Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, em đã nhận đợc sự hớng dẫn, chỉ bảo tận tình của PGS.TS Định Thị Kim Nhung, các thầy cô giáo bộ môn Vĩ sinh Đồng thời em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Sinh — KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó
Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, anh, chị đang học tập và làm việc tại phịng thí nghiệm trờng Đại học S phạm Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này
Cuối cùng em xin chân thành đợc cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Sinh viên thực hiên
Hoàng Thị Hạnh
MỤC LỤC
Trang 2
(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
Trang
MỞ ĐẦU
Chơng 1 Tổng quan tài liệu 4
1.1 Lợc sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn Acefobacter 4 1.2 Dac diém chung cua vi khuan Acetobacter
1.3 Một số đặc điểm của các nhóm vi khuan Acetobacter 11 Chơng 2 Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
2.1 Đối tợng nghiên cứu 15
2.2 Trang thiết bị và hoá chất 15
2.3 Môi trờng 16
2.4 Phơng pháp nghiên cứu 17
Chơng 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 26 3.1 Phân lập vi khuẩn axefie từ một số nguồn nguyên liệu 26 3.2 Tuyển chon ching vi khuan A xylinum cho mang mong 31
3.3 Quan sat hinh thai té bao vi khudn Acetobacter xylinum 36
3.4 Khảo sát khả năng tao mang cua ching A xylinum C5 6
các môi trong nuôi cấy khác nhau 39
3.5 Khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A xylinum C5 6
các thời gian nuôi cấy khác nhau 40
3.6 Xử lý màng BC và bớc đầu thử nghiệm làm mặt
nạ dỡng da ở một số phụ nữ 4I
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1 Kết luận 47
2 Kiến nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
Trang 3
$inh-LOI CAM DOAN
Tôi xin khẳng định đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, tất cả những số liệu đều đợc thu thập từ thực nghiệm va qua xử lý thống kê, hồn tồn khơng có số liệu sao chép, bịa đặt đề tài nghiên cứu này không trùng với cơng trình nghiên cứu của các tác giả khác
Tác giả
Hoàng Thị Hạnh
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Trang 4
$inh-Khod luận tốt nghiệp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
Tw viét tat Từ đây đủ
A xylinum Acetobacter xylinum
BC Bacterial Cellulose
CNSH Cong nghé sinh hoc
C5 Acetobacter xylinum C5
EM Effective Micorgamisms
MPA Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định
Trang 5DANH MUC BANG VA HINH
Bang Trang
Bang 1.1 Những đặc điểm phan biét Acetobacter va Gluconobacter so sanh v6i Pseudomonas
Bang 3.1 Ham lợng axit axetic của một s6 chung Acetobacter Bảng 3.2 Quan sát thời gian, đặc điểm màng tạo thành và đặc điểm
khuẩn lạc của các chủng Acefobacter phân lập đợc
Bang 3.3 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Bang 3.4 Khao sat kha nang tao mang vi khuan Acetobacter xylinum Bảng 3.5 Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trờng khác nhau Bảng 3.6 Khảo sát khả năng tạo màng ở các thời gian khác nhau Bảng 3.7 Phiếu nhận xét cho điểm của một số ngời thử nghiệm
dùng màng BC đắp mặt Hình
Hình 2.1 Tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III 21 Hình 3.2 Mẫu dịch lên men giấm 27
Hình 3.3 Khuẩn lạc vi khuẩn zxeric của 3 mẫu phân lập 28
Hình 3.4 Khả năng phân oxy hoá axetat của vi khuẩn zxefc 30 Hình 3.5 Khuẩn lạc C5 37
Hình 3.6 Vịng phân giải CaCO; của C5 37 Hình 3.7 Màng BC của C5 37
Hình3.8 Tế bào C5 nhuộm Gram 37
Hình 3.9 Khả sát khả năng tạo màng ở các môi trờng lên men 38
Hình 3.10 Khả năng kháng khuẩn của màng BC tẩm mậtong 42
