Nghiên cứu khả năng phân huỷ hydrocarbon thơm và các gen chức năng của một số tập đoàn vi khuẩn

giáo dục đào tạo TRNG I HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - - ngun ngäc b¶o NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HYDROCARBON THƠM VÀ CÁC GEN CHỨC NĂNG CỦA MỘT SỐ TẬP ĐỒN VI KHUẨN ln ¸n tiÕn sĩ kỹ thuật Hà nội - 2010 giáo dục đào tạo TRNG I HC BCH KHOA H NI - - nguyÔn ngäc b¶o NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HYDROCARBON THƠM VÀ CÁC GEN CHỨC NĂNG CỦA MỘT SỐ TẬP ĐOÀN VI KHUN Chuyên ngành: MÃ số: Công nghệ sinh học thùc phÈm 62.54.02.05 luËn ¸n tiÕn sÜ kü thuËt ng-êi h-ớng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà GS.TS Đặng Thị Thu Hà nội - 2010 LI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam GS TS Đặng Thị Thu, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Đại Học Bách Khoa Hà Nội người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi thực hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn GS TS Nguyễn Trọng Giảng – Hiệu Trưởng trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội, PGS TS Nguyễn Việt Hùng – Viện trưởng Đào tạo sau đại học, Đại Học Bách Khoa Hà Nội PGS TS Tô Kim Anh - Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm quan tâm tạo điều kiện cho thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn, PGS TS Trương Nam Hải – Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học PGS TS Lê Quang Huấn – Trưởng phịng Cơng nghệ tế bào động vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt nam, quan tâm tạo điều kiện cho thực phần luận án Phịng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia Công nghệ gen Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Đại tá, TS Nguyễn Văn Chất, Viện trưởng Viện H57; Đại tá, TS Đỗ Đình Mạnh, Trưởng phịng 4, Viện H 57, Tổng cục Hậu cần - Kỹ thuật, Bộ Công an bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực luận án Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Bá Hữu, ThS Đàm Thuý Hằng, Ths Nguyễn Nguyên Quang tất anh chị, bạn đồng nghiệp Phịng Cơng nghệ sinh học Môi trường - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam chia sẻ, động viên giúp tơi vượt qua khó khăn để hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu Tơi biết ơn người thân gia đình bên tôi, quan tâm, động viên, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng Nguyễn Ngọc Bảo năm 2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2010 Tác giả Nguyễn Ngọc Bảo DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT 2,3,7,8-TCDD 2,4,5-T 2,4,5-TCP 2,4-D 2,4-DCP ANT BaA BaP bp BP BTEX BZ C230 CBP CDD CDD CDHH CFU 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-trichlorophenol 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2,4-dichlorophenol Anthracen Benz[a]Anthracen Benzo[a]Pyren Base pair = cặp bazơ Biphenyl benzen, toluen, ethylbenzen xylen Benzoate Catechol 2,3–dioxygenase = enzym Catechol 2,3 dioxygenase Chlorobiphenyl Chất diệt cỏ chứa dioxin Chlorinated dibenzo-p-dioxin Chất độc hóa học Colony Forming Unit = Đơn vị hình thành khuẩn lạc CHR clone Chrysen Trình tự gen (16S rRNA) tách dịng vi khuẩn có mẫu phân tích COR DBA DBF DC DD DGGE dMBaA Coronene Dibenz[a,h]Anthracen; Dibenzofuran Dịch chiết đất Dibenzo-p-dioxin Denaturing Gradient Gel Electrophoresis = Điện di gel građient nồng độ biến tính Dimethylbenz[a]Anthracen; DNA Acid deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleoside triphosphates đtg FLA FLE GC đồng tác giả Fluoranthene Fluoren Gas chromatograph_ Sắc ký khí HC Hydrocarbon HPLC kb High Performance Liquid Chromatography= Sắc ký lỏng hiệu cao kilo base = kilo bazơ LB Luria-Bertani = Môi trường Luria-Bertani LiP Lignin peroxidase = enzym Lignin peroxidase MNAP MnP Methyl Naphthalen Manganese Peroxidase = enzym Mangan peroxidase MPN-PCR