Nghiên cứu khả năng phân hủy 2 4 5 và đặc điểm phân loại chủng vi khuẩn phân lập từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM /// Phạm Ngọc Long NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM /// Phạm Ngọc Long NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Chuyên ngành Mã số : Sinh học thực nghiệm : 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nghiêm Ngọc Minh Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cảm ơn Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nghiêm Ngọc Minh Trưởng Phịng Cơng nghệ sinh học Mơi trường – Viện Cơng Nghệ sinh Học tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận án Trong q trình nghiên cứu vửa qua, nhận giúp đỡ bảo tận tình PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà anh chị Phịng Cơng nghệ sinh học Môi trường, đặc biệt Ths Nguyên Bá Hữu, CN Nguyễn Văn Bắc, KS Cung Thị Ngọc Mai, người giúp đỡ tơi q trình thực luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Khoa sau đại học, khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để tơi hồn thành luận văn Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2009 Phạm Ngọc Long Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-Pentaclorodibenzo-p-dioxin 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid LB Luria - Bertani PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCDDs Polychlorinated dibenzo-p-dioxins PCDFs Polychlorinated dibenzofurans PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN Sự ô nhiễm 2,4,5-T 2,4-D Đặc điểm tính chất 2,4,5-T 2,4-D 2.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T 2.2 Chất diệt cỏ 2,4-D Ảnh hƣởng 2,4,5-T, 2,4-D đến môi trƣờng ngƣời 3.1 Ảnh hưởng 2,4,5-T 2,4-D tới môi trường 3.2 Ảnh hưởng 2,4,5-T, 2,4-D đến người Một số phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học có 2,4,5-T 2,4-D 4.1 Phương pháp xử lý chất độc hóa học hóa học, lý học, học 4.2 Phương pháp phân hủy sinh học 10 Khả phân hủy 2,4,5-T 2,4-D số vi sinh vật 15 Phân loại vi sinh vật 21 6.1 Phân loại theo phương pháp cổ điển 21 6.2 Phương pháp phân loại sinh học phân tử 22 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 25 1.1 Vật liệu 25 1.2 Hóa chất 25 1.3 Thiết bị, máy móc 25 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.1 Mơi trường ni cấy 26 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long 2.1.1 Môi trường SH1 dịch (g/l) 26 2.1.2 Môi trường SH1 thạch 26 2.1.3 Mơi trường muối khống 26 2.1.4 Mơi trường LB dịch 27 2.1.5 Môi trường LB thạch 27 2.1.6 Nước muối sinh lý 27 2.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bioreactor hiếu khí 27 2.2.1 Ni cấy làm giàu vi sinh vật 27 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 27 2.3 Nghiên cứu hình thái tế bào chủng vi khuẩn 28 2.3.1 Nhuộm Gram 28 2.3.2 Quan sát hình thái tế bào kính hiển vi điện tử quét 28 2.4 Phương pháp phân tích khả phân hủy 2,4,5-T 29 2.5 Phân loại vi khuẩn dựa so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA 29 2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi sinh vật 29 2.5.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA phương pháp PCR 30 2.5.3 Điện di kiểm tra gel agarose 31 2.5.4 Tách dòng đoạn gen mã hóa 16S rRNA 31 2.5.