qui mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm

Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xuất không

sử dụng hoàn toàn 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một công thức nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá trình lên men Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm enzyme amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột Enzyme này có ý nghĩa rất lớn trong việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mô công nghiệp

4.1.4 Ứng dụng trong sản xuất siro

Ứng dụng trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường- phôi bắp được xử

lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm, ra khỏi khối bột bằng li tâm Enzyme amylase chỉ được sử dụng sau khi tinh bột hòa vào nước

Ngoài tinh bột bắp, người ta còn sử dụng tinh bột khoai tây, tinh bột mì, tinh bột sắn Tùy theo nguồn nguyên liệu tinh bột mà người ta áp dụng kĩ thuật khác nhau cho phù hợp

Enzyme sử dụng trong công nghệ sản xuất siro phải là những enzyme chịu

nhiệt, những enzyme này thường được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis,

Bacillus stearothermophilus

Đặc điểm quan trọng nhất của enzyme amylase là chúng hoạt động ở pH gần trung tính (pH=6), đặc điểm này giúp thực hiện các quá trình đường hóa rất dễ dàng

4.2 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác [3]

4.2.1 Ứng dụng trong công nghiệp dệt

Sau khi vải được hồ hóa để làm mịn, người ta phải tiến hành quá trình rũ hồ vải Phương pháp làm sạch hồ tinh bột được sử dụng là enzyme amylase

Trước đây, người ta sử dụng enzyme a-amylase của malt hay pancreatic amylase Để phá hủy nhanh lượng tinh bột thừa, người ta đưa nhiệt độ đến nhiệt độ sôi sau đó làm giảm xuống 50°C hay 60°C và cho enzyme amylase vào

Ngày nay người ta sử dụng a-amylase của vi khuẩn Enzyme amylase của vi khuẩn chịu nhiệt cao, chúng hoạt động mạnh ở nhiệt độ 85°C-90°C Một số enzyme

amylase của Bacillus subtilis có khả năng hoạt động ở 105°C-115°C

Tuy nhiên còn tùy thuộc vào điều kiện kinh tế, sản xuất, nguồn amylase mà người ta tiến hành chọn lựa enzyme rũ hồ vải cho phù hợp

4.2.2 Ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa

Chất tẩy rửa bao gồm những chất kiềm, sodium silicate, sodium bicarbonate, sodium tripolyphosphate

Enzyme α-amylase của vi khuẩn là một trong những enzyme thường được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, do enzyme này có khả năng chịu nhiệt cao (khoảng 90°C), pH cao (pH = 9) [3]

Tuy nhiên, enzyme này không bền pH kiềm và nhiệt độ cao trong một thời gian lâu, nên người ta thường bao chúng lại trước khi phối trộn với các thành phần khác của chất tẩy rửa để bảo quản được lâu và đảm bảo khả năng hoạt động của chúng

Enzyme α-amylase làm tăng khả năng phân giải các vết bẩn do carbonhydrat trong quần áo

4.2.3 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy

Việc sử dụng enzyme để khử mực giấy loại trên thế giới đã có thăm dò theo nhiều hướng và một số chủng vi sinh, theo các công bố gần đây nhất cho thấy, enzyme α-amylase đang có khả năng thúc đẩy quy trình khử mực tốt

Nguyên lý hoạt động của enzyme là: chúng bẻ gãy các mạch tinh bột trên mặt giấy, kéo theo sự các phân tử mang màu bám trên đó, tạo thuận lợi cho quá trình tuyển nổi khử mực

5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH

TỔNG HỢP AMYLASE Ở VI SINH VẬT [2][3]

5.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật cũng như tính chất của enzym được tổng hợp Mỗi loài vi sinh vật có một khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp khác nhau Nói chung đa số vi sinh vật tổng hợp enzym không bền với nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp, enzyme của vi khuẩn có khoảng nhiệt độ hoạt động rộng hơn của nấm sợi

5.2 pH môi trường

pH môi trường có tác động trực tiếp lên sự phát triển của vi sinh vật, nó làm thay đổi điện tích trên bề mặt tế bào cũng như ức chế phần nào các enzyme trên bề mặt tế bào

Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, pH môi trường có ảnh hưởng ít do môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi Vì vậy, nên tạo pH ban đầu thích hợp với vi sinh vật nuôi

Hầu hết các loài vi sinh vật sinh tổng hợp amylase phát triển trong các điều kiện môi trường trung tính, acid yếu hay kiềm yếu

5.3 Độ thông khí

Độ thông khí ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tổng hợp amylase Trong một số trường hợp, thiếu oxy tuy có kìm hãm sự sinh trưởng vi sinh vật nhưng lại tăng quá trình tổng hợp amylase Một số trường hợp khác, sự hiếu khí lại kìm hãm sự tổng hợp amylase