NAP NAT Most proable number-PCR = Số lượng PCR Naphthalen Naphthothiophene ND Not Detected = Không phát PAH PYR Polycyclic Aromatic Hydrocarbon = hydrocarbon thơm đa nhân Polychlorinatedbiphenyl Polychlorinated dibenzo-p-dioxin Polychlorinated dibenzofuran Polymerase Chain Reaction = Phản ứng chuỗi trùng hợp Phenanthren Kiểu tiến hóa Persistent Organic Pollutants= Chất nhiễm hữu khó phân hủy Pyren SD Standard deviation = Độ lệch chuẩn USEPA Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ PCB PCDD PCDF PCR PHE Phylotype POP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Một số nguồn phát sinh PAH 1.2 Đặc điểm điển hình mẫu đất nhiễm PAH 1.3 Nồng độ PAH giới hạn đất bề mặt 1.4 Một số tính chất hóa – lý 1.5 Phân mức thời gian bán hủy PAH loại mơi trường khác 1.6 Tính chất vật lý độc tính PAH 1.7 Các vi khuẩn có khả phân huỷ hợp chất thơm 10 1.8 Bán phản ứng lượng tự chuẩn Gibb’s 16 trình sinh học khác 1.9 Một số vi sinh vật tham gia phân huỷ sinh học BTEX 16 PAH 1.10 So sánh đường chuyển hoá hợp chất thơm điều 27 kiện kỵ khí hiếu khí vi khuẩn 1.11 Ưu điểm nhược điểm kỹ thuật định lượng gen 35 sản phẩm phiên mã 3.1 Phân lập vi khuẩn sinh trưởng môi trường chứa 57 PAH khác 3.2 Khả phân hủy hỗn hợp PAH tập đoàn vi khuẩn Đức 64 Giang 3.3 Khả phân hủy PAH chủng vi khuẩn nghiên 67 cứu 3.4 Khả sinh trưởng phân hủy hỗn hợp PAH BHN1 70 3.5 Khả sinh trưởng chủng BDNR1 BDNR4 73 mơi trường muối khống SH1 chứa chất nhiễm khác 3.6 Hoạt tính enzyme ngoại bào BHN1, BDNR1 BTL2 77 3.7 So sánh trình tự đoạn gen 16S rARN chủng BHN1 84 số chủng đại diện 3.8 So sánh trình tự đoạn gen 16S rARN chủng vi khuẩn 87 BDNR1 số chủng đại diện 3.9 So sánh trình tự đoạn gen C23O DGEn12 số gen 91 đại diện khác 3.10 Số lượng gen C23O xác định real-time PCR 95 3.11 Số lượng gen C23O xác định real-time PCR 98 mẫu môi trường đất nhiễm chất độc hóa học DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Ba đường phân hủy PAH nấm vi khuẩn 1.2 Sơ đồ đại diện cho phân huỷ sinh học hợp chất thơm dạng 17 hình phễu 1.3 Con đường ngoại vi phân huỷ sinh học hợp chất thơm 19 1.4 Con đường trung tâm chuyển hóa có xúc tác naphthalen 21 1.5 Vị trí cắt vịng thơm enzyme dioxygenase ngoại bào 22 nội bào trình phân hủy hợp chất thơm 1.6 Vector pBS (Kan) T4MO để biểu định T4MO 30 thể đột biến 1.7 Sơ đồ phản ứng enzyme xúc tác cho phân hủy BTEX 31 3.1 Sơ đồ tóm tắt bước thí nghiệm luận án 56 3.2 Sự sinh trưởng số chủng vi khuẩn nguồn 59 PAH khác 3.3 Khả sử dụng PAH khác tập đoàn VSV từ 61 nước thải Cụm công nghiệp Từ Liêm 3.4 Sắc ký đồ HP-LC phân hủy PAH khác dịch 64 ni cấy tập đồn Đức Giang 3.5 Sự phân hủy PAH BDNR1, BTL2, BHN1 65 3.6 Sắc ký đồ HP-LC phân hủy PAH khác dịch 70 nuôi cấy chủng BHN1 3.7 Khả sinh trưởng chủng BDNR1 BDNR4 71 mơi trường muối khống SH1 chứa PAH nồng độ cao 3.8 Khả phát triển môi trường muối khoáng chứa 2,4-D 73 BDNR4 3.9 Khả loại bỏ PAH laccase thô sinh tổng hợp BHN1 80 3.10 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BHN1 phenanthren 82 3.11 Hình thái tế bào BHN1 kính hiển vi điện tử (JEL 82 5410LV X 10.000 lần) 3.12 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN từ DNA 83 tổng số chủng BHN1 M: thang DNA chuẩn kb 3.13 Cây phát sinh loại chủng BHN1 83 3.14 Hình thái khuẩn lạc (A) tế bào (B) chủng BDNR1 85 3.15 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN từ DNA tổng 85 số chủng vi khuẩn BDNR1 3.16 Trình tự đoạn gen 16S rRNA BDNR1 86 3.17 Cây phát sinh loại BDNR1 vi khuẩn gần gũi khác 86 3.18 Sản enzym 89 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzym catechol 2,3- 90 phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa monooxygenase (tmoA) từ DNA tổng số 3.19 dioxygenase từ DNA tổng số tập đồn DGEn12 3.20 Trình tự nucleotit trình tự axít amin đoạn gen mã hóa 90 enzyme catechol 2,3-dioxygenase tập đoàn DGEn12 