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli 31 2.5.6 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony–PCR) 32 2.5.7 Tách DNA plasmid theo Kit hãng Fermentas 33 2.5.8 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA 34 2.5.9 Xây dựng phát sinh chủng loại 34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 Nuôi cấy, phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bioreactor hiểu khí 35 1.1 Ni cấy, làm giàu tập đồn vi sinh vật 35 1.2 Phân lập chủng vi khuẩn 37 Đặc điểm phân loại chủng HR5.1 38 2.1 Hình thái tế bào 38 2.2 Phân loại dựa trình tự gen mã hóa 16S rRNA 39 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 39 2.2.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA chủng HR5.1 kỹ thuật PCR 40 2.2.3 Tách dòng gen 16S rRNA vector pBT 41 2.2.4 Xác định trình tự gen 16S rRNA chủng HR5.1 43 Nghiên cứu số đặc điểm chủng HR5.1 47 3.1 Khả phát triển chủng HR5.1 PAH 47 3.2 Khả phân hủy 2,4,5-T chủng HR5.1 49 3.2.1 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy có chứa 2,4,5-T lên phát triển chủng HR5.1 49 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ 2,4,5-T lên phát triển chủng HR5.1 50 3.2.3 Khả phân hủy 2,4,5-T chủng vi khuẩn HR5.1 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long MỞ ĐẦU Trong chiến tranh xâm lược Mỹ tiến hành Việt Nam, 100 triệu lít chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D 2,3,7,8 TCDD rải xuống 20% diện tích miền Nam Theo cơng bố Stellman cộng tạp chí Nature năm 2003 20 chất diệt cỏ khác sử dụng Chu kỳ bán hủy dioxin chất tương tự dioxin dài, có đến vài chục năm hàng trăm năm [15],[42] Qua điều tra nghiên cứu nhiều quan khoa học công nghệ Việt Nam quốc tế cho thấy, đất sân bay Đà Nẵng Biên Hòa độ tồn lưu PCDD, PCDF, 2,4,5-T 2,4-D cịn cao 2,4,5-T, 2,4-D có hàm lượng lên tới hàng vài trăm nghìn đến vài triệu µg/kg đất Ngồi lượng không nhỏ chất DCP, TCP PAH xác định mẫu đất khu vực bị nhiễm độc Nghiên cứu áp dụng phương pháp sinh học để khử độc “điểm nóng” Đà Nẵng thu kết khả quan Tuy nhiên để xử lý điểm ô nhiễm cục chất diệt cỏ/dioxin với thời gian ngắn cần có công nghệ phân hủy sinh học phù hợp Hiện nay, phịng Cơng nghệ sinh học mơi trường, Viện Cơng nghệ sinh học tiến hành xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin công nghệ tăng cường sinh học bioreactor hiếu khí kỵ khí Trong q trình xử lý, ngồi điều khiển điều kiện môi trường độ ẩm, nhiệt độ vai trị vi sinh vật có bioreactor quan trọng Để tăng hiệu hồn thiện cơng nghệ cần tăng thêm hiểu biết đặc điểm vi sinh vật có bioreactor, vai trò vi sinh vật phân hủy chất độc bổ sung vào bioreactor Nhằm đáp ứng yêu cầu thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu khả phân hủy 2,4,5-T đặc điểm phân loại chủng vi khuẩn phân lập từ bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin“ thực Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Luận án thực đƣợc nội dung nghiên cứu sau  Làm giầu vi sinh vật từ mẫu đất bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin  Phân lập chủng vi khuẩn có khả phát triển 2,4,5-T 2,4-D  Nghiên cứu số đặc điểm chủng vi khuẩn phân lập  Phân loại định tên chủng vi khuẩn chọn lựa  Xác định khả sử dụng 2,4,5-T chủng vi khuẩn nghiên cứu Luận án thực phịng Cơng nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học phần đề cấp Viện Khoa học công nghệ Việt Nam: “Nghiên cứu xử lý tẩy độc số hợp chất hữu chứa clo phương pháp hóa học sinh học tiên tiến“ PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà chủ trì Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học PHẦN Phạm Ngọc Long TỔNG QUAN Sự ô nhiễm 2,4,5-T 2,4-D Từ năm 1961 đến năm 1971 quân đội Mỹ rải 100 triệu lít chất diệt cỏ xuống nhiều vùng miền Trung Nam Việt Nam [42] Các chất diệt cỏ sử dụng bao gồm: chất da cam, chất trắng, chất xanh lục, chất xanh lam, chất tím, chất hồng, chất