Phân lập vi khuẩn bacillus subtils từ phân heo, khảo sát khả năng ứng chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được
CHƯƠNG I MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Trên giới nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc độc tố nấm lương thực, thực phẩm vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ người vật nuôi Độc tố aflatoxin chủ yếu loài vi nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus tạo ra, độc tố nguy hiểm thường nhiễm nông sản, gây độc cho người gia súc Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm không khí thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa phương tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô thoáng mát điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm thức ăn chăn nuôi Một số phương pháp vật lý (phân hủy không khí nóng, nhiệt, tia xạ) hóa học (sử dụng chất oxy hóa khử, kiềm, khí NH 3) áp dụng để ngăn ngừa sản sinh aflatoxin thực phẩm thức ăn gia súc Tuy nhiên, hầu hết phương pháp không phổ biến rộng rãi chi phí cao khó thực hiện, làm giá trị dinh dưỡng sản phẩm, chất lượng cảm quan Một xu hướng áp dụng phương pháp vi sinh vật học Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer, Rhizopus arhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus), nấm men (Saccharomyces cerevisiae), xạ khuẩn thử nghiệm khả làm giảm aflatoxin thu kết khả quan Được cho phép Khoa Chăn Nuôi Thú y hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải, tiến hành đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtils từ phân heo, khả sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng phân lập được” Mục tiêu: Đánh giá khả ức chế aflatoxin Bacillus subtilis Yêu cầu - Phân lập định danh vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo - Đánh giá khả ức chế aflatoxin Bacillus subtilis CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1 Lịch sử phát Bacillus subtilis phát phân ngựa năm 1941 tổ chức y học Nazi Đức Lúc đầu sử dụng chủ yếu để phòng bệnh lỵ cho binh sĩ Đức chiến đấu Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến năm 1949 - 1957, Henrry cộng tách chủng khiết Bacillus subtilis Từ “subtilis therapy” có nghĩa "thuốc subtilis" đời trị chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn trở nên phổ biến, sử dụng rộng rãi y học, chăn nuôi, thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005) 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.2.1 Đặc điểm phân loại Theo đặc điểm phân loại Bergey (1994), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc Bộ: Eubacterriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 2.1.2.2 Đặc điểm phân bố Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc đường ruột, chúng phân bố hầu hết tự nhiên Phần lớn chúng cư trú đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng vùng sa mạc, vùng đất hoang vi khuẩn Bacillus subtilis Nước bùn cửa sông nước biển có mặt bào tử tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996) 2.1.2 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn Bacillus subtilus trực khuẩn Gram dương có hai đầu tròn, kích thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – µm, thường đứng đơn lẻ tạo thành chuỗi ngắn, có khả di động, có khả sinh bào tử nhỏ tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,9 - 0,6 µm Vị trí bào tử tế bào sinh dưỡng không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm gần tâm không tâm (trích dẫn Nguyễn Lân Dũng,1983) 2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy Điều kiện nuôi cấy: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 370 C Nhu cầu O2: Bacillus subtillis vi khuẩn hiếu khí có khả phát triển môi trường thiếu oxy Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp với pH = - 7,4 Trên môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa cưa không đều, có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính – mm Sau - ngày bề mặt nhăn nheo, màu xẩm Trên môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại vẩn mây đáy, khó tan lắc lên Dinh dưỡng: cần nguyên tố C, H, O, N nguyên tố khác 2.1.5 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên Bacillus subtilis có kháng nguyên H O, cấu trúc kháng nguyên dạng D L acid glutamic Sản sinh kháng sinh subtilin bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ G- Bệnh học: đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh 2.1.6 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Bào