3.21 Cây phát sinh chủng loại trình tự gen C230 từ tập đồn Đức 92 Giang 3.22 Đường chuẩn để xác định số gen C230 94 3.23 Số lượng gen C230 tập đoàn vi sinh vật từ 99 đất nhiễm chất độc hóa học 3.24 Quy trình phát gen C230 mẫu môi trường 101 79 Kim D, Chae JC, Zylstra GJ, Sohn HY, Kwon GS and Kim E (2005), Identifi tion of two-component regulatory genes involved in oxylene degradation by Rhodococcus sp.strainDK17, The Journal of Microbiology, 43, pp 49–53 80 Kolomytseva MP, Baskunov BP, Golovleva LA (2007), Intradiol pathway of para-cresol conversion by Rhodococcus opacus 1CP, Biotechnology Journal 81 Koschorreck K, Schmid RD and Urlacher VB, Improving the functional expression of a Bacillus licheniformis laccase by random and sitedirected mutagenesis, BMC Biotechnology, 9(12), pp 1-10 82 Krö kel L Fo ht DD 1987 , Construction of chlorobenzene-utilizing recombinants by progenitive manifestation of a rare event, Applied and Environmental Microbiology, 53(10), pp 2470–2475 83 Kubota M, Kawahara K, Sekiya K, Uchida T, Hattori Y, Futamata H, and Hiraishi A (2005), Nocardioides aromaticivorans sp.nov, a dibenzofuran degrading bacterium isolated from dioxinpolluted environments, Systematic and Applied Microbiology, 28, pp.165– 174 84 Kulakov LA, Chen S, Allen CC and Larkin MJ (2005), Web-type evolution of Rhodococcus gene clusters associated with utilization of naphthalene, Applied and Environmental Microbiology, 71, pp 1754–1764 85 Leach LH, Lewis TA (2006), Identification and characterization of Pseudomonas membrane transporters necessary for utilization of the siderophore pyridine-2,6-bis(thiocarboxylic acid) (PDTC), Microbiology, 152, pp 3157-3166 86 Leahy JG, Batchelor PJ, Morcomb SM (2003), Evolution of the soluble diiron monooxygenases, FEMS Microbiology Reviews, 27: 449– 479 116 87 Lee K, Park JW, Ahn IS (2003), Effect of additional carbon source on naphthalene biodegradation by Pseudomonas putida G7, Journal of Hazardous Materials, 105, pp 157–167 88 Lors C, Ryngaert A, Perie F, Diels L (2005), Evolution of the bacterial diversity during a biologycal treatment of PAHs contaminated soils Centre National de Recherche sur les Sites et Sols Pollues (CNRSSP), 930, Boulervad Lahure, B.P.537, 59505 Douai Cedex, France 89 Ludmila Martinkova, Bronislava Uhnakova, Miroslav Patek, Jan Nesvera, Vladimir Kren (2009), Biodegradation potential of genus, Rhodococcus Environmental International, 35, pp 153-177 90 Mahaffey WR, Gibson DT and Cerniglia CE (1988), Bacterial oxidation of chemical carcinogens: formation of polycyclic aromatic acids from benz[a]anthracene, Applied and Environmental Microbiology, 54, pp 2415-2423 91 Matthew BM, Cindi HN, Loring N (2004), Bench-scale and field-scale evaluation of catechol 2,3-dioxygenase specific primer for mornitoring BTX bioremediation, Water Research, 38, pp 12811288 92 Mesarch MB, Nakatsu CH and Nies L (2000), Development of catechol 2,3-dioxygenase-specific primers for monitoring bioremediation by competitive quantitative PCR, Applied and Environmental Microbiology, 66, pp.678-683 93 Mermod N, Ramos JL, Bairoch A and Timmis KN (1987), The xylS gene positive regulator of TOL plasmid pWWO:identification, sequence analysis and overproduction leading to constitutive expression of meta cleavage operon, Molecular and General Genetics, 207, pp 349-354 117 94 Nakazawa T, Inouye S and Nakazawa A (1980), Physical and functional mapping of RP4-TOL plasmid recombinants: analysis of insertion and deletion mutants, Journal of Bacterilogy, 144, pp 222-231 95 Newton CMG, Irina AK, Wolf-Rainer A, Kornelia S (2005), Effects of the inoculant strain Pseudomonas putida KT2442 (pNF142) and of naphthalene contamination on the soil bacterial community, FEMS Microbiology Ecology, 54 (1), pp 21–33 96 Nordlund I, Powlowski