gọi tên theo mầu đánh dấu thùng phuy chứa chúng, thùng khoảng 250l [42] Các chất diệt cỏ thường hỗn hợp hai chất 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid) 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) với tỷ lệ 50:50 (Bảng 1) Dioxin tạp chất sinh trình sản xuất 2,4,5-T Hàm lượng dioxin chất diệt cỏ khác nhau, ước tính số lượng dioxin chứa chất diệt cỏ mà Mỹ dùng chiến tranh Việt Nam từ 170 - 1000 kg [42], [15] Bảng 1.1 Thành phần hóa học chất diệt cỏ quân đội Mỹ sử dụng chiến tranh Việt Nam [42] Sử dụng trong năm Số lƣợng ƣớc tính rải (lít) 961-1081 g/l acid tương đương 1961-1965 503.121; 413,852 Chất n-Butylester xanh 2,4,5-T Giống chất hồng Chưa rõ, rải thời gian với chất hồng 31.026 Chất tím 1033 g/l acid tương đương 1962-1965 1.892.773 Tên chất Thành phần hoá chất Chất hồng 60% - 40% n-Butyl: isobutylester 2,4,5-T 50%n-Butylester 2,4,D Độ đậm đặc tƣơng đƣơng 30% Butylester Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Trên giới, người ta phát nhiều chủng Pseudomonas có khả phân hủy PAH Pseudomonas putida NCIB 9816-4 có khả phân hủy napthelen [38], Pseudomonas rhodesiae KK1có khả phát triển nguồn chất trộn ba loại PAH anthracene, naphthalene phenanthrene [31] Như chủng HR5.1 có khả phát triển tốt nguồn PAH Tuy nhiên để khẳng định chắn khả phân hủy PAH chủng cần phải có nghiên cứu xác định HPLC 3.2 Khả phân hủy 2,4,5-T chủng HR5.1 3.2.1 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy có chứa 2,4,5-T lên phát triển chủng HR5.1 Quá trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật phụ thuộc vào nhiều điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, pH, thành phần môi trường v.v Đặc biệt thành phần môi trường ni cấy có ảnh hưởng lớn đến khả phát triển vi sinh vật Để xác định ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên phát triển vi khuẩn HR5.1, chủng nuôi ba môi trường khác môi trường SH1 (môi trường giầu dưỡng chất), mơi trường muối khống nghèo chất dinh dưỡng môi trường SH1/5 (môi trường trộn môi trường SH1 mơi trường muối khống) Kết hình 3.12 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Hình 3.12 Ảnh hưởng môi trường lên phát triển Chủng HR5.1 Chủng HR5.1 phát triển tốt môi trường SH1, chủng làm đổi mầu môi trường sang mầu xanh có ánh huỳnh quang (hình 3.12) Trên mơi trường muối khống chủng HR5.1 có mọc yếu nhiều so với nuôi môi trường SH1 hay SH1/5 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ 2,4,5-T lên phát triển chủng HR5.1 Mỗi chủng vi sinh vật có ngưỡng định chất độc mà phát triển Tùy thuộc vào chủng loại chất độc mà ngưỡng cao hay thấp Để tìm hiểu sơ ngưỡng 2,4,5-T phát triển chủng HR5.1, chủng nuôi môi trường SH1/5 với nồng độ 2,4,5-T khác Kết bảng cho thấy, sau ngày ni cấy mơi trường có nồng độ 300 ppm chủng phát triển yếu Chủng phát triển tốt từ nồng độ 50 ppm đến 200 ppm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ 2,4,5-T lên phát triển chủng HR5.1 Khả phát triển +++ +++ +++ + Chú thích - : Khơng phát triển ++ : Phát triển bình thường C : Đối chứng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 + : Phát triển yếu +++ : Phát triển tốt http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long 3.2.3 Khả phân hủy 2,4,5-T chủng vi khuẩn HR5.1 Để đánh giá khả sử dụng 2,4,5-T chủng vi khuẩn HR5.1 tiến hành phân tích lượng 2,4,5-T cịn lại dịch ni cấy có khơng có vi sinh vật (mẫu đối chứng) phương pháp sắc ký Mẫu đem phân tích ni lắc 30oC bổ sung 200ppm 2,4,5-T Kết trình bày bảng 3.5 hình 3.13 Bảng 3.5 Khả phân hủy 2,4,5-T HR 5.1 Hàm lượng