tử vi khuẩn kết cấu biến đổi tế bào sinh dưỡng giai đoạn trình sinh trưởng vi khuẩn Mỗi tế bào tạo thành bào tử (trích dẫn Nguyễn Khắc Tuấn, 1996) Bào tử vi khuẩn phận làm chức sinh sản mà thể biến đổi tế bào nhằm bảo tồn, đổi nâng cao sức sống vi khuẩn Bào tử hình thức tiềm sinh vi khuẩn, có đề kháng cao với nhân tố bất lợi ngoại cảnh Theo Nguyễn Xuân Thành ctv (2005) tồn lâu dài bào tử chúng có đặc tính sau: - Nước bào tử phần lớn trạng thái liên kết, khả làm - biến tính protein tăng nhiệt độ Do bào tử có lượng lớn ion Ca 2+ acid dipicolinic Protein bào tử kết hợp với dipicolinat canxi tạo thành phức chất có tính ổn định cao đối - với nhiệt độ Các enzyme hoạt chất sinh học khác bào tử tồn dạng không hoạt động làm hạn chế trao đổi chất bào tử với môi trường bên - Sự có mặt acid amin chứa lưu huỳnh, đặt biệt cysteine giúp bào tử đề - kháng với tia cực tím Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc tính thẩm thấu lớp màng, làm cho chất hóa học chất sát trùng khó tác động đến bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào có sức sống mạnh mẽ (trích dẫn Nguyễn Khắc Tuấn, 1996) 2.1.7 Cơ chế đối kháng Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh Với vi sinh vật gây bệnh, loài sinh vật khác thích hợp điều kiện môi trường, sinh khuẩn lạc khác Thay đổi môi trường yếu tố môi trường bất lợi làm thay đổi điều kiện sống, hạn chế ức chế phát triển vi sinh vật Thực tế môi trường nuôi cấy nấm bệnh có diện Bacillus subtilis với số lượng lớn xảy cạnh tranh dinh dưỡng Cạnh tranh không gian sinh sống vi khuẩn nấm, vi khuẩn phát triển nhanh (trong 24 giờ) sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng môi trường, đồng thời tạo số loại kháng sinh nên sinh trưởng nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng Hoàng Đức Thuận, 1976) Phương thức diệt nấm tác nhân gây bệnh sau: Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác nhân gây bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật chủ để gây bệnh Sau đó, Bacillus tiết hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được gọi serenade) để làm thủng vách tế bào màng tế bào chất tác nhân gây bệnh ngăn chặn phát triển chúng Serenade bảo quản, sử dụng loại thuốc trừ sâu hóa học tổng hợp, kiểm tra chứng minh phòng thí nghiệm không gây độc cá hồi, ong mật, chim cút,…và nhiều loài khác Serenade gồm nhóm lipopeptid có tên surfactin, agrastain iturin Ba nhóm kết hợp với để làm tăng hoạt tính diệt mầm bệnh kể vi sinh vật gây hại, nấm mốc bào tử gây bệnh chúng Surfactin nhóm chất có hoạt tính sinh học, chất lipopeptid Bản thân surfactin không gây độc cho nấm kết hợp với iturin trở thành hợp chất diệt nấm Surfactin có khả làm thủng vách tế bào tác nhân gây bệnh bào tử chúng, giúp cho agrastain iturin phát huy tác dụng Hình 2.1 Cấu trúc hóa học surfactin (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0927776511005807) Agrastatin vừa phát có khả diệt nấm giống surfactin iturin Hình 2.2 Cấu trúc hoá học Argastin Inturin nhóm chất chiếm vai trò quan trọng trình diệt nấm, chất lipoprotein chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis Iturin diệt nấm cách tác dụng lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành lổ thủng để làm tính thẩm thấu chọn lọc màng Hình 2.3 Cấu trúc hóa học iturin Ngoài ra, Bacillus subtilis đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli Bacillus subtilis có khả tổng hợp số chất kháng sinh nên gây ức chế trình sinh trưởng phát triển Escherichia coli, điều thể qua số lượng Escherichia coli bảng ( Nguyễn Quỳnh Nam, 2006) Bảng 2.1 Bacillus subtilis đối kháng với Escherichia coli môi trường TSB Mẫu Thời gian (giờ) 12 24 10 4,45.10 29,80.10 15,75.107 4,45.1010 19,95.108 9,55.107 4,45.1010 17,26.108 8,30.107 10 4,45.10 19,95.10 13,67.107 4,45.1010 23,40.108 2,60.107 Đối chứng 4,45.1010 22,15.108 61,76.107 Mẫu (1,2,3,4,5): môi trường TSB chứa Bacillus subtilis Escherichia coli 36 [...]