J and Shingler V (1990), Complete nucleotide sequence and polypeptide analysis of multicomponent phenol hydroxylase from Pseudomonas sp strain CF600, Journal of Bacterilogy, 172(12), pp 6826-6833 97 Oltmanns RH, Rast HG, Reineke W (1988), Degradation of 1,4-dichlorobenzene by enriched and constructed bacteria, Applied Microbiology and Biotechnology, 28, pp 609-616 98 Outten FW uffm n DL le J nd O’ llor n , The independent cue and cus systems confer copper tolerance during aerobic and anaerobic growth in Escherichiacoli, The Journal of Biological Chemistry, 17, pp.30670–30677 99 Reineke W (2001), Aerobic and anaerobic biodegradation potentials of microorganisms The Handbook of Environmental Chemistry Vol Park Biodegradation and Persistence Springer-Verlag Berlin Heidelberg 100 Rittman BE, McCarty PL (2001), Environmental biotechnology: principles and applications, McGraw Hill Publishers, New York, pp 754 101 Riva S (2006), Laccases: Blue enzymes for green chemistry, Trends in Biotechnology, 24(5), pp 219-226 102 R-T & A VII- Technologie a biotechnologie (Unido) Bioremediation of persistent organic pollutants - A Review 118 103 Ruggaber TP, ASCE M, Talley JW, ASCE PEM (2006), Enhancing bioremediation with enzymatic processes, Practice Periodical of Hazardous, Toxic, and Radioactive Waste Management, 10(2), pp.73-85 104 Ruijssenaars HJ and Hartmans S (2004), A cloned Bacillus halodurans multicopper oxidase exhibiting alkaline laccase activity, Applied Microbiology and Biotechnology, 65(2), pp 177-182 105 Sadhasivam S, Savitha S, Swaminathan K, Lin FH (2008), Prodcution, purifi tion nd h r teriz tion of mid-redox potential laccase from a newly isolated TrichodermaharzianumWL,1, Process Biochemistry, 43(7), pp 736–742 106 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press 107 Schell MA (1985), Transcriptional control of the nah and sal hydrocarbon-degradation operons by the nahR gene product, Gene, 36, pp 301–309 108 Schlomann M, Schmidt E and Knachmuss HJ (1990), Different types of dienelactone hydrolase in 4-fluorobenzoate utilizing bacteria, The Journal of Bacteriologyl, 172(9), pp 5112–5118 109 Schmidt E and Knackmuss HJ (1980), Chemical structure and biodegradability of halogenated aromatic compounds Conversion of chlorinated muconic acids into maleoylacetic acid, Biochemical Journal, 192, pp 339–347 110 Schoemaker HE and Piontek K (1996), On the interaction of lignin peroxidase with lignin, Pure and Applied Chemistry, 68(11), pp 2089-2096 111 Schweizer D, Markus A, Seez M, Ruf HH, Lingens F (1987), Purification and some properties of component B of the 4chlorophenylacetate 3,4-dioxygenase from Pseudomonas species 119 strain CBS 3, The Journal of Biological Chemistry, 262(19), pp 9340–9346 112 Seo JS, Keum YS and Li QX (2009), Bacterial Degradation of Aromatic Compounds Int, International Journal of Environmental Research and Public Health, 6, pp 278-309 113 Shao X (2009), Deletion and site-directed mutagnesis of laccase from Shigella dysenteriae results in enhanced enzymatic activity and thermostability, Enzyme and Microbial Technology, 44, pp 274280 114 Sharma P, Goel R, Capalash N (2007), Bacterial laccase, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 23, pp 823-832 115 Sharma S, Aneja MK, Mayer J, Schloter M, Munch JC (2004), RNA fingerprinting of microbial community in the rhizosphere soil of grain legumes, FEMS Microbiology Letters, 240(2), pp 181 – 186 116 Sharma S, Radl V, Hai B, Kloos K, Mrkonjic M, Engel M, Schauss K, Schloter M (2007), Quantification of functional genes from prokaryotes in soil by PCR, Journal of Microbiological Methods,68, pp.445-452 117 Shimp RJ and Pfaender FK (1987), Effect of adaptation to phenol on biodegradation of monosubstituted phenols by aquatic microbial communities, Applied