thu hồi 2,4,5-T bị loại bỏ (%) Khơng có vi sinh vật (ppm) Có vi sinh vật (ppm) 183,35 117,9 35,7% Từ kết bảng hình 3.13 ta thấy chủng HR5.1 sau tuần nuôi cấy sử dụng 35,69% lượng 2,4,5-T đưa vào môi trường nuôi cấy Liên quan tới khả sử dụng 2,4,5-T tác giả Nguyễn Thanh Thủy cộng cơng bố chủng nấm FDN41 có khả loại bỏ 43,46% lượng 2,4,5-T đưa vào sau 20 ngày nuôi lắc Chủng phân hủy 2,4,5-T môi trường chứa 2,4,5-T nguồn cacbon lượng [12] La Thanh Phương cộng phân lập chủng Pseudomonas sp BDN15 từ nguồn đất ô nhiễm sân bay Đà Nẵng, chủng có khả phân hủy 39,37% 2,4,5-T 90 ngày điều kiện tĩnh nồng độ 2,4,5-T ban đầu 1000 ppm nguồn lượng carbon môi tường nuôi cấy [6] Khi so sánh trình tự nucleotid chủng BDN15 chủng HR5.1 cho thấy trình tự chúng giống 94% Điều cho thấy hai chủng BDN15 HR5.1 thuộc chi Pseudomonas chúng hai chủng khác nhau, đa dạng sinh vật có mặt vùng bị nhiễm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Trên giới có nhiều nghiên cứu cơng bố sinh vật có khả phân hủy 2,4,5-T Theo Haugland cộng công bố khả phân hủy mạnh 2,4-D 2,4,5-T số chủng vi khuẩn Với đặc tính sinh trưởng nhanh vi khuẩn, sau 24h nuôi, chủng Pseudomonas cepacia AC1100 phân hủy 960 μg/ml 2,4,5-T, 280 μg/ml 2,4-D Chủng chí cịn có khả phân hủy hỗn hợp 2,4,5-T 2,4-D nhiên khả phân hủy hai chất giảm hẳn xuống 26 μg/ml 2,4,5-T 24 μg/ml 2,4-D [26] Người ta tạo chủng tái tổ hợp có nguồn gốc từ chủng Pseudomonas cepacia AC1100 nhận thêm plasmid pJP4 quy định khả phân hủy 2,4-D từ chủng Alcalugenes eutrophus JMP134, chủng đặt tên RHJ1 Chủng tái tổ hợp RHJ1 có khả phân hủy mạnh chất độc mơi trường có bổ sung riêng rẽ 2,4,5-T, 2,4-D mơi trường có bổ sung hai loại chất [26] Như chủng HR5.1 có khả phát triển tốt nguồn chất khác 2,4,5-T PAH, 2,4-D, điều phù hợp với công nghệ xử lý bioreactor Vi khuẩn HR5.1 có khả phân hủy tốt 2,4,5-T điều đóng góp thêm hiểu biết vi sinh vật có mặt bioreactor nhằm hồn thiện cơng nghệ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết Luận Từ mẫu đất bioreactor HRK3, HRK4, HRK5, chủng vi khuẩn HR3.1, HR4.1, HR5.1 phân lập Chủng HR3.1 có khả phát triển mơi trường SH1/5 có bổ sung 2,4-D, Chủng HR4.1 HR5.1 có khả phát triển mơi trường SH1/5 có bổ sung 2,4,5-T Chủng vi khuẩn HR5.1 vi khuẩn Gram âm, khuẩn lạc hình trịn, mầu trắng đục, đường kính từ 1,9-2,1 mm Chủng HR5.1 có dạng que ngắn kích thước khoảng 1,6-1,9 x 0,5-0.6 μm Chủng HR5.1 có mối quan hệ gần gũi với loài thuộc chi Pseudomonas đặc biệt trình tự gen 16S rRNA chủng HR5.1 có độ tương đồng cao tới 98% với số loài thuộc chi Pseudomonas Chủng HR5.1 đặt tên chủng Pseudomonas sp HR5.1 Chủng HR5.1 phát triển tốt môi trường SH1 phát triển yếu mơi trường khống có chứa 2,4,5-T Vi khuẩn HR5.1 có khả phát triển tốt mơi trường SH1/5 có chứa PAH Chủng HR5.1 phát triển tốt nồng độ 2,4,5-T bổ sung từ 50 ppm đến 200 ppm, giảm dần nồng độ 2,4,5-T 300 ppm Trên môi trường SH1/5 chứa 200 ppm 2,4,5-T sau tuần, chủng HR5.1 phân hủy 35,7% Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu khả phân hủy nguồn carbon khác PAH, 2,4-D, dioxin v.v chủng vi khuẩn HR5.1 nhằm đánh giá khả phân hủy nhiều loại chất độc chủng Nghiên cứu sâu gen chức tham gia trình phân hủy 2,4,5-T 2,4-D chủng HR5.1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Bá Hữu, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đương Nhã, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Nguyên Quang (2008), Khảo sát vi sinh vật vùng nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin khu vực sân bay Đà Nẵng khử độc đất