... cấy vi khuẩn nào thì chủng vi khuẩn đó có khả năng ức chế sản sinh aflatoxin càng mạnh Sau đó chọn những chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sản sinh aflatoxin mạnh nhất để tiến hành thì nghiệm tiếp theo 3.5.3 Đánh giá khả năng ức chế aflatoxin của chủng Bacillus subtilis phân lập được trên môi trường bắp 3.5.3.1 Phương pháp thu hoạch và xác định bào tử nấm mốc Aspergillus flavus Cấy chủng nấm mốc đã được. .. chủng vi khuẩn ức chế sự phát triển của nấm mốc (c) các chủng vi khuẩn không ức chế được nấm mốc, vòng sáng aflatoxin còn rõ Từ 34 chủng Bacillus subtilis được chọn sau khi thử đối kháng được tiến hành chạy PCR Kết quả thu được 11 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis dương tính (hình 4.4) 26 Hình 4.4 Kết quả điện di xác định các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis dương tính 4.1.2 Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin. .. Huỳnh Nam, 2006 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy trên heo Luận văn tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh 5 Phạm Hoàng Thái, 2007 Phân lập vi khuẩn Bacillus Subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh Aflatoxin của các chủng phân lập được Luận văn tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học, Đại học... phát ra xung quanh khuẩn lạc nấm mốc là vòng aflatoxin được Aspergillus flavus sản sinh Vòng phát ra càng rộng, càng sáng thì nồng độ độc tố sản sinh càng cao, càng mạnh Dùng chủng nấm mốc sau khi kiểm tra có sinh độc tố aflatoxin để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo 27 4.1.2.2 Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập được Sau khi cấy nấm... 11 chủng vi khuẩn Bacillus subtils được thể hiện qua độ sáng của vòng aflatoxin dưới dèn UV bước sóng 365nm (tại vi trí khuẩn lạc nấm mốc tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn) , kết quả được trình bày ở hình 4.9 (chủng 85) (chủng 52) (chủng 34) hình 4.9 Vòng sáng aflatoxin không đều ở các phía của khuẩn lạc Aspergillus flavus Kết quả chọn 3 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng với nấm mốc... Bảng 4.1 Kết quả phân tích HPLC Hàm lượng aflatoxin của các mẫu thí nghiệm không có sự khác biệt nhiều so với mẫu đối chứng (+) 32 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian thực hiện tiểu luận chúng tôi có những kết luận sau: Có thể phân lập Bacillus subtilis từ phân heo Vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ phân heo có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Aspergillus... 4.7 Khuẩn lạc vi khuẩn (2 ngày nuôi cấy) lấn vào khuẩn lạc Aspergillus flavus (4 ngày nuôi cấy) so với đĩa đối chứng dưới đèn UV 28 Sang ngày thứ 3, khuẩn lạc vi khuẩn phát triển mạnh ngăn cản khuẩn lạc nấm mốc phát triển, dưới đèn UV thì vòng sáng aflatoxin mờ rõ như hình 4.8 Hình 4.8 khuẩn lạc vi khuẩn và nấm mốc sau 5 ngày nuôi cấy So sánh khả năng ức chế sự sinh aflatoxin của 11 chủng vi khuẩn Bacillus. .. Hàn Vi t; phân tích hàm lượng - aflatoxin tại trạm chẩn đoán, xét nghiệm và điều trị chi cục thú y TPHCM ĐỐI TƯỢNG KHẢO SÁT Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ phân heo Chủng nấm mốc Aspergillus flavus sinh aflatoxin do phòng thực hành vi sinh cấp THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM Thiết bị: kính hiển vi, tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), cân điện tử, - máy lắc (vortex), lò vi. .. nghị Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis mà chúng tôi phân lập được có khả năng ức chế sinh trưởng của nấm mốc nhưng chưa làm giảm hảm lượng aflatoxin nhiều nên cần tiếp tục tìm kiếm các chủng khác từ nước, đất, cỏ khô Thử thay đổi tỷ lệ nuôi cấu giữa bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn kiểm tra khả năng làm giảm hàm lượng aflatoxin trên môi trường bắp Cần tìm hiểu thêm về phương thức tác động làm giảm aflatoxin. .. đã được nghiên cứu nhiều nhất cho vi c khử nhiễm aflatoxin trong thực phẩm Phương pháp vi sinh vật học Hiện nay, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng aflatoxin dễ bị một số vi sinh vật như nấm, vi khuẩn và nấm men phân hủy sinh học Một số loài vi khuẩn, chẳng hạn như Lactobacillus, Bacillus, Pseudomonas, Ralstonia và Burkholderia spp đã cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của nấm và sự sản xuất aflatoxin ... tử vi khuẩn 1/10 3, hàm lượng aflatoxin giảm 99,6 lần Năm 2007, Phạm Hồng Thái thực đề tài Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất, khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng phân. .. khả ức chế sản sinh aflatoxin mạnh Sau chọn chủng vi khuẩn có khả ức chế sản sinh aflatoxin mạnh để tiến hành nghiệm 3.5.3 Đánh giá khả ức chế aflatoxin chủng Bacillus subtilis phân lập môi trường... thể phân lập Bacillus subtilis từ phân heo Vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ phân heo có khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm mốc Aspergillus flavus 5.2 Đề nghị Chủng vi khuẩn Bacillus