9 30 32 33 35 39 40 45
Trang 6$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
MO DAU
1 Ly do chon dé tai
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật và công nghệ, công nghệ sinh học (CNSH) đã trở thành một ngành kinh tế chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới Là một bộ phận của ngành CNSH, công nghệ vi sinh học đã và đang phát triển mạnh mẽ với những ứng dụng thiết thực vào cuộc sống như: công nghiệp, nông nghiệp, y học Bằng việc ứng dụng các quá trình lên men vi sinh vật vào sản xuất các chế phẩm, chúng ta đã tận dụng và tiết kiệm được chỉ phí trong việc giải quyết rất nhiều vấn đề như nông nghiệp, công nghiệp, bảo vệ mơi trường Vì vậy, việc nghiên cứu các quá trình lên men, các đặc tính hố, sinh học của các chủng vi khuẩn đang được nhiều người quan tâm Một trong những chủng vi khuẩn đang được nghiên cứu là vi khuẩn Acetobacter (còn gọi là vi khuẩn giấm)
Khi nuôi cấy loại vi khuẩn Acerobacter trên bề mặt môi trường lỏng nó
tạo thành một lớp màng có bản chất là hemixenluloza trên bề mặt thống của dung dịch cịn gọi là màng BC (màng sinh học, bacterial cellulose, BC) Màng này được dùng để làm ra những sợi tơ to khoẻ và có độ đàn hồi cao trong môi trường nước nóng Màng này được xem như một nguyên liệu mới có tiềm năng ứng dụng đề sản xuất đồ ăn kiêng và đỗ tráng miệng
Trong công nghiệp, nông nghiệp vi khuẩn này được dùng để sản xuất EM (Effective Micorgamisms) cé tac dung đa hiệu trên nhiều lĩnh vực đặc biệt trong lĩnh vực xử lý rác thải: EM giúp khử mùi hôi và giảm chỉ phí 10 lần so với đốt rác Trong công nghiệp sản xuất giấy chất lượng cao người ta đã sử dụng nguyên liệu là màng BC tạo thành trong quá trình ni cấy vi khuẩn giấm Trong công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn Acefobacter (chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum) được sử dụng để sản xuất thạch dừa - một món ăn giàu dinh dưỡng và khá phổ biến hiện nay
Trang 7
Các nhà khoa học khi nghiên cứu những tính năng đặc biệt như: bám chắc trên bề mặt ngay khi nước bốc hơi, không cho nước thắm qua nhưng lại cho hơi nước di chuyển, có khả năng ngăn cản vi khuẩn, thay thế da tạm thời Vì vậy, màng BC được coi là nguyên liệu quý trong y học dùng để làm da nhân tạo, màng mạch máu, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ Nó có thé thay thé da tạm thời cho những bệnh nhân bỏng từ cấp độ 1 đến cấp độ 4 Chỉ riêng
Viện bỏng Quốc gia Hà Nội mỗi năm phải tiếp nhận hơn 4.000 ca bỏng Với
các bệnh nhân bị bỏng nặng thì chi phí cho các tắm màng đắp lên vết bỏng rất cao Ngoài ra, các loại màng dùng đề đắp lên vết thương hở và màng dùng để đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ đều phải nhập ngoại với giá từ 30.000- 45.000 đồng /1 chiếc Trong khi đó màng BC này hồn tồn có thể sản xuất ở trong nước bằng quá trình lên men nhờ vi khuân Acefobacter xylinum
Xã hội càng phát triển thì nhu cầu làm đẹp càng được quan tâm và mặt nạ dưỡng da được chế tạo bằng quá trình lên men của vi khuẩn với rất nhiều ưu điểm là sự lựa chọn của nhiều chị em phụ nữ Vì vậy, xuất phát từ thực tiễn về nhu cầu sử dụng màng BC trong nước, hợp với lý luận được tìm hiểu ở trên, trên cơ sở kế thừa các kết quả nghiên cứu của một số tác giả trong và ngoài nước, đồng thời căn cứ vào điều kiện cơ sở nghiên cứu chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phan lap, tuyén chon vi khuan Acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da”
2 Mục tiêu của đề tài
+ Phân lập vi khuẩn zxe/ic từ một số nguồn nguyên liệu
