TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. BIA VÀ CÁC SẢN PHẨM BIA. 1.1 Khái niệm bia: Bia là một loại nước uống chứa cồn được sản xuất bằng quá trình lên men của đường trong môi trường lỏng và nó không được chưng cất sau khi lên men. Nói một cách khác, bia là loại nước giải khát có độ cồn thấp, bọt mịn xốp và có hương vị đặc trưng của hoa houblon. Đặc biệt CO¬2 hòa tan trong bia có tác dụng giải nhiệt nhanh, hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa. Ngoài ra trong bia còn chứa một lượng vitamin khá phong phú (chủ yếu là vitamin nhóm B như vitamin B1, B2, PP…). Nhờ những ưu điểm này, bia được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các nước trên thế giới với sản lượng ngày càng tăng. Đối với nước ta, bia đã trở thành loại đồ uống quen thuộc với sản lượng ngày càng tăng và đã trở thành ngành công nghiệp mũi nhọn trong ngành công nghiệp nước ta. Quá trình sản xuất bia được gọi là nấu bia. Do các thành phần sử dụng để sản xuất bia có khác biệt tùy theo từng khu vực, các đặc trưng của bia như hương vị và màu sắc cũng thay đổi rất khác nhau. 16 1.2. Lịch sử phát triển ngành sản xuất bia: Sản xuất bia là một ngành công nghiệp thực phẩm có bước phát triển nhanh chóng mặc dù trải qua nhiều thăng trầm của thời gian, công nghệ kĩ thuật và nhận thức của cộng đồng. Xét về nguồn gốc, bia có xuất xứ từ các sản phẩm Nông nghiệp. Các chứng cứ cho thấy rằng bia được pha chế tại xung quanh vùng Lưỡng Hà khoảng 6000 đến 7000 năm trước. Người Ai Cập cổ đại đó ủ rượu, bia bằng các loại ngũ cốc của họ (lúa miến), việc này cũng được thưc hiện trong những bộ lạc người châu Phi.. Từ thế kỷ thứ 10 trong giai đoạn này việc sử dụng thảo dược rất phổ biến và người Đức đó sử dụng Houblon trong sản xuất bia sau đó Houblon được phổ biến toàn Châu âu. Ban đầu việc sử dụng Houblon bị chống đối kịch liệt nhưng những lợi ích mà Houblon mang lại cho sản phẩm bia như hương thơm và nhất là khả năng kháng khuẩn của chúng đã làm cho chúng dần dần được chấp nhận rộng rãi. Đến khoảng thế kỉ 17 những loại bia không sử dụng Houblon hoàn toàn biến mất thế vào đó là sự đa dạng của các sản phẩm bia, tùy thuộc vào vùng nguyên liệu và điều kiện khí hậu mà cho ra những loại bia có nét đặc trưng riêng. Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất bia là lúa đại mạch tuy nhiên cũng có thế thay thế bởi nguyên liệu khác như yến mạch, lúa mì, gạo…Trong thời gian này việc đánh thuế của một số địa phương trên sản phẩm bia là rất cao và bia chỉ được bán trong những quán rượu. Năm 1516 một đạo luật ra đời tại Reinheitsgebot nhằm bảo hộ cho sản phẩm bia của Đức có tên “Luật độ thuần khiết của sản phẩm bia Đức”, các chỉ tiêu về Đại mạch, Houblon và nước để sản xuất bia được nêu ra cụ thể. Nấm men cũng được đưa vào danh sách khi chúng có nguồn gốc rõ ràng (định danh). Đến thế kỉ 18 thì có những chuyển biến lớn trong ngành sản xuất bia với sự phát triển của ngành sinh hóa và vi trùng học. Trong thời gian này bia thường được chứa nhiều tháng trong những thùng lớn trước khi đem đi tiêu thụ. Đây là biện pháp kéo dài thời gian ủ chín (lên men phụ) nhằm khắc phục nhược điểm của việc lên men bằng chủng nấm men Brettanomyces là chủng tạo ra acid béo và ester ethyl với mức độ cao vượt ngưỡng cho phép gấp 10 lần mặc dù nồng độ cồn do chủng này tạo ra cao hơn so với các chủng khác. Bên cạnh đó việc áp dụng cơ giới hóa vào sản xuất đó không ngừng nâng cao sản lượng bia sản xuất lên rất nhiều.
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH TỔNG QUAN TÀI LIỆU BIA VÀ CÁC SẢN PHẨM BIA 1.1 Khái niệm bia: Bia loại nước uống chứa cồn sản xuất q trình lên men đường mơi trường lỏng khơng chưng cất sau lên men Nói cách khác, bia loại nước giải khát có độ cồn thấp, bọt mịn xốp có hương vị đặc trưng hoa houblon Đặc biệt CO hòa tan bia có tác dụng giải nhiệt nhanh, hỗ trợ cho q trình tiêu hóa Ngồi bia chứa lượng vitamin phong phú (chủ yếu vitamin nhóm B vitamin B1, B2, PP…) Nhờ ưu điểm này, bia sử dụng rộng rãi hầu giới với sản lượng ngày tăng Đối với nước ta, bia trở thành loại đồ uống quen thuộc với sản lượng ngày tăng trở thành ngành công nghiệp mũi nhọn ngành công nghiệp nước ta Quá trình sản xuất bia gọi nấu bia Do thành phần sử dụng để sản xuất bia có khác biệt tùy theo khu vực, đặc trưng bia hương vị màu sắc thay đổi khác [16] 1.2 Lịch sử phát triển ngành sản xuất bia: Sản xuất bia ngành cơng nghiệp thực phẩm có bước phát triển nhanh chóng trải qua nhiều thăng trầm thời gian, công nghệ - kĩ thuật nhận thức cộng đồng Xét nguồn gốc, bia có xuất xứ từ sản phẩm Nông nghiệp Các chứng cho thấy bia pha chế xung quanh vùng Lưỡng Hà khoảng 6000 đến 7000 năm trước Người Ai Cập cổ đại ủ rượu, bia loại ngũ cốc họ (lúa miến), việc thưc lạc người châu Phi Từ kỷ thứ 10 giai đoạn việc sử dụng thảo dược phổ biến người Đức sử dụng Houblon sản xuất bia sau Houblon phổ biến toàn Châu âu Ban đầu việc sử dụng Houblon bị chống đối kịch liệt lợi ích mà Houblon mang lại cho sản phẩm bia hương thơm khả kháng khuẩn chúng làm cho chúng chấp nhận NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH rộng rãi Đến khoảng kỉ 17 loại bia khơng sử dụng Houblon hồn tồn biến vào đa dạng sản phẩm bia, tùy thuộc vào vùng nguyên liệu điều kiện khí hậu mà cho loại bia có nét đặc trưng riêng Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất bia lúa đại mạch nhiên thay nguyên liệu khác yến mạch, lúa mì, gạo…Trong thời gian việc đánh thuế số địa phương sản phẩm bia cao bia bán quán rượu Năm 1516 đạo luật đời Reinheitsgebot nhằm bảo hộ cho sản phẩm bia Đức có tên “Luật độ khiết sản phẩm bia Đức”, tiêu Đại mạch, Houblon nước để sản xuất bia nêu cụ thể Nấm men đưa vào danh sách chúng có nguồn gốc rõ ràng (định danh) Đến kỉ 18 có chuyển biến lớn ngành sản xuất bia với phát triển ngành sinh hóa vi trùng học Trong thời gian bia thường chứa nhiều tháng thùng lớn trước đem tiêu thụ Đây biện pháp kéo dài thời gian ủ chín (lên men phụ) nhằm khắc phục nhược điểm việc lên men chủng nấm men Brettanomyces chủng tạo acid béo ester ethyl với mức độ cao vượt ngưỡng cho phép gấp 10 lần nồng độ cồn chủng tạo cao so với chủng khác Bên cạnh việc áp dụng giới hóa vào sản xuất khơng ngừng nâng cao sản lượng bia sản xuất lên nhiều Tổng sản lượng bia toàn giới năm 1910 100 triệu hl, đến năm 1995 1190 triệu hl đến năm 2003 đạt 1444 triệu hl Nhìn chung sản lượng bia giới tăng trưởng nhanh lại phân bố không châu lục, tập trung Châu Âu Châu Mỹ Bên cạnh sản lượng bia khu vực khác năm gần tăng trưởng nhanh, đặc biệt nước Châu Á, đứng thứ giới sau Châu Âu Châu Mỹ Hiện Châu Á, Trung Quốc nước thị trường rộng lớn thị trường phát triển mạnh nhất, Nhật Bản mức độ vừa phải từ năm 1990 trở lại Ở Việt Nam, ngành cơng nghiệp sản xuất bia có lịch sử 100 năm Xưởng sản xuất bia đặt tên xưởng sản xuất bia Chợ Lớn, người Pháp tên Victor Larue mở vào năm 1875, tiền thân nhà máy bia Sài Gòn, Tổng cơng ty Bia Rượu Nước giải khát Sài Gòn Ở NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH miền Bắc, vào năm 1889, người Pháp tên Hommel mở xưởng bia Làng Đại Yên, Ngọc Hà, sau trở thành nhà máy bia Hà Nội, Tổng công ty Bia Rượu Nước giải khát Hà Nội Trong trình hình thành phát triển, ngành sản xuất bia đạt mức tăng trưởng cao vào năm thời kỳ mở cửa Cùng với trình hội nhập, ngành sản xuất bia phát triển quy mơ trình độ cơng nghệ, trở thành ngành cơng nghiệp mạnh Việt Nam gia nhập tổ chức WTO Hình 2.1: Mức tiêu thụ bình quân đầu người qua năm Việc đầu tư xây dựng nhà máy bia triển khai mạnh mẽ từ năm 1990 trở lại Số nhà máy bia 469 vào năm 1998 với quy mô khác từ 100.000 lít/năm đến 100 triệu lít/năm Mức tiêu thụ bình qn đầu người tăng lên nhanh chóng vòng 10 năm qua từ mức 10 lít/người năm vào năm 1997 đạt mức 18 lít/người.năm vào năm 2006 Theo số liệu thống kê Bộ Công nghiệp (nay Bộ Công Thương) tổng sản lượng bia Việt Nam qua năm gần thể hình Mặc dù, đến năm 2005 số sở sản xuất 329, quy mơ doanh nghiệp tăng lên Số liệu thống kê cho thấy ngành sản xuất bia có doanh nghiệp có sản lượng 100 triệu lít/năm Sabeco (năng lực sản xuất 300 triệu lít/năm), Habeco (trên 200 triệu lít/năm) cơng ty liên doanh nhà máy bia Việt Nam (trên 100 triệu lít/năm) Có 15 doanh nghiệp bia có cơng suất lớn 15 triệu lít 19 doanh nghiệp có sản lượng sản xuất thực tế 20 triệu lít Khoảng 268 sở lại có lực sản xuất triệu lít/năm NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH Hình 2.2 : Sản lượng bia nước qua năm Theo lộ trình phát triển dự kiến đến năm 2010 nước sản xuất khoảng 2,5 – tỷ lít bia mức tiêu thụ bình qn đầu người khoảng 28-30 lít/người/năm Với tốc độ phát triển nhanh nay, nhiều nhà máy bia mô lớn đầu tư kéo theo nhiều vấn đề quan trọng sử dụng nguồn nguyên liệu, khoa học kĩ thuật phuơng pháp di truyền, lai tạo giống nấm men cho hiệu sản xuất cao chất lượng bia tốt [2] 1.3 Tính chất chung bia Bia thơng thường có thành phần sau 1.3.1 Chất hòa tan (chất trích ly) Chiếm 3,5 ÷ 5,0% trọng lượng bia Chất hòa tan (chất trích ly) bia chiếm hàm lượng không lớn, song phong phú thành phần hóa học mà có tính chất định đến chất lượng bia Cụ thể chất hòa tan (chất trích ly) bia gồm có: 1.3.1.1 Hydrat cacbon : Chiếm 80 ÷ 85% chất hòa tan bia Trong số này, riêng maltose maltotriose chiếm khoảng 60 ÷ 70%, lại đường khác glucose, saccarose, pentose, arabinose, xylose,… 1.3.1.2 Protein : Chiếm ÷ 9% chất hòa tan bia (khoảng 700 mg/l chất chứa Nitơ) Trong đó: - 140 mg/l protein có phân tử lượng cao - 120 mg/l protein có phân tử lượng trung bình - 440 mg/l protein có phân tử lượng thấp 1.3.1.3 Glyceryl : NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH Chiếm ÷ 5%, sản phẩm phụ hình thành lên men (khoảng 1200 ÷ 1600 mg/l) 1.3.1.4 Các chất tro: Chiếm ÷ 4% trọng lượng chất hòa tan, tức khoảng 1,4 ÷ 1,8g/l Trong 30% photphat, lại clorit, silicat, cation K+, Na+, Ca+, Mg2+,… 1.3.1.5 Các chất đắng – tanin (chát) – màu: - Hàm lượng chất đắng (đơn vị EBC): Khoảng 15 ÷ 20 mg/l theo izo – α – acid α - acid đắng - Khoảng 150 mg/l tanin Trong 2/3 từ malt; 1/3 từ hoa houblon - Hàm lượng chất màu: + 50 ÷ 70 mg/l antocyanuagen + 10 ÷ 12 mg/l