nhiễm điều kiện phịng thí nghiệm, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(4A), tr 837-846 Đặng Thị Cẩm Hà, Phạm Hữu Lý, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Đệ, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Đương Nhã, Mai Anh Tuấn, La Thanh Phương, Nguyễn Thị Sánh, Nguyễn Thu Thủy, Đỗ Bích Thanh, Đỗ Ngọc Tuyên, Nguyễn Văn Minh, Nguyễn Văn Hồng (2005), Nghiên cứu phát triển công nghệ phân hủy sinh học kỹ thuật nhả chậm làm chất độc hóa học đất, Báo cáo nghiệm thu đề tài nhà nước thuộc chương trình 33, Hà Nội Đặng Thị Cẩm Hà (2008) Nghiên cứu xử lý tẩy độc số hợp chất hữu chứa clo phương pháp hóa học sinh học tiên tiến Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Hà Nội Hồng Anh Cung (1993) Ảnh hưởng 2,4,5-T đến lúa vi sinh vật đất Chất diệt cỏ, tác hại lâu dài người thiên nhiên Hội thảo quốc tế lần II: 139-141 Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thanh Thủy, Ngô Xuân Quý, Nghiêm Xuân Trường, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004), Khả phân hủy 2,4-D dibenzofuran chủng nấm sợi FDN20, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(4), tr 517-528 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long La Thị Thanh Phương, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thi Cẩm Hà (2005) Một số đặc điểm sinh học khả phân sử dụng 2,4,5-T chủng vi khuẩn BDN15 phân lập từ vung đất ô nhiễm chất độc hóa học Tạp Chí Cơng nghệ Sinh học 3(3): 389-396, 2005 Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003) Áp dụng kĩ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam Nhà xuất KH&KT Hà Nội: 325-329 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2007), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân tử ba chủng vi khuẩn sử dụng 2,4-D phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng, Tạp chí Sinh học, 29(4), tr 80-85 Nguyễn Bá Hữu 2002 Nghiên cứu nhóm vi sinh vật khả phân hủy hydrocacbon thơm đa nhân số chủng vi khuẩn trình xử lí nhiễm dầu Khe Chè, Quảng Ninh Luận án thạc sĩ sinh học 10 Nguyên Đương Nhã, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Ngọc Bảo, Đặng Thị Cẩm Hà (2005), Khả phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân dibenzofuran chủng xạ khuẩn XKDN12, Tạp chí cơng nghệ sinh học, 3(1), tr 123-132 11 Nguyễn Thanh Thủy, Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2006), Nghiên cứu phân loại khả phân hủy chất độc chủng nấm sợi FDN22 phân lập từ đất xử lý nhiễm chất độc hóa học, Tạp chí cơng nghệ sinh học, 4(1), tr 125-132 12 Nguyễn Thanh Thủy, Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Vũ Xuân Đạt, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007) Phân loại khả phân hủy chất diệt cỏ 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid chủng nấm sợi FDN41 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Tạp chí cơng nghệ sinh học, 6(1), tr 119-126 13 Nguyễn Thị Sánh, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2005) Phân loại nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng lên phát triển chủng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc SETDN1 từ đất nhiễm độc hóa học Đà Nẵng Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 3(2): 257-264 14 Nguyễn Văn Minh (2003) Nghiên cứu tẩy độc Việt Nam Hội thảo Việt Nam-Hoa Kỳ phương pháp xác định, xử lý đánh giá vùng ô nhiễm dioxin: 80-85 15 Trần Xuân Thu (2003) Bước đầu đánh giá mức độ ô nhiễm dioxin môi trường Việt Nam Hội thảo Việt Nam-Hoa Kỳ phương pháp xác định, xử lý đánh giá vùng ô nhiễm dioxin: 38-47 16 