+ Tuyển chọn chủng vi khuan Acetobacter xylinum cho mang mong + Xử lý màng BC và bước đầu thử nghiệm làm mặt nạ dưỡng da 3 Nội dung của đề tài
Nội dung của đề tài “ Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da” để tìm hiểu đặc điểm, hình thái của vi khuẩn
Trang 8
$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe Acetobacter, tit d6 phan lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng theo hướng chế tạo mặt nạ dưỡng da
4 Ý nghĩa của đề tài
Đề tài cho phép phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum c6 kha năng tạo màng mỏng, từ đó chế tạo mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ
Trang 9
Chuong 1
TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Lược sử nghiên cứu và phân loại vỉ khuẩn giấm
Từ rất lâu trong lịch sử con người đã biết cách làm giấm song chưa nắm được cơ sở khoa học, càng không thể giải thích được bằng cách nào rượu lỗng lại có thể biến thành giấm ăn Cho đến dau thé ky XIX, khi khoa học ki thuật phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật được khám phá, con người mới biết được giấm là sản phẩm của quá trình lên men nhờ một nhóm vi sinh vật mà ngày nay người ta gọi chúng là vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn axetic [4,5]
Nam 1822, Peson đã tiến hành những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn Acetobacter từ lớp màng thu được trên bề mặt các bình sản xuất giấm Ông khẳng định đó là một loại vi sinh vật và gọi là Myeoderma aceti [7]
Năm 1837, Kiizing sau khi loại bỏ hết vi sinh vật trong chum làm giấm và thấy rằng giấm không được tạo thành nữa Ông đã đưa ra nhận xét: quá trình lên men giấm nhất thiết phải có mặt vi sinh vật nếu không sẽ không diễn ra chuyển hoá rượu thành giấm Cũng năm 1837, Hansen (người Đan Mạch) đã tách được từ màng giấm ra hai loại vi khuẩn thuần khiết là Mycoderma aceti và Mycoderma pasteurianum
Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi đã chứng minh sự đúng đắn trong nhận xét của Kiitzing và Hansen và khẳng định bản chất của quá trình lên men giấm Ơng nghiên cứu lớp màng nhầy xuất hiện trên bề mặt bia, rượu vang và đi đến kết luận: màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi trực khuẩn đó là Mycoderma
aceti
Trang 10
$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acefobacfer, các nghiên cứu khác cũng như những nghiên cứu sau này đều nhằm tìm hiểu rõ thêm và tìm cách cải thiện qua trình lên men giấm Hiện nay, người ta đang đi vào nghiên cứu những ứng dụng mới của vi khudn Acetobacter bang cách phân lập các chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu các đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh hoá của chúng nhằm tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng trên cơ sở đối chiếu các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa ra
1.1.1 Các tiêu chuẩn phân loại vi khuan Acetobacter
+ Địa điểm nơi phân lập: là nơi cư trú có liên quan đến điều kiện môi trường sống
+ Đặc điểm hình thái: đó là hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng đi động, màu sắc, sự hình thành tiêm mao, vỏ nhày, màu sắc khi nhuộm Gram
+ Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái vết mọc, đặc điểm vết mọc,
đặc tính vết mọc (trơn, xu xì ), tính chất vết mọc (đục, trong ), màu sắc vết mọc trên môi trường thạch Trên môi trường lỏng cần lưa ý tình trạng mơi trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay khơng có mùi)
+ Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố nhiệt độ, pH của môi trường, khả năng hình thành sắc tố, quan hệ với oxy (thuộc loại hiếu khí hay ky khí ), khả năng lên men axetic, khả năng sử dụng các hợp chất vô cơ và hữu cơ