and Environmental Microbiology, 53(7), pp 1496–1499 118 Solano-Serena F, Marchal R, Casaregola S, Vasnier C, Lebeault JM and Vandecarsteele JP (2000), A Mycobacterium strain with extended capacities for degradation of gasoline hydrocarbons, Applied and Environmental Microbiology, 66, pp 2392-2399 119 Stainthorpe AC, Lees V, Salmond GPC, Dalton H and Murrell JC (1990), The methane monooxygenase gene Methylococcus capsulatus (Bath), Gene, 91, pp 27-34 120 cluster of 120 Suemori H, Takahashi N and Noguchi S (1995), Hoxc9 mutant mice showanterior transformation of the vertebrae and malformation of the sternum and ribs, Mechanisms of Development, 51, pp 265– 273 121 Van der Meer JR, de Vos WM, Harayama S and Zehnder AJ (1992), Molecular mechanisms of genetic adaptation to xenobiotic compounds, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 56(4), pp 677-694 122 Van der Meer JR, Eggen RI, Zehnder AJ, de Vos WM (1991), Sequence analysis of the Pseudomonas sp strain P51 tcb gene cluster, which encodes metabolism of chlorinated catechols: evidence for specialization of catechol 1,2-dioxygenases for chlorinated substrates, Journal of Bacterilogy, 173(8), pp 2425–2434 123 Wang M, Ahrne S, Antonsson M and Molin G (2004), T-RFLP combined with principal component analysis and 16S rRNA gene sequencing: an effective strategy for comparison of fecal microbiota in infants of different ages, Journal of Microbiological Methods, 59, pp 53-69 124 Watanabe K, Teramoto M & Harayama S (2002), Stable augmentation of activated sludge with foreign catabolic genes harboured by an indigenous dominant bacterium, Environmental Microbiology, 4, pp 577–583 125 Weissenfels WD, Beyer M, Klein J and Rehm H J (1990), Microbial metabolism of fluoranthene: isolation and identification of ring fission products, Applied Microbiology and Biotechnology, 34(4), pp 528-535 126 Vila J, Lopez Z, Sabate J, Minguillon C, Solanas A M, Grifoll M (2001), Identification of a novel metabolite in the degradation of pyrene by Mycobacterium sp Strain AP1: Actions of the isolate on 121 two- and thre ỉtting polycyclic aromatic hydrocarbons, Applied and Environmental Microbiology, 67, pp 5497-5505 127 Yang Y, Chen R F and Shiaris M P (1994), Metabolism of naphthalene, fluorene, and phenanthrene: preliminary characterization of a cloned gene cluster from Pseudomonas putida NCIB 9816, Journal of Bacterilogy, 176(8), pp 2158-2164 128 Zhang C L and Bennett GN (2005), Biodegradation of xenobiotics by anaerobic bacteria, Applied Microbiology and Biotechnology, 67, pp 600-618 129 Zheng XJ, Blais JF, Mercier G, Bergeron M and Drogui P (2007), PAH removal from spiked municipal wastewater sewage sludge using biological, chemical and electrochemical treatments, Chemosphere 68(6), pp 1143-1152 130 Zille A (2005), Laccase reactions for textile applications Doctor thesis, University of Minho, Italia 131 Zincent M, Microbial bioremediation of hydrocarbon (PAHs) in oily sludge waste 122 polycyclic aromatic Phụ lục Trình tự chủng BHN1 đăng ký Genbank LOCUS NOV-2008 DEFINITION sequence ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM FJ179538 1496 bp DNA linear BCT 05- Sphingobacterium sp BHN1 16S ribosomal RNA gene, partial FJ179538 FJ179538.1 GI:210160933 Sphingobacterium sp BHN1 Sphingobacterium sp BHN1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteria; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Sphingobacterium REFERENCE (bases to 1496) AUTHORS Nguyen,B.N., Dang,H.T.C and Nguyen,T.T TITLE Research classification and degradation of PAH by bacterial strain BHN1 isolated from oil-contaminated wastewater JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1496) AUTHORS Nguyen,B.N., Dang,H.T.C and Nguyen,T.T TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (02-SEP-2008) Environmental