catechine + 10 ÷ 40 mg/l tannoide 1.3.1.6 Các acid hữu cơ: Chiếm 0,7 ÷ 1,0% trọng lượng chất hòa tan bia tức khoảng 300 ÷ 400 mg/l, đó: + 50 ÷ 70 mg/l pyruvat + 170 ÷ 220 mg/l citrate + 30 ÷ 110 mg/l malat + 30 ÷ 100 D - L - lactate 1.3.1.7 Các vitamin: Tuy hàm lượng nhỏ song đa dạng: B 1, B2, B6, biotin, nocotinamit, acid pantotenoic Với sản phẩm bia, vị có ảnh hưởng lớn đến chất lượng Vị tùy thuộc vào nguyên liệu đầu vào như: malt, hoa houblon, nước, nấm men q trình cơng nghệ tạo nên malt bia Yếu tố O gây ảnh hưởng mạnh lên tính ổn định vị bia Các q trình oxy hóa làm ảnh hưởng tới tính chất sau: độ ổn định hóa - lý, nhạy cảm với nhiệt độ, màu sắc, vị đắng, độ ổn định vị, thời gian sử dụng Giới hạn gây hại O2 bia sau: < 0,6 mg O2/l: Đối với loại bia nhạy cảm NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH ≥ 1,0 mg O2/l: Bắt đầu gây hại nhiệt độ cao ≥ 2,0 mg O2/l: Gây hại rõ ràng thời gian ngắn 1.3.2 Các chất dễ bay - Etanol: 3,4 ÷ 4,5% trọng lượng bia - Acid carbonic: 0,35 ÷ 0,55% trọng lượng bia - Nước: 90 ÷ 92% trọng lượng bia.[1][5][6] 1.4 Vai trò bia: Bia loại thức uống mát, bổ với vị đắng dễ chịu hương thơm đặc trưng, độ cồn thấp Với bia, sử dụng mức mang đến cho người sảng khoái, dễ chịu tăng sức đề kháng cho thể Hàm lượng nước: chiếm 90% bia, với hàm lượng nước nâng cao, bia giúp giải khát tốt cho người sử dụng, uống vào CO bia thoát cho ta cảm giác mát lạnh lưỡi Chất khoáng: bia có khoảng 30 loại chất khống mà chủ yếu trích ly từ malt như: Mg, P, K…Ngồi bia chứa lượng thấp Na Ca giúp giảm nhanh khát Vitamin: bia chứa hầu hết vitamin nhóm B (B2, B6, PP), nhóm A, D E, vitamin kể cần thiết người Polyphenol: có khoảng 150mg/l bia Nó giúp chống lại nguy bệnh tim mạch ung thư Cacbon dioxit (CO2): việc làm cho bia có cảm giác thơm ngon, làm tăng khả tiết nước tiểu, tăng khả tiêu hóa thể Năng lượng: lít bia uống cung cấp cho người lượng từ 500 – 600 calori.[1][5][6] 1.5 Phân loại bia: 1.5.1 Phân loại theo tính chất Có nhiều loại bia khác nhau, loại bia coi thuộc kiểu bia cụ thể Yếu tố để xác định loại bia men bia sử dụng trình lên NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH men Phần lớn kiểu bia thuộc hai họ lớn: ale- sử dụng lên men nồi lager- sử dụng lên men chìm Bia có đặc trưng pha trộn ale va lager coi bia lai Đồ uống chứa cồn sản xuất từ việc lên men đường thu từ nguồn ngũ cốc, nói chung khơng gọi “bia”, chúng sản xuất phản ứng sinh học gốc men bia Mật ong lên men gọi la rượu mật ong, nước táo lên men gọi rượu táo, nước lê lên men gọi rượu lê, nước nho lên men gọi rượu vang Ale: Ale loại bia sản xuất lên men nổi, thơng thường lên men nhiệt độ cao so với bia lager (15-23 0C) Các men bia ale nhiệt độ tạo lượng đáng kể ester, hương liệu thứ cấp sản phẩm tạo mùi khác, kết bia tạo có mùi vị hoa hay tương tự Các khác biệt kiểu loại ale nhiều so với loại lager, nhiều loại bia ale khó để phân loại chúng.[15] Lager: Lager loại bia tiêu thụ nhiều giới Chúng có nguồn gốc từ vùng Trung Âu Men bia lager loại lên men chìm, thơng thường lên men nhiệt độ 7-120C (45-550F), sau lên men thứ cấp lâu 0-40C Bia đen porter Zywiec Bia vàng Hoavener Hình2.3 : Bia Lager (30-40 F) Trong giai đoạn lên men thứ cấp, lager làm chín Các điều kiện lạnh kiềm chế việc sản xuất tự nhiên ester phụ phẩm khác, tạo hương vị “khô lạnh hơn” bia.[15] Loại bia hỗn hợp: Kiểu bia lai hay bia hỗn hợp sử dụng nguyên liệu công nghệ đại bổ sung càc khía cạnh truyền thống sản xuất bia Mặc dù có số biến thái nguồn khác nhau, nói chung bia hỗn hợp là: • Bia rau hỗn hợp với số loại phụ gia từ hoa lên men q trình lên men, tạo chất lượng hài hòa cách rõ nét NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH • Bia thảo mộc bia gia vị bổ sung chất chiết từ rễ, hạt, lá, hoa hay thảo mộc loại gia vị thay bổ sung hoa bia • Các loại bia tồn trữ thùng gỗ loại bia truyền thống hay thực nghiệm đưởc lưu trữ thùng gỗ tiếp xúc với gỗ khoảng thời gian Thông thường, thùng gỗ hay miếng gô xử lý số loại rượu mạnh hay đồ uống chứa cồn • Bia hun khói loại bia mà mạch nha hun khói Thơng thường loại bia có mùi hương vị khói Điển hình kiểu bia truyền thống bia Rauchbiers • Bia đặc biệt cách gọi chung để loại bia sản xuất mà sử dụng nguồn đường, hạt ngũ cốc tinh bột lên men khơng thơng dụng.[15] 1.5.2 Phân loại theo hình thức Trên thị trường có loại bia chủ yếu: Bia tươi, bia chai/lon, bia • Bia tươi: sản phẩm lên men có bão hòa CO2 tự nhiên, bia tươi có qua q trình trùng nhiệt độ thấp so với nhiệt độ trùng thời gian ngắn so với bia chai/lon Bia tươi có màu sắc, hương vị nguyên thủy sản phẩm sau lên men Bia tươi khơng bảo quản lâu • Bia chai/lon: bia có qua q trình trùng nhiệt độ cao thời gian dài, chất lượng bia tương đối có sử dụng liệu khơng nhiều (70% malt, 30% gạo) Bia chai/lon bảo quản lâu • Bia hơi: bia khơng qua q trình trùng, chất lượng bia thấp so với bia tươi chai/lon, sử dụng nhiều liệu lượng CO phải 10 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH nạp từ bên ngồi vào Hình 2.4 : số loại bia lon thị trường PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN BIA 2.1 Làm bia: Trong trình lên men phụ tàng trữ, bia lam cách tự nhiên chưa đạt đến mức độ cần thiết Màu đục bia lý giải diện nấm men, hạt phân tán học, hạt dạng keo, phức chất protein- polyphenol, nhựa đắng nhiều loại hạt li ti khác Tất cấu tử góp phần làm giảm độ bền bia chúng tồn Vì muốn làm tăng độ bền bia, với mục đích tăng thời gian bảo quản chúng lưu hành thị trường, cần phải lại bỏ tất cấu tử gây đục cho bia, phương pháp nhân tạo Có hai giải pháp để lam bia: lọc ly tâm Nguyên tắc lọc bia xây dựng hai trình: − Giữ chặt lực học tất hạt có kích thước lón kích thước lỗ hổng vật liệu học − Hấp phụ hạt có kích thước bé hơn, chí hạt hòa tan dạng keo hạt hòa tan phân tử Độ tinh thể bia đạt nhờ có q trình thứ hai Hiệu trình hấp phụ, phụ thuộc trước hết vào chất chất hấp phụ chất bị hấp phụ, sau thời điểm q trình lọc Trong cơng nghiệp sản xuất bia, loại vật liệu lọc sử dụng rộng rãi gồm có: − Xelluloza trộn với bột axbetit ép chặt thành bánh hình tròn (hoặc hình chữ nhật hình vng) Vì độ dày bánh lớn, thuật ngữ chuyên ngành, chúng gọi khối lọc 11 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH − Sợi xelluloza dệt ép thành tấm, tiến hành lọc bia phải phủ bột diatomit Vì độ dày bé, chúng lại bền dai, thuật ngữ chuyên ngành chúng gọi lọc − Cả hai loại vật liệu lọc sử dụng nhiều lần Đối với khối lọc, sau lần tái sử dụng, ta phải bổ sung thêm lượng mới.Khối lọc qua sử dụng, có khả hấp phụ mạnh khối lọc mới, xếp thứ ba diatomit Tuy khả hấp phụ thấp nay, loại vật liệu trợ lọc dùng nhiều Lý la bia lọc diatomit không bị thay đổi chất lượng có độ bền sinh học cao Trong q trình lọc xảy tượng giảm nồng độ chất hòa tan bia Do phần hạt dạng keo bị loại độ nhớt bia sau lọc bị giảm khả tạo bọt bị giảm Vì lẽ đó, ý tưởng lọc bia hai lần để bia đạt độ tinh thể thực hậu làm giảm tiêu cảm quan khác Lọc bia ln ln dẫn đến hao phí khối lượng hao phí CO2, q trình thực hệ thống hồn tồn kín Sự hao phí CO giảm bớt cách trước lúc lọc, bia làm lạnh đến OoC Gỉai pháp có điểm tạo trước cho bia điều kiện gây đục nhiệt độ thấp, có sau tượng không bị lặp lại Ly tâm phương pháp thứ hai thường sử dụng sản xuất để làm bia Việc tách hạt phân tán khỏi pha lỏng, hoàn tồn mang tính chất học Chính mà thay đổi thành phần tính chất bia sau ly tâm không đáng kể Ngồi ra, giải pháp ly tâm có ưu điểm thuận tiện mặt khí làm việc Bên cạnh ưu điểm, giải pháp có số nhược điểm nhỏ ta cần phải lưu ý Đó là, ly tâm, nhiệt độ bia tăng lên Theo số tác giả bia sau ly tâm có tính khử yếu so với bia lọc Vì lý đó, làm lạnh bia trước lúc ly tâm công việc bắt buộc phải làm.[3][4] 2.2 Bão hòa CO2: 12 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH men Vì số lượng vi khuẩn nhiều số lượng nấm mốc nên để ngăn cản phát triển vi khuẩn khuẩn lạc nấm mốc, tác nhân ức chế vi khuẩn thêm vào môi trường nuôi cấy Các thuốc nhuộm bengal rose kháng sinh streptomycine, neomycine thường sử dụng tác nhân ức chế vi khuẩn Một biện pháp đơn giản để ức chế phát triển vi khuẩn hạ thấp pH môi trường nuôi cấy xuống khoảng 4,5 - 5,5 Hầu hết nấm mốc không bị tác động phát triển khoảng pH vi khuẩn bị ức chế Môi trường chọn xác lập công thức để ức chế phát triển nhóm vi sinh vật cho phép nhóm vi sinh vật khác phát triển Ví dụ mơi trường Saubouraud Dextrose Agar dùng để định lượng nấm mốc dựa nguyên tắc pH thấp nguồn carbohydrate Bổ sung vào môi trường chất kháng sinh khác peniciline hay methyl blue tác nhân ức chế vi khuần gram âm Các vi sinh vật kháng kháng sinh định lượng môi trường cách thêm vào liều lượng kháng sinh Mơi trường phân biệt thiết lập dựa nhiều cách Các thuốc thử thêm vào môi trường phép nhận khác biệt vi sinh vật mong muốn Có thể thêm thuốc thử vào mơi trường sau ni cấy để nhận lồi vi sinh vật đặc trưng cần tìm Chìa khố nâng cao khả phân biệt môi trường qui trình ni cấy phép mơi trường phân biệt cách tốt với vi sinh vật cần định lượng vi sinh vật khác có mẫu Môi trường Eosin methyl blue (EMB) MacConkey agar môi trường sử dụng rộng rãi việc phân tích vi sinh vật nước Những mơi trường bao gồm tính chọn lọc tính phân biệt Chúng chọn lọc cho phát triển vi khuẩn gram âm có thêm vào tác nhân ức chế vi khuẩn gram dương Môi trường phân biệt vi khuẩn sử dụng lactose hình thành khuẩn lạc phân biệt màu sắc Trên mơi trường EMB, vi khuẩn thuộc nhóm coliforms nhóm gram âm tạo nên khuẩn lạc có màu tím ánh kim Định lượng số lượng coliform cách đếm số 25 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH lượng khuẩn lạc có đặc điểm Cách thường xuyên sử dụng việc phân biệt vi sinh vật thị nước thực phẩm Với kỹ thuật đến khuẩn lạc, mẫu cần phân tích phải pha lỗng thành chuổi pha loãng liên tiếp xác định vài nồng độ pha loãng định để cấy vào môi trường chọn phù hợp với đối tượng cần xác định Mổi khuẩn lạc hình thành gán cho đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu-colony forming units) Kỹ thuật thường qua bước sau: Dung dịch pha loãng: số dung dịch dùng để pha lỗng làm chết tế bào như: nước muối, nước cất Các dung dịch pha loãng không