Trịnh Ngọc Bảo, Phan Thị Hoan, Đào Ngọc Phan, Nguyễn Thị Vĩnh (1993) Nghiên cứu nhiễm sắc thể hệ F2 người tiếp xúc với chất độc hóa học chiến tranh Việt Nam Chất diệt cỏ, tác hại lâu dài người tự nhiên Hội thảo quốc tế lần II: 399-402 17 Võ Quý, Đặng Huy Huỳnh, Mai Đình Yên, Phùng Tửu Bơi, Phạm Bình Quyền (2002) Thử đánh giá lại hậu chất mầu da cam/dioxin lên trường vùng a lưới sau gần 30 năm kết thúc chiến tranh Chất diệt cỏ, tác hại lâu dài người thiên nhiên Hội thảo quốc tế lần II: 205-213 Tài liệu tiếng nƣớc 18 Barry Dellinger (2003) Treatment and prevention of formation of dioxins U.S.-Viet Nam Scientific workshop on dioxin screening, remediation methodologies and site characterization: 76-79 19 Bunge, M., Adrian, L., Klaus, A., Opel, M., Lorenz, W.G., Andresen, J.R., Gorisch, H., Lechner, U (2003) Reductive dehalogenation of chlorinated dioxins by an anaerobic bacterium Nature 421: 357-360 20 Dang T C H., Mai A T., Nguyen Q V., Nguyen T S., Trinh K S., Olaf P (2004) Biodegradation of 2,3,7,8 TCDD by anaerobic and aerobic Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long microcosms collected from bioremediation treatments for cleaning up dioxin contaminated soils Dioxin in Viet Nam: Characterisation, monitoring, remediation and effects Organohalogen compounds 66: 3695-3701 21 Daubaras, D.L., Danganan, C.E., Hubner, A., Ye, R.W., Hendrickson, W., Chakrabarty, A.M (1996) Biodegradation of 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid by Burkholderia cepacia strain AC1100: evolutionary insight Gene 179: 1-8 22 Dinh H (1984) Long-term changes in dense inland forest following herbicidal attack Herbicides in war, the long-term Ecology and Human Consequences Taylor and Francis: 31-32 23 Dipak Roy, Baton Rouge (1989) Detoxification of chlorinated aromatic compounds by organism NRRL B-18087 United States Patent 4804629 24 Dolezar S., Buzer Polychlordibenzothiophenes, H the R., sulphur Rappe analogues C (1991) of polychlordibenzofurans identified in incineration sample Environ the Scien Technol 25: 1637-1643 25 Habe H., Chung J., Lee J., Kasuga K., Yoshida T., Nojiri H., and Omori T (2001), Degradation of Chlorinated dibenzofurans and Dibenzo-pDioxins by Two Types of Bacteria Having Angular Dioxygenases with Different Features, Appl Environ Microbiol 67: 3610-3617 26 Haugland R.A.; Schelenm D.J ; Lyons R.P.III ; Sferra P.R; Chakrabarty A.M (1990) Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by pure and mixed bacterial cultures Appl Environ Microbiol 56, pp 1357 1362 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long 27 Hong, H B., Chang, Y S., Nam, I H., Fortnagel, P., and Schmidt, S (2002) Biotransformation of 2,7-Dichloro-and 1,2,3,4- tetrachlorodibenzo-pdioxin by Sphingomonas wittichii RW1 Appl Environ Microbiol 68: 25842588 28 Itoh K., Tashiro Y., Uobe K., Kamagata Y., Suyama K., Yamamoto H (2004), Root nodule Bradyrhizobium spp Harbor tfdAα and cadA, homologous with gene encoding 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degrading proteins, Appl Environ Microbiol, 70, pp 2110-2118 29 Jesus G.M Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V (1999) Use of 16S23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity Journal Microbiol Methods 36: 55-64 30 Jik A.Field, Reyes Sierra (2004) Review of scientific literature on microbial dechlorination and chlorination of key chlorinated compounds: 7-23 31 Kahng HY, Nam K, Kukor JJ, Yoon BJ, Lee DH, Oh DC, Kam SK, Oh KH (2002) PAH utilization by Pseudomonas