Biotechnology, Institute of Bitechnology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Hanoi 10000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1496 /organism="Sphingobacterium sp BHN1" /mol_type="genomic DNA" /strain="BHN1" /isolation_source="oil-contaminated wastewater" /db_xref="taxon:563783" /country="Viet Nam: Ha Nam province" rRNA 1496 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 gtttgatcat atccatcgga caacctacct acagttcgca agctagttgg atcccccaca attggtcaat gttgtaaact gaagaataag ttatccggat cggtggctca cggaatagac gctcactaag gataccctgg agcgtcccag aaggaattga aggaacctta ggctcaggat gagcttgctc ctatcagggg tgttcagttg tagggtaacg ctggtactga gggcggaagc gcttttgtcc gatcggctaa ttattgggtt accatcgcag agtagcggtg ctggtattga tagtccaccg cgaaagcgta cgggggcccg cccgggcttg gaacgctagc gaagatggtg gatagcctct attaaatatt gcttaccaag gacacggacc ctgaaccagc tggaataaac ctccgtgcca taaagggtgc tgcctttgat aaatgcatag ccgctgatgc ccctaaacga agttatccac cacaagcgga aaagttagtg 123 ggcaggccta agagtggcgc cgaaagagag tataggatag gcgacgatgt agactcctac catgccgcgt ctctttacga gcagccgcgg gtaggcggcc actgatgggc atatgtctta acgaaagcgg tgatactcga ctggggagta ggagcatgtg aagagtgcag atacatgcaa acgggtgcgt attaacaccg agatgggctc ctaggggctc gggaggcagc gcaggatgac gtagagagct taatacggag tattaagtca ttgaatccat gaactccgat tgggggatcg ttgttggcgg cgcccgcagg gtttaattcg agacgcactc gtcggacggg aacgcgtgag cataacatca gcgtgacatt tgagaggaga agtaaggaat tgccctatgg gaatgtactg gatccgagcg gggtgaaata ttgaagtggg tgcgaaggca aacaggatta atagaacagc gtgaaactca atgatacgcg gtccttcggg 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 acacgaaact cccgtaacga agactgccgg ggcctgggct agctaatctc tcggaatcgc cacaccgccc gaggacggtt aggtgatgca gcgcaaccct tgacaaaccg acacacgtgc acaaaaccga tagtaatcgc gtcacaccat accacggtgt tggctgtcgt tgtccttagt gaggaaggtg tacaatggtc tcgtagtccg gaatcagaat gggagtgggt gattcatgac cagctcgtgt taccagcacg gggatgacgt ggtacagagg gatcgcagtc gtcgcggtga tgcaccagaa tggggtgaag cgtgagatgt ttatggtggg caagtcatca gttgccaagc tgcaactcga atacgttccc gtagctagtc tcgtaacaag tgggttaagt cactctaagg tggcccttac cgcgaggtgg ctgcgtgaag gggccttgta taaccttcgg gtagcc Phụ lục Trình tự chủng BDNR1 đăng ký Genbank LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM EU726633 545 bp DNA linear BCT 11-JUN-2008 Pseudomonas sp BDNR1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence EU726633 EU726633.1 GI:189475251 Pseudomonas sp BDNR1 Pseudomonas sp BDNR1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Pseudomonas REFERENCE (bases to 545) AUTHORS Nguyen,H.B., Nguyen,B.N., Phan,H.H.H., Nguyen,T.T., Nghiem,M.N and Dang,H.T.C TITLE Biodegradation of PAHs and dioxin by Pseudomonas sp BDNR1 strain isolated from soil samples collected in herbicide/dioxin contaminated soil biotreatment bioreactor JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 545) AUTHORS Nguyen,B.N., Phan,H.H.H., Nguyen,T.T., Dang,H.T.C., Nghiem,M.N and Nguyen,H.B TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (16-MAY-2008) Environmental Biotechnology (EBT), Inst of Biotechnology (IBT), Vietnamese Academy of Science and Technology (VAST), 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Hanoi 10000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 545 /organism="Pseudomonas sp BDNR1" /mol_type="genomic DNA" /strain="BDNR1" /isolation_source="herbicide/dioxin contaminated soil" /db_xref="taxon:537672" rRNA 545 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc 61 cgcgtgtgtg aagaaggtct tcggattgta aagcacttta agttgggagg aagggcagta 121 agttaatacc ttgctgtttt gacgttaccg acagaataag caccggctaa ctctgtgcca 181 gcagccgcgg taatacagag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcgc 241 gtaggtggtt tgttaagttg gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa ctgcatccaa 301 aactggcaag ctagagtacg gtagagggtg