dùng lấy từ tủ lạnh gây sốc làm cho vi sinh vật phát triển Dung dịch pepton water dung dịch pha loãng sử dụng nhiều xem dung dịch pha loãng cho tất loại mẫu Nếu mẫu có chất khử trùng phải thêm vào dung dịch pha loãng tác nhân giảm thiểu khả khử trùng chúng, ví dụ: mẫu dư lượng hợp chất amonium (NH4-) thêm vào Tween 80 hay lecithin Ngược lại mẫu có chứa hợp chất chlorin hay iodin cần thêm vào muối sodium thiosulphate Chuẩn bị chuổi pha lỗng mẫu Bơm xác 9ml dung dịch pha lỗng vào ống nghiệm có nắp đậy Nếu sử dụng ống nghiệm có nắp khơng đóng chặt phải khử trùng ống nghiệm, sau bơm dung dịch pha lỗng vào, thao tác phải thực cách vô trùng Phân phối dung dịch pha loãng vào ống sau khử trùng có ý nghĩa đảm bảo thể tích dung dịch pha lỗng khơng bị q trình khử trùng Các thao tác pha loãng tuỳ thuộc vào loại mẫu Cụ thể sau: - Nếu pha loãng mẫu chất lỏng, trước pha loãng mẫu phải lắc kỹ, cắm đầu pippette sâu vào mẫu khoảng phút hút 1ml, cho vào ống chứa dung dịch pha loãng đầu tiên, lắc kỹ ống nghiệm chứa mẫu, bỏ pippette vừa sử dụng, dùng pippette thực lại thao tác với độ pha loãng Cứ tiếp tục đạt độ pha loãng mong muốn 26 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH Mỗi độ pha loãng phép sử dụng pippette Các ống nghiệm chứa độ pha loãng khác phải đánh dấu để tránh nhầm lẫn - Đối với mẫu rắn hay bán lỏng, thao tác tiến hành sau: cân 10 g mẫu vào bao dập mẫu hay máy xay vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng đồng mẫu, phải đảm bảo cho vi khuẩn phân tán vào dung dịch Sau mẫu dung dịch pha loãng đồng ta dung dịch pha loãng 1/10 Các độ pha loãng sau tiến hành tương tự phần pha loãng mẫu lỏng Các ống nghiệm chứa độ pha loãng khác phải đánh dấu để tránh nhầm lẫn Cấy mẫu phương pháp đổ đĩa Các môi trường agar đun chảy chai hay ống nghiệm tích phù hợp Được làm mát bể điều nhiệt 45 0C Hút 1ml dung dịch pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng Mỗi độ pha loãng thường cấy vào hai đĩa petri hay nhiều Cũng sữ dụng pippette cho độ pha loãng Chỉ chọn cấy vào đĩa petri độ pha lỗng có mật độ vi sinh vật phù hợp, thường khoảng 25-300 tế bào/ml Đỗ vào đĩa cấy 10-15ml môi trường đun chảy làm nguội, lắc đĩa theo chiều ngược chiều kim đồng hồ khoảng 5-6 lần, đặc đĩa lên mặt phẳng ngang đợi môi trường đĩa đông đặc Lật ngược đĩa ủ điều kiện nhiệt độ thời gian xác định.[10] b Phương pháp ước đoán số lượng vi sinh kỹ thuật MPN (Most Probable Number): Phương pháp MPN phương pháp thay phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định mật độ vi sinh vật mẫu, phương pháp dựa nguyên tắc xác suất thống kê phân phân bố vi sinh vật độ pha loãng khác mẫu Mỗi độ pha loãng nuôi cấy lặp lại nhiều lần môi trường lỏng chọn, thông thường phải cấy lặp lại từ 3-10 lần nồng độ pha loãng Các độ pha loãng tiến hành cho lần lặp lại có số lần cho dầu hiệu dương tính số lần cho dấu hiệu âm tính Số lần lặp lại cho dấu hiệu dương tính âm tính ghi nhận để đối chiếu với bảng thống kê 27 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật mẫu Qui trình MPN cho giá trị số lượng vi sinh vật mẫu có ý nghĩa thống kê theo xác suất phân bố vi sinh vật mẫu sử dụng số lần lặp lại, khoảng tin cậy lớn Phương pháp MPN để định lượng vi sinh vật có nhiều cải tiến cho phép tiến hành qui trình dễ dàng tốn sức lao động cho giá trị xác cao Chọn nồng độ pha lỗng cho lần lặp lại có số lần cho kết dương tính số lần cho kết âm tính , lựa chọn quan trọng Trong nhiều trường hợp qui trình MPN thiết lập cho gia tăng số lượng lần lặp cho kết dương tính tín hiệu phát triển vi sinh vật Trong số trường hợp khác, qui trình thiết lập có nhiều thử nghiệm khẳng định sau lần lặp lại độ pha lỗng cho tín hiệu phát triển vi sinh vật phát protein hay emzym Các thử nghiệm sau cho kết dương tính lần lặp lại ban đầu khẳng định dương tính Cũng giống qui trình đếm khuẩn lạc, qui trình MPN sử dụng môi trường chọn lọc, không chọn lọc hay môi trường phân biệt Phương pháp MPN dùng để định lượng virus đường ruột Trong phương pháp này, chuỗi pha loãng mẫu cần kiểm tra cho vào ống nghiệm chứa tế bào chủ thích hợp nuôi cấy Sau ủ, ống nghiệm kiểm tra hiệu ứng cytopathic (CPE), biểu làm chết tế bào bị xâm nhiễm Số lượng virus mẫu nhận từ bảng MPN tham chiếu số lượng ông nuôi cấy cho hiệu ứng CPE dương tính Số lượng virus định lượng số TCID 50 (Tissue culture infectious dose 50%) Nồng độ pha loãng thấp có diện virus nộng độ có tỉ số CPE 50% ống nghiệm Cũng giống qui trình đếm đĩa, phương pháp MPN, môi trường nồng độ nuôi cấy điều chỉnh để chọn lọc cho nhóm vi sinh vật hay phân biệt nhóm vi sinh vật với nhóm vi sinh vật khác với đặc điểm mong muốn, rỏ ràng kết hợp điều kiện nuôi cấy môi trường định lượng nhóm vi sinh vật đặc biệt theo định nghĩa cụ thể Mỗi 28 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH qui trình phải chọn lọc cách cụ thể cẩn thận để thu kết cách xác Theo quan điểm C.H Collins Patricia M Lyne thực chất số MPN biểu diển số lượng vi sinh vật mẫu số lượng trung bình sau lần lặp lại Nếu số lượng vi sinh vật mẫu lớn khác biệt mẫu lần lặp lại