5.4 Thành phần môi trường

5.4.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng

Nguồn nitơ trong môi trường dinh dưỡng có thể là muối vô cơ hay chất hữu cơ chứa nitơ Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi vi sinh vật tạo amylase người ta dùng muối vô cơ Tùy vào đặc điểm sinh trưởng mà mỗi loài vi sinh vật cần loại muối vô cơ thích hợp để tạo amylase nhiều nhất

Nguồn nitơ nhất định được bổ sung vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Theo mức độ tiêu thụ muối, môi trường bị acid hóa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức chế tổng hợp α- amylase

5.4.2 Ảnh hưởng của amino acid

Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme Amino acid có tác dụng tốt với sinh lý vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp amylase do:

- Nó vừa là nguồn carbon, nguồn nitơ và nguồn năng lượng

- Một số amino acid riêng lẻ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp amino acid khác hay trong quá trình chuyển amin hóa Nhờ một số amino acid như glutamic acid và aspartic acid mà thực hiện đồng hóa dị dưỡng

CO2

Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme, một số tăng cường cảm ứng sinh amylase, một số khác lại ức chế quá trình này

5.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng

Các nguyên tố vi lượng và đa lượng có ảnh hưởng lớn tới sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme amylase của vi sinh vật Trong các cấu tử vô cơ trong môi trường

nuôi cấy B subtilis và vi sinh vật khác cho hoạt lực amylase cao cần có muối của

mangan, kẽm cùng một số nguyên tố vi lượng khác

6 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH

AMYLASE CỦA VI SINH VẬT [3][10][20]

6.1 Nhiệt độ

Amylase có khoảng nhiệt độ hoạt động tương đối rộng Amylase của nấm hoạt động ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ của amylase vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn chịu nhiệt có thể hoạt động ở 95 – 1050C.[3]

Nhiệt độ tối ưu của vi khuẩn Bacillus trong khoảng 70 – 750C.[3]

Amylase của vi khuẩn là bền nhiệt hơn cả, nó có thể chịu được nhiệt độ 920C, trong khi đó amylase của nấm sợi bị vô hoạt ở 700C

6.2 pH

Hoạt độ amylase phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường do pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, trung tâm hoạt động của enzyme phức chất giữa enzyme và cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Đa số amylase vi khuẩn bền ở pH trung tính 6,5-7,0 Amylase nấm sợi có pH tối ưu khoảng 4.5 – 4.7.[3]

7 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA

AMYLASE [3][4][5]

Khi sử dụng bất kì chế phẩm enzyme nào chúng ta cần phải biết rõ hoạt lực xúc tác của nó Enzyme amylase có tác dụng phân giải tinh bột, vì vậy hoạt lực của chúng phản ảnh hoạt lực của tác dụng của tất cả các amylase có trong chế phẩm Tuy nhiên, tùy vào cơ chất và phương pháp xác định mà người ta có thể biết được

sự có mặt của enzyme nào đó trong chế phẩm bằng cách gián tiếp

Để đo hoạt tính của amylase người ta có thể dùng một trong các phương pháp sau:

- Đo độ biến thiên của tinh bột bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ tinh bột, khi đó các phân tử của cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của dung dịch giảm dần

- Đo mật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng với dung dịch iodine Khi có amylase tác dụng, các sản phẩm phân giải khác nhau sẽ cho màu khác nhau khi tác dụng với iodine

- Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng với cơ chất

Sau đây là một số phương pháp hay được sử dụng

7.1 Xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp

Wolhgemuth

Phương pháp này xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn lượng tinh bột với chất chỉ thị màu iodine

Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 300C, khi

có ion clorua, có thể phân giải một mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu với iodine

Hoạt tính của enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị Wolhgemuth/ml môi trường hoặc 1 ml dịch chiết enzyme

Sau khi tinh bột bị thủy phân bởi α – amylase ở những điều kiện xác định, đun hỗn hợp muối đồng hóa trị II để tạo thành kết tủa Cu2O Hòa tan kết tủa trong thuốc thử asenomolybden sẽ được dung dịch có màu xanh da trời, so màu ở bước sóng

660 nm rồi đối chiếu với đường chuẩn để tính ra lượng đường khử

Đơn vị hoạt động của enzyme trong phương pháp này được định nghĩa là lượng enzyme có thể phân giải được tinh bột trong 30 phút ở 300C cho ra lượng đường khử tương đương 1µmol glucose

8 PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH BÀO TỬ CÓ KHẢ NĂNG

SINH AMYLASE

8.1 Phân lập vi khuẩn [5][7]

Phân lập một vi sinh vật là quá trình tách riêng vi sinh vật đó từ mẫu hay từ quần thể vi sinh vật ban đầu để thu nhận giống thuần khiết Giống vi sinh vật thuần khiết rất quan trọng trong công nghệ sinh học, chúng chỉ gồm các tế bào sinh ra từ

tế bào ban đầu Hầu hết các ứng dụng trong công nghệ sinh học đều liên quan đến việc sử dụng giống thuần