gtggaatttc ctgtgtagcg gtgaaatgcg 361 tagatatagg aaggaacacc agtggcgaag gcgaccacct ggactgatac tgacactgag 421 gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 481 gtcaactagc cgttggaatc cttgagattt tagtggcgca gctaacgcat taagttgacc 541 gcctg 124 Phụ lục Trình tự gen C230 đăng ký Genbank LOCUS DEFINITION FJ853149 722 bp DNA linear ENV 03-MAY-2009 Pseudomonas sp enrichment culture clone DGEn-12 catechol 2,3-dioxygenase gene, partial cds ACCESSION FJ853149 VERSION FJ853149.1 GI:227937299 KEYWORDS ENV SOURCE Pseudomonas sp enrichment culture clone DGEn-12 ORGANISM Pseudomonas sp enrichment culture clone DGEn-12 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Pseudomonas; environmental samples REFERENCE (bases to 722) AUTHORS Nguyen,B.N and Dang,H.T.C TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (17-MAR-2009) Environmental Biotechnology (EBT), Inst of Biotechnology (IBT), Vietnam Academy of Science and Technology (VAST), 18-Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi 10000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 722 /organism="Pseudomonas sp enrichment culture clone DGEn-12" /mol_type="genomic DNA" /isolation_source="sediment from Duc Giang factory" /db_xref="taxon:633810" /clone="DGEn-12" /environmental_sample CDS 722 /note="C230; predicted ring-cleavage extradiol dioxygenase" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="catechol 2,3-dioxygenase" /protein_id="ACP43296.1" /db_xref="GI:227937300" /translation="MDVMGFKVVDEDALRQLERDLTAYGCAVEQLPAGELNSCGRRVR FQAPSGHHFELYADKEYTGKWGVNEVNPEAWPRDLKGMAAVRFDHCLLYGDELPATYD LFTKVLGFYLAEQVLDENGTRVAQFLSLSTKAHDVAFIHHPEKGRLHHVSFHLETWED VLRAADLISMTDTSIDIGPTRHGLTHGKTIYFFDPSGNRSEVFCGGNYSYPDHKPVTW LAKDLGKAIFYHDRVLNERFLTV" ORIGIN atggatgtta tggggttcaa ggttgtggat gaggatgctc tccggcaact ggagcgggat 61 ctgacggcat atggctgtgc cgttgagcag ctacccgcag gtgaactgaa cagttgtggc 121 cggcgcgtgc gcttccaggc accctccggg catcacttcg agttgtatgc agacaaggaa 181 tatactggaa agtggggtgt gaatgaggtc aatcccgagg catggccgcg cgatctgaaa 241 ggcatggcgg ctgtgcgttt cgatcattgc ctactgtatg gcgacgaatt gccggcgacc 301 tatgacctgt tcaccaaggt gctcggcttc tatctggccg aacaggtgct ggacgaaaat 361 ggcacgcgcg tcgcccagtt cctcagtctg tcgaccaagg cccacgacgt ggccttcatt 421 caccatccgg aaaaaggccg cctccatcat gtgtcctttc acctcgaaac ctgggaagac 481 gtgcttcgcg ccgccgacct gatctccatg accgacacct ctatcgacat cggcccgacc 541 cgtcatggcc tgacccacgg caagaccatc tacttcttcg acccgtccgg taaccgcagc 601 gaggtgttct gcggcggcaa ctacagctat ccggatcaca agccggtgac ctggctggct 661 aaggacctgg gcaaggcgat cttctatcac gaccgtgtgc tcaacgaacg attcctgacc 721 gt 125 Phụ lục c ph ng ph p c đ nh hoạt tính Laccase, MnP LiP Hiện tồn nhiều phương pháp xác định ba loại enzyme LiP, MnP laccase khác Để tiện cho việc so sánh hoạt lực enzyme, việc đưa định nghĩa phương pháp phân tích vấn đề cần thiết Nguyên tắc: Đo lượng sản phẩm tạo thành từ q trình phân hủy chất có mặt enzyme phương pháp quang phổ hấp thụ Sản phẩm tạo thành hấp thụ mạnh bước sóng thích hợp Đơn vị enzyme (U) lượng enzyme cần thiết để thể xúc tác tạo thành 1µM sản phẩm từ chất thời gian phút điều kiện thí nghiệm 4.1 Xác định hoạt tính enzyme LiP Nguyên tắc: Dựa oxy hóa 2,4-dichlorophenol (2,4-D) enzyme tạo thành sản phẩm có độ hấp thụ mạnh bước sóng 510 nm [57] Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ lignin peroxidase lượng enzyme cần thiết để tạo thành µM sản phẩm từ 2,4-DCP thời gian phút, điều kiện thí nghiệm Thành phần phản ứng: Thành phần phản ứng Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm Đệm kali phosphate PPB (50 mM, pH = 7) 500 µl 500 µl 4-aminoantipyrine, 0,164 mM 50 µl 50 µl 2,4-DCP mM 200 µl 200 µl Dịch enzyme 200 µl 200µl H2O2 mM µl 50 µl Nước khử ion 50 µl µl Phản ứng diễn cho H2O2 vào hỗn hợp, giá trị OD đo sau phút 126 Công thức tính: U (ODM  ODC )  V pu  10  D f VE   Trong