nhỏ, kết riêng lẻ tất lần lặp gần với kết trung bình Nều số lượng vi sinh vật mẫu nhỏ, khác biệt lớn Nều mẫu chất lỏng chứa 100 vi sinh vật/100 ml, 10 ml mẫu chứa trung bình 10 tế bào Dĩ nhiên có số phần mẫu nhiều 10 tế bào, chí có phần mẫu chứa 20 tế bào 10ml mẫu số phần mẫu chứa Nếu tất phần mẫu nuôi cấy môi trường điều kiện thích hợp, vi sinh vật mẫu phát triển cho tín hiệu dương tính Tương tự vậy, 1ml chứa trung bình tế bào vi sinh vật, có lần lấy có hay tế bào có lần lấy khơng có tế bào Nếu lần hút nuôi cấy môi trường điều kiện thích hợp thu ống nghiệm cho kết dương tính ống cho kết âm tính Nếu hút 0,1ml sau 10 lần hút có khả nhận lần hút có tế bào, hầu hết lần nuôi cấy lấy 0,1ml cho kết âm tính Có thể tính tốn số chắn số lượng vi sinh vật trong 100ml mẫu kết hợp kết nhận từ chuổi cấy Bảng giá trị MPN sử dụng hệ thống cấy với dãy ống 10ml, ống 1ml ống 0.1ml tính sẵn dùng cho phân tích mẫu nước hay mẫu pha lỗng Cho đến có nhiều bảng giá trị MPN sử dụng với độ xác khoảng tin cậy khác sử dụng cho mục đích khác Phương pháp MPN dùng chủ yếu để phân tích Coliforms vi sinh vật khác chúng phát triển môi trường ni cấy lỏng cho tín hiệu dễ dàng nhận dạng sinh hơi, làm đục môi trường chọn lọc, thay đổi pH mơi trường … Ví dụ nấm men nấm mốc nước trái hay rau quả, vi sinh vật kỵ khí hay bào tử Clostridia.[10] 2.5.3.2 phản ứng sinh hóa xác định vi khuẩn E coli 29 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH a.Thử nghiệm khả sinh indol: Nguyên tắc: Phát khả vi khuẩn tạo indol mơi trường canh trypton Cơ sở sinh hố:Tryptophan aminoacid bị oxy hoá số vi sinh vật định tạo nên hợp chất indol hay dẫn xuất chúng như: indol, skatol (methyl indol) indolacetic Một số enzym nội bào gọi chung trytophanase tham gia trình tạo thành sản phẩm indol hoạt động thuỷ giải tryptophane Các hợp chất trung gian trình thuỷ giải tryptophan acid indolepyruvic, từ indol hình thành q trình khử amin, hình thành skatol trình khử carboxyl acid indol acetic Quá trình thuỷ giải tryptophan Enzym tryptophanase xúc tác phản ứng khử amin cơng vào phân tử tryptophan vị trí mạch nhánh tách nhân thơm khỏi phân tử tryptophan hình thành indol Sự tách amin từ tryptophane dạng phản ứng khử Qua q trình nhóm amin tách chuyển thành NH 3, trình khử giải phóng phần lượng sử dụng cho hoạt động tăng trưởng vi sinh vật Đồng thời q trình tạo thành acid pyruvic, chất tham gia vào chu trình Krebs’ để tiếp tục thu lượng Phát indol dẫn xuất chúng môi trường nuôi cấy thuốc thử Kovac’s hay Ehrlich’s Cơ chất tham gia phát indol môi trường nuôi cấy p-dimethylaminobenzaldehyde (DMAB) Chất phản ứng với indol tạo thành phức hợp màu đỏ Phản ứng nhân pyrrol indol phản ứng với nhóm aldehyde DMAB qua hai giai đoạn để tạo thành nhân quinone có màu đỏ, phản ứng sau: Phương pháp thử: Vi sinh vật thử nghiệm nuôi môi trường canh trypton khoảng 24 - 48 Nhỏ vài giọt ether vào canh khuẩn nhằm kéo indol lên bề mặt trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s hay Erhlich Quan sát sau vài phút, phản ứng dương tính bề mặt mơi trường có vòng màu xuất 30 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH Ngược lại khơng có xuất màu đỏ hồng coi phản ứng âm tính Thuốc thử - Thuốc thử Erhlich: Hồ tan 4g p-dimethylaminobenzaldehyde hỗn hợp gồm 80 ml acid HCl đậm đặc 380 ml ethanol tuyệt đối Dung dịch sau pha có màu vàng nâu - Thuốc thử Kovac’s hoà tan g p-dimethylaminobenzaldehyde hỗn hợp gồm 75 ml amyl alcohol 25 ml H2SO4 đậm đặc.[10] b Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP): Nguyên tắc: Phát khả vi sinh vật tạo thành số sản phẩm trung tính acetylmethylcarbimol (acetoin) q trình lên men glucose Cơ sở sinh hoá: Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát acetoin, sản phẩm trung tính trình trao đổi glucose tế bào vi sinh vật Quá trình phân huỷ glucose tế bào vi sinh vật tạo sản phẩm trung gian acid pyruvic, từ chia vi sinh vật thành hai nhóm theo hai cong đường chuyển hố pyruvic khác sau: Nhóm trao đổi khơng tạo thành 2,3-butanediol, ví dụ E.coli gọi nhóm VP âm tính (VP-); nhóm thứ hai q trình trao đổi tạo thành sản phẩm trung gian 2,3-butanediol, ví dụ Klebsiella, gọi nhóm VP dương (VP+) Tuy nhiên thử nghiệm VP nhằm mục đích phát acetoin (acetylmethylcarbimol, AMC) tiền chất 2,3-butanediol Phân tử acetoin tạo thành q trình khử nhóm carboxyl acid pyruvic, phản ứng sau: Pyruvate acetoin + 2CO2 Vì acetoin sản phẩm trung gian bước tạo thành 2,3-butanediol nên môi trường nuôi cấy tích lũy lượng tiền chất Để acetoin tích lũy nhiều, dễ dàng cho việc phát hiện, vi sinh vật phải nuôi điều kiện hiếu khí Q trình chuyển hố acetoin 2,3-butanediol trình thuận nghịch Để phát acetion môi trường nuôi cấy 1-napthol sử dụng thuốc thử phát môi trường kiềm mạnh tạo KOH 40% hay NaOH 40% cho vào môi trường thử nghiệm 31 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH Trong thành phần tham gia phản ứng để tạo phức chất có màu đỏ hồng có hợp chất guanidine, ví dụ arginine NH:C(NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2)-COOH, chất diện pepton sử dụng môi trường nuôi cấy Phương pháp tiến hành: Cấy vi sinh vật vào môi trường canh glucose phosphate (MR-VP broth), ủ nhiệt độ 37 0C khoảng 2-5 ngày Thêm vào canh khuẩn sau nuôi cấy 3ml dung dịch 1-napthol 5% cồn, bổ sung thêm 3ml dung dịch KOH hay NaOH 40%, lắc mạnh Quan sát phản ứng khoảng phút Phản ứng VP dương tính mơi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng, phản ứng VP âm tính khơng có chuyển màu này.