Phần lớn các phương pháp phân lập giống thuần khiết đều dựa vào các kỹ thuật pha loãng, thường gồm các bước chính như sau: chuẩn bị mẫu, tăng sinh mẫu (nếu số lượng tế bào trong mẫu vi sinh vật có số lượng rất ít), pha loãng mẫu, cấy mẫu lên môi trường thạch đĩa thích hợp, ủ mẫu, kiểm tra và phát hiện khuẩn lạc đặc trưng, chọn khuẩn lạc đặc trưng đem tạp giống thuần và kiểm tra giống thuần

Việc kiểm tra giống thuần được thực hiện bằng nhiều cách như kiểm tra vết cấy, kiểm tra bằng kính hiển vi hay bằng phương pháp cấy trang, hay kiểm tra bằng phương pháp cấy ria Trong đó, việc kiểm tra bằng phương pháp cấy trang hay cấy ria được coi là phương pháp tiện lợi và có ý nghĩa nhất Trên các vạch tạo thành trên

bề mặt môi trường các đĩa này, giống vi sinh vật được xem là thuần khiết nếu có duy nhất một khuẩn lạc có hình thái y hệt các khuẩn lạc được phân lập ở đĩa thứ nhất (đĩa phân lập)

8.2 Đặc điểm của chi vi khuẩn cần phân lập [1][5][7]

Do các ưu điểm của amylase từ vi sinh vật đã nêu ở trên, người ta tiến hành

thu amylase từ vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn Bacillus

Chi Bacillus bao gồm 60 loài, thường được tìm thấy trong tự nhiên và được sử

dụng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Bacillus là loài trưc khuẩn Gram dương, thường xếp thành cặp hay thành

chuỗi, có một bào tử duy nhất Bào tử hình bầu dục giúp vi khuẩn chống lại điều kiện khắc nghiệt của môi trường, nhưng bào tử không ngăn sự tiếp xúc với không

khí Các loài vi khuẩn Bacillus được chia thành ba nhóm dựa trên hình thái của bào

tử và vỏ bào tử như sau:

- Nhóm 1: Gram dương, hình thành bào tử ở trung tâm hay ở cuối, hình elip, bào tử hình trụ không làm phình vỏ bào tử

- Nhóm 2: Gram dương, hình elip, túi bào tử bị phình lên

- Nhóm 3: Gram dương, túi bào tử phình ở phía cuối bào tử hay ở tận cùng 2 đầu

Theo nhiều nghiên cứu đã phát hiện khả năng sinh amylase của chi vi khuẩn

Bacillus, trong đó được biết đến nhiều nhất là B.subtilis, B lichenformis, B strepmophilis… Chúng có thể sản xuất ra lượng amylase tương đối cao và có hoạt

Bacillus subtilis thuộc nhóm 1 của loài Bacillus (bào tử không làm phình tế

bào lên, màng bào tử mỏng)

Bacillus subtilis có hình que, ít khi xếp thành chuỗi dài, đồng thể khi nhuộm

Kích thuớc 0,7-0,8 x 2-3 mm Tiêm mao nằm lệch một bên Nội bào tử 0,8-1,5 mm,

bề mặt bào tử bắt màu yếu khi nhuộm, hình thành từ giữa tế bào dinh dưỡng Khi nẩy mầm, lớp vỏ bào tử nứt theo hướng xích đạo Sau khi tế bào dinh dưỡng hình thành, lớp vỏ bào tử tiêu dần

Trên môi trường pepton-agar, khuẩn lạc hình tròn hay không đều, dày và đục,

bề mặt có thể nhăn nheo, màu kem hoặc nâu Đặc điểm của khuẩn lạc thay đổi tùy theo thành phần môi trường Nếu bề mặt môi trường thạch ẩm, vi khuẩn có thể mọc lan ra

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, không sinh trưởng được ở môi

trường kỵ khí, lên men glucose sinh acid và acetoin

- Loài: Bacillus licheniformis

Đây là một loại vi khuẩn thường được tìm thấy trong đất và lông chim Thường có nhiều ở các loại gia cầm như vịt, vi khuẩn thường được tìm thấy ở khu vực xung quanh ngực và bộ lông

B lichenformis có hình que, là vi khuẩn gram dương Nó có thể tạo bào tử

trong đất, do đó rất thích hợp cho việc sản xuất các sản phẩm phục vụ trong công

nghiệp như enzyme, chất kháng sinh hay tham gia vào các chu trình dinh dưỡng trong tự nhiên

PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn sinh bào tử được phân lập từ đất nông nghiệp ở Đà Lạt và đất ao nuôi tôm ở Bến Tre

1.2 Môi trường thí nghiệm

1.2.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sinh bào tử

w Môi trường DSM (Difco Sporulation Medium)