rhodesiae KK1 isolated from a former manufactured-gas plant site Microbiol Biotechnol 60(4) pp 475-80 32 Kilbane J.J., Chatterjee D.K., Karns J.S., Kellogg S.T., and Chakrabarty A.M (1982) Biodegradation of 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid by a pure culture of Pseudomonas cepacia Applied and environmental microbiology 44: 72-78 33 Kitagawa W, Takami S, Miyauchi K, Masai E, Kamagata Y, Tiedje JM, Fukuda M (2002) Novel 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degradation genes from oligotrophic Bradyrhizobium sp strain HW13 isolated from a pristine environment Journal of Bacteriology, Vol 184, No 2, p 509-518, 34 Krisztina Gábor (2006) Molecular analysis of halorespiration in sesulfitobacterium spp.: catalysis and transcriptional regulation: 3-27 28.1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long 35 Liyama, N., Atsushi, T., Hitoshi, I., and Sadayori, H (2003) An introduction of biodegradation system of dioxin in contaminated water and soil Organohalogen compounds 63: 256-259 36 Mai P., O Stig Jacobsen, J Aamand (2001) Mineralization and cometabolic phenoxyalkanoic acid herbicide by a pure bacterial culture isolated from an aquifer Appl Microbiol Biotechnol 56: 486-490 37 37 Olga Maltseva, Catherine McGowan, Roberta Fulthorpe and Patrick Oriel (1996) Degradation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid by haloalkaliphilic bacteria Microbiology 142, pp 1115-1122 38 38 Park W; Jeon C O; Cadillo H; DeRito C; Madsen E L (2004) Survival of naphthalene-degrading Pseudomonas putida NCIB 9816-4 in naphthaleneamended soils: toxicity of naphthalene and its metabolites Microbiol Biotechnol 64(3) pp 429-35 39 39 Sambrook J, Russell D W (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 40 40 Schecter A., Thomas A Gasiewicz (2003), Dioxin and health, A John Wiley  Sons, Inc, New York 41 41 Sinkkonen S., Paasivirta J (2000) Degradation half-life times of PCDDs, PCDFs and PCBs for environmental fate modeling Chemosphere 40: 943-949 42 42 Stellman, J.M., Stellman, S.D., Christian, R., Weber, T.A., Tomassalla (2003) The extent and patterns of usage of agentorange and the herbicides in Vietnam Nature 422: 681-687 43 43 The agrochemicals handbook 1991 3rd ed, Cambridge, Royal Society of Chemistry 44 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long 44 Top E M., Holben W E , Forney L J (1995), Characterization of Diverse 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degradative Plasmids Isolated from Soil by Complementation, Applied and environmetal microbiology, 61(5), pp 1691-1698 45 45 Travkin V M., A P Jadan, F Briganti, A Scotzzafava, L A Golovleva (1997) Characterisation of an intradiol dioxygenase involved in the biodegradation of the chlorophenoxy herbicides 2,4-D and 2,4,5-T FEMS Letters 407: 69-72 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... QUAN Sự ô nhiễm 2, 4, 5- T 2, 4- D Đặc điểm tính chất 2, 4, 5- T 2, 4- D 2. 1 Chất diệt cỏ 2, 4, 5- T 2. 2 Chất diệt cỏ 2, 4- D Ảnh hƣởng 2, 4, 5- T, 2, 4- D đến môi trƣờng ngƣời 3.1 Ảnh hưởng 2, 4, 5- T 2, 4- D tới môi... Long NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2, 4, 5- T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ /DIOXIN Chuyên ngành Mã số : Sinh học thực nghiệm : 60. 42 . 30... dung nghiên cứu sau  Làm giầu vi sinh vật từ mẫu đất bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/ dioxin  Phân lập chủng vi khuẩn có khả phát triển 2, 4, 5- T 2, 4- D  Nghiên cứu số đặc điểm chủng vi khuẩn