[10] c Thử nghiệm methyl red (MR): Nguyên tắc: Thử nghiệm methyl red nhằm xác định khả vi sinh vật sản xuất trì sản phẩm acid bền mơi trường từ q trình lên men glucose Cơ sở sinh hố: Thử nghiệm methyl red sở sử dụng chất thị pH methyl red để nhận biết lượng ion H+ có mơi trường sau vi sinh vật lên men glucose Hàm lượng ion H+ có môi trường thụ thuộc vào tỉ lệ CO H2, hàm lượng chất lại tuỳ thuộc vào đường chuyển hố lồi vi sinh vật Đối với vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy để thử nghiệm phản ứng MR thường xác định khoảng 18-24 Tuy nhiên vi sinh vật tạo acid môi trường từ chúng bắt phát triển Khi kéo dài thời gian ni cấy vi sinh vật có phản ứng MR dương tính tích luỹ acid mơi trường ngày nhiều hơn, độ pH môi trường ngày giảm Đối với vi sinh vật cho phản ứng MR âm tính, ban đầu lượng acid hình thành mơi trường, kéo dài thời gian muôi cấy vi sinh vật tiếp tục chuyển hoá sản phẩm acid phản ứng decarboxyl tạo nên sản phẩm trung tính acetoin (acetyl methylcarbinol) kết làm cho pH mơi trường chuyển dần phía trung tính Trong số trường hợp khác vi sinh vật sản sinh acid môi trường acid cho hàm lượng ion H + thấp acid lactic, acid acetic, acid 32 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH formic … acid có xu hướng chuyển trung tính tượng tạo thành carbonate tạo thành sản phẩm CO hợp chất amonium môi trường sản phẩm làm tăng pH môi trường Thử nghiệm MR phụ thuộc lớn vào thời gian nuôi cấy để xác định khác đường chuyển hoá glucose Thử nghiệm thường tiến hành thời gian khoảng 2-5 ngày 370C Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật môi trường glucose phosphate (MR-VP broth) ủ khoảng 2-5 ngày Thêm vào vài giọt thuốc thử methyl red pha theo tỉ lệ 0,1g 300ml ml cồn cho nước vào để đạt thể tích 500ml Phản ứng dương tính mơi trường chguyển sang màu đỏ Phản ứng âm tính mơi trường giữ nguyên màu vàng.[10] d Thử nghiệm citrate: Nguyên tắc: Nhằm xác định khả vi sinh vật sử dụng nguồn citrat nguồn carbon Cơ sở sinh hoá: Năng lượng cung cấp cho vi sinh vật mơi trường khơng có nguồn ngun liệu sử dụng cho trình lên men hay tạo sản phẩm lactic cách sử dụng citrate nguồn carbon Trong thường, trao đổi chất citrate bao gồm bước kết hợp acetyl-CoA để tạo thành oxalacacetate chúng vào chu trình Kreb Con đường đồng hoá citrate vi khuẩn thường nhanh qua chu trình tricarboxylic acid hay đường lên men citrate Ơ vi khuẩn tách citrate bao gồm hệ thống enzym khơng có tham gia enzym acetyl –CoA, enzym được gọi citratase (citrate axaloacetat – lyase) hay citate demolase Enzym đòi hỏi cation có hốt trị cho hoạt động chúng, thông thường cation magne ( Mg 2+) hay mangan (Mn2+) Bước vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate acetate Đây hai sản phẩm trung gian q trình đồng hố citrate, sản phẩm nhận từ q trình phụ thuộc vào pH mơi trường Nếu pH kiềm môi trường nhận nhiều acetate formate, pH acid sản phẩm tạo lactate 33 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH CO2 pH 7,0 khơng có sản phẩm lactate mơi trường sản phẩm nhận sau: Citrate CO2 + Formic acid + Acetic acide Ở pH acid acetyl methycarbinol (acetoin) latate sản phẩm q trình sử dụng citate Mơi trường sử dụng cho q trình lên men citrate chứa muối vơ amonium Một vi sinh vật có khả sử dụng citrate nguồn carbon sử dụng ammonium nguồn nitơ nhất, amonium bị phân huỷ để tạo thành amonia, chất làm kiềm môi trường nuôi cấy Deffner Franke thành lập công thức cho môi trường citrate cho vi sinh vật đường ruột, sản phẩm thu sau q trình ni cấy sau: Citrate acetate + CO2 + formate + Succinate Sự sử dụng acid hữu dạng muối chúng nguồn carbon tạo nên carbonate hay bicarbonate kiềm tính Để sử dụng cho việc thử nghiệm citrate, sử dụng mơi trường Simmon citrate agar hay môi trường lỏng Koser Nên cấy lượng vi sinh vật vừa phải, cấy với mật độ dày gây nên tượng dương tính giả Sau cấy, ủ nhiệt độ 30-37oC, quan sát phát triển vi sinh vật chuyển sang kiềm môi trường Các chủng vi sinh vật đối chứng: Đối chứng dương: P rettgeri; đối chứng âm: S.epidermidis.