đó: U: Hoạt độ enzym (U/l) ε: hệ số hấp thụ, ε510 = 21647 M-1cm-1 Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml) VE: Thể tích enzyme (0,2 ml) ODM: Giá trị OD đo mẫu thí nghiệm ODC: Giá trị OD đo mẫu đối chứng Df: Độ pha lỗng 4.2 Xác định hoạt tính MnP Ngun tắc: Dựa oxi hóa phenol đỏ enzyme MnP tạo thành hợp chất hấp thụ mạnh bước sóng 610 nm [59] Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ MnP lượng enzyme cần thiết để oxy hóa phenol đỏ tạo thành µM sản phẩm hấp thụ bước sóng 610 nm thời gian phút, điều kiện thí nghiệm Thành phần phản ứng: Mẫu đối Thành phần phản ứng chứng Đệm kali phosphate PPB (100 mM, Mẫu thí nghiệm ml ml MnSO4 0,1 mM 200 µl 200 µl Phenol đỏ 0,1 mM 300 µl 300 µl Dịch enzyme ml ml H2O2 50 mM µl 500 µl Nước khử ion 500 µl µl pH = 7) 127 Phản ứng diễn cho H2O2 vào hỗn hợp, sau phút 30 giây dừng phản ứng cách cho 40 µl NaOH 5M vào ml mẫu, xác định giá trị OD bước sóng 610 nm Cơng thức tính: U (ODM  ODC )  V pu  10  D f VE  1,5   Trong đó: U: Hoạt độ enzyme (U/l) ε: hệ số hấp thụ, ε610 = 4460 M-1cm-1 Vpu: Tổng thể tích phản ứng (5 ml) VE: Thể tích enzyme (1 ml) ODM: Giá trị OD đo mẫu thí nghiệm ODC: Giá trị OD đo mẫu đối chứng Df: Độ pha lỗng 4.3 Xác định hoạt tính laccase Ngun tắc: Hoạt độ laccase xác định tăng độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 420 nm, điều kiện thí nghiệm Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase lượng enzyme cần thiết để tạo thành µM sản phẩm từ ABTS (2,2 '-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) thời gian phút, điều kiện thí nghiệm Thành phần phản ứng: Thành phần Đối chứng (ml) Thí nghiệm (ml) Đệm acetate (20mM), pH 0,8 0,6 Dịch lên men 0,2 0,2 ABTS (5mM) 0,2 Tổng thể tích 1 Phản ứng xảy cho ABTS vào hỗn hợp Giá trị OD đo sau phút 128 Cơng thức tính: U (OD  ODo )  V pu  10  D f VE  t   Trong đó:U: Hoạt độ enzym (U/l) ε: Hệ số hấp thụ ánh sáng bước sóng 420nm, ε= 36.000 (M-1cm-1) Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml) VE: Thể tích enzyme (0,2 ml) ODτ: Giá trị OD đo thời điểm τ ODo: Giá trị OD đo thời điểm τ = Df: Độ pha loãng t: Thời gian phản ứng Phương pháp đo : Bước 1: Hút thành phần phản ứng gồm 600 µl đệm acetate natri (20 mM, pH = 5), 200 µl dịch enzyme; Bước 2: Xác định OD dung dịch thời điểm τ = 0: Hút 200 µl ABTS 2,5 mM vào ống nghiệm chứa thành phần bước 1, vontex chuyển sang cuvet, đọc giá trị OD bước sóng 420 nm; Bước 3: Xác định giá trị OD dung dịch phản ứng thời điểm τ: Hút 200 µl ABTS 2,5 mM vào ống nghiệm chứa thành phần bước 1, vortex thời gian ι (thường phút) Đọc giá trị OD bước sóng 420 nm Lặp - lần để lấy giá trị OD trung bình 129 Phụ lục cb c tinh ạch n ph m P b ng kit QiAgen B c 1: Hút đệm PB tích gấp lần thể tích sản phẩm PC vào ependroff có chứa sản phẩm PC , trộn chuyển toàn lên màng lọc cột lọc B c : Lọc tự nhiên 10 phút B c 3: Ly tâm 12 000 v ng/ phút 30-60 s B c 4: Bỏ dịch B c 5: Thêm 700 ml đệm PE lên màng lọc B c 6: Ly tâm 12000 v ng / phút 30 -60 s B c 7: Chuyển màng lọc sang ependroff cắt nắp để kh 10 phút B c 8: Chuyển qua ependroff thêm 35 μl DES để phút B c 9: Ly tâm 10 000 v ng/ phút phút B c : Thu sản phẩm tinh đem đọc trình tự 130 ... ? ?Nghiên cứu khả phân hủy hydrocarbon thơm gen chức số tập đoàn vi khuẩn? ?? với mục đích nội dung nghiên cứu sau: Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu khả phân hủy hydrocarbon (HC) thơm số tập đoàn vi. .. phạm vi nghiên cứu - Vi khuẩn tập đoàn vi sinh vật phân hủy HC thơm số hệ thống xử lý ô nhiễm chất - Một số gen chức thị cho trình phân hủy HC thơm Nội dung nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn nghiên. .. nghiên cứu khả phân hủy sinh học HC thơm vài vi sinh vật đại diện; Nghiên cứu, đánh giá khả phân hủy HC thơm số tập đoàn chủng vi khuẩn vài hệ thống xử lý ô nhiễm; Nghiên cứu, đánh giá có mặt số gen