[10] 2.6 Tiến hành thí nghiệm 2.6.1 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí 2.6.1.1 Mơi trường, hố chất, dụng cu, thiết bị: + Mơi trường plate count agar (PCA) + Dung dịch nước muối sinh lý 8.5‰ (9ml/ ống) + Dụng cụ mở nắp chai bia + Bông thấm nước + Pipet (1ml ; 2ml ; 5ml; 10ml) + Đĩa pétri, que cấy 34 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH + Ca inox + Mẫu thí nghiệm + Cồn 700 + Bật lửa gaz, Đèn cồn + Băng keo + Bút quang + Giá đỡ + Ông bóp cao su + Tủ ấm 2.6.1.2 Tiến hành: Tất thao tác tiến hành trước đèn cồn + Pha loãng mẫu theo thang bậc 10 nước muối sinh lý (hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dd nước muối sinh lý) + Tay trái cầm dụng cụ (chứa mẫu thí nghiệm) nghiêng góc 45 so với mặt bàn (sát cạnh đèn cồn) + Tay phải nhẹ nhàng mở nút + Hơ miệng dụng cụ qua đèn cồn + Tay phải rút pipet có gắn ống bóp cao su xuyên qua đèn lấy ml mẫu thí nghiệm + Tay trái mở nắp đĩa pétri (đã ghi loại mẫu thí nghiệm) + Tay phải cho mẫu vào hộp + Rót vào hộp 12-15 ml mơi trường PCA đóng ống + Đảo trộn dung dịch mẫu thí nghiệm mơi trường cách xoay theo chiều kim đồng hồ ngược lại (3 vòng/ chiều) + Để thạch đơng tự nhiên mặt ngang + Dán hộp băng keo + Lật sấp hộp pétri đặt vào tủ ấm t0 = 30-37 0C / 24-48 2.6.1.3 Xử lý số liệu : + Đếm số khuẩn lạc mọc đĩa cách chia hộp petri 1/4, sau đếm khuẩn lạc mọc đĩa 35 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH + Đối với mẫu thí nghiệm cấy nồng độ ngun (khơng pha lỗng) kết tính số trung bình cộng số khuẩn lạc hai đĩa làm tròn số + Đối với mẫu thí nghiệm cấy nồng độ khác chọn đĩa có số chuẩn lạc từ 15 - 300 để tính + Kết trường hợp tính theo cơng thức : Σc N= (n1 + 0.1 n2) x d Trong : N = Σ vi khuẩn hiếu khí / ml mẫu thí nghiệm c = Số khuẩn lạc đếm hộp thạch n1, n2 = Số hộp độ pha loãng liên tiếp chọn để đọc kết d = Hệ số pha loãng chọn.[7][8] 2.6.2 Xác định Coliforms E.coli : 2.6.2.1 Mơi trường, hố chất, + Môi trường: Brilliant green broth EMB Trytone Broth 1%, MR-VP broth , Simmons Citrate Agar + Hoá chất : Dung dịch α Napthol 5% Thuốc thử Kovacs Dung dịch KOH 40% Thuốc thử Methyl red + Xử lý mẫu (pha loãng mẫu): - Dùng pipet lấy 10 ml mẫu thí nghiệm cho vào chai chứa 90 ml dung dịch nước muối sinh lý 8.5‰, lắc mẫu phút ta nồng độ pha loãng 10-1 - Dùng Pipet lấy ml mẫu cho vào ml dung dịch nước muối sinh lý 8.5‰ ta nồng độ pha loãng 10-2 - Tiếp tục pha loãng mẫu khơng khả dương tính (Dựa vào kết lần trước) 36 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH 2.6.2.2 Tiến hành : a) Bước 1: + Dùng Pipet vô trùng lấy 1ml mẫu vào 10 ml môi trường BGBL, nồng độ cấy ống + Ủ nhiệt độ 37 0C 48 + Đọc kết : • Ống (+): mơi trường bị đục, đổi màu, sinh ống Durham • Ống (-): mơi trường không bị đổi màu, không sinh ống Durham + Ghi lại số ống (+) + Tra bảng MPN để có số Coliforms.[7][8][9] Tổng số Coliforms = Chỉ số MNP x nồng độ dãy 100 ml mẫu b) Bước 2: Xác định E.coli + Lấy vòng que cấy vi khuẩn từ ống Brilliant green broth (+) cho vào ống EC, nồng độ cấy ống + Ủ nhiệt độ 44,50C ± 0,50C 24 + Đọc kết : • Ống (+): môi trường bị đục, đổi màu, sinh ống Durham • Ống (-): mơi trường khơng bị đổi màu, không sinh ống Durham + Tiếp tục lấy vòng que cấy vi khuẩn từ ống EC (+), sau cấy ria lên mơi trường EMB, nồng độ cấy đĩa + Ủ nhiệt độ 37 0C 24 + Đọc kết quả: khuẩn lạc sinh ánh kim, tròn, bờ đều, mặt phẳng lồi: nghi ngờ E.coli • Thử phản ứng sinh hóa IMViC: Phản ứng Indol: + Cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên môi trường Nutrient agar ( ủ 37 0C 24 giờ) + Cấy chuyển tiếp sang môi trường canh trypton ( ủ 370C 48 giờ) 37 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH + Nhỏ vào mơi trường nuôi cấy 3- giọt Kovacs + Đọc kết quả: • Mơi trường chuyển màu đỏ: phản ứng (+) • Mơi trường chuyển màu vàng : phản ứng (-) Phản ứng Methyl red: + Lấy vòng que cấy khuẩn lạc từ môi trường Nutrient agar cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường MR-VP + Ủ 370C 24- 48 + Thêm giọt thuốc thử Methyl red, lắc + Đọc kết quả: • Môi trường chuyển màu đỏ: phản ứng (+) • Môi trường chuyển màu vàng : phản ứng (-) Phản ứng Voges - Proskauer (VP): + Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ mơi trường Nutrient agar cho vào ống nghiệm có chứa ml mơi trường MP-VP + Ủ 370C 24 - 48 + Nhỏ thêm: 0,6 ml dung dịch α Napthol 0,2 ml dung dịch KOH 40% + Lắc đều, để yên -10 phút + Đọc kết quả: • Xuất lớp màu đỏ bề mặt môi trường dương tính(+) • Bề mặt mơi trường khơng đổi màu âm tính (-) Phản ứng mơi trường Citrat: + Cấy ria tiếp khuẩn lạc môi trường Nutrient agar sang môi trường thạch nghiêng Simmons citrat + Ủ 370C 18- 24 + Đọc kết quả: • Màu môi trường chuyển sang xanh dương: phản ứng dương tính(+) 38 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH • Khơng đổi màu: phản ứng âm tính (-).[7][8][9] Nhận định kết mẫu thí nghiệm Mẫu dương tính E.coli khi: - Phản ứng Indol: (+) - Phản ứng Methyl red: (+) - Phản ứng Voges - Proskauer : (-) - Phản ứng Citrat : (-) 2.7 Xử lý số liệu: Các số liệu q trình thí nghiệm xử lý excel công cụ hỗ trợ, đảm bảo tính xác phù hợp thực nghiệm Tuy nhiên sơ xuất không tránh khỏi 39 ... phải 10 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH nạp từ bên ngồi vào Hình 2.4 : số loại bia lon thị trường PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN BIA 2.1... coli 29 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH a.Thử nghiệm khả sinh indol: Nguyên tắc: Phát khả vi khuẩn tạo indol mơi trường canh...NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP HỒ CHÍ MINH rộng rãi Đến khoảng kỉ 17 loại bia khơng sử dụng Houblon hồn tồn biến vào đa dạng sản phẩm