1.1.2 Phân loại vi khuan Acetobacter
Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Ace/obacrer được thực hiện từ thế kỷ XIX Từ năm 1898 Rothenback đã tiến hành phân loại, tiếp theo là Hoyer (1899), Beijerink đã phân loại vi khuẩn Acefobacter dựa vào hai dấu hiệu [6]: * Một là: Khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện quá trình sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn Acefobacter
Trang 11
$inh-*- Hai là: Có hay khơng có giai đoạn đi động trong qua trình phát triển Cịn Heneberg (1926) lại chia các vi khuẩn øxeíic thành 4 nhóm dựa vào nơi sống đặc trưng của chúng:
* Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển bia vì hoa Hulon độc với chúng * Nhóm 2: vi khuẩn phát triển trên bia
* Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang
* Nhóm 4: vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh Năm 1934, theo nghiên cứu của các nhà vi khuẩn học người Hoa Kỳ, vi khuẩn axeic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ nên đã kết hợp chúng vào họ N#robacteriaceae Từ đó vi khuẩn axetic được goi la Acetobacter
Nam 1936, Kenyver và Wanniel cùng Staniel đã đề xuất ý kiến ghép vi khuan Acetobacter vao ho Pseudomonas do ching c6 hién tugng ghép cực xoắn ở phần di dong
Năm 1948, Vaught đã công bố những kết quả khi quan sát sự di động cua nhiéu loai vi khuan: Acetobacter aceti, Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanognum, Acetobacter pasteurianum Ong két luan những loài trên cùng thuộc một lồi có đơn mao ở cực và đã xác nhận vi tri của vi khuẩn Acefobacter ở trong họ Pseudomonas
Ngày nay, theo khoá phân loại của Bergeys (1914) và nhiều tác giả khác, vi khuẩn Aceobacter và Gluconbacter - các vì khuẩn axetic được xếp vào một họ riêng là Acefobacteriaceae Trong khoá phân loại của Bergeys, đáng chú ý nhất là khoá phân loại các loài thuộc giống Acefobacfer, ông đã phân giéng Acetobacter thanh hai loai :
Loại 1: Oxy hoá axit axetic thành CO; và H;O Loại này gồm:
+ Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer), đại dién 1a vi khudn Acetobacter aceti
Trang 12
$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất: trên bề mặt môi trường dịch thể ni cấy có tạo màng nhầy chứa xenluloza, điển hình vi khuẩn Acetobacter xylinum Trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy không tạo màng nhầy có chứa xeluloza, điển hình vi khuẩn: Acetobacter zances, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneizigianus
Loại 2: Khơng có khả năng oxy hoá axit axetic + Tạo sắc tố nâu trên môi trường glucoza:
* Sắc tố nâu đến đen nhạt : Acefobacter melanogenus * Sắc tố hồng: Acetobacter recens
+ Không tạo sắc tố:
* Nhiệt độ thích hợp nhất là giữa 30°C-35°c: Acetobacter subxydan
* Nhiệt độ thích hop nhat gitta 18°C-21°C: Acetobacter oxydans Năm 1960, Shilwel va Carr nghiên cứu về đặc trưng ni cấy sinh hố của vi khuẩn Aceobacter và đưa ra kết luận không thể có sự phân loại đồng nhất vi khuẩn Acefobacter
Những nghiên cứu về đặc điểm, về sự phân loại vi khuẩn Acetobacter
này đã tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, đồng thời tạo thuận lợi cho việc ứng dụng các vi khuẩn đó vào đời sống thực tiễn sau này Hiện nay người ta đã ứng dụng vi khuẩn giấm một cách rộng rãi trên quy mô công nghiệp tạo ra rất nhiều sản phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn
1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter
Như đã nêu ở trên, tác nhân của quá trình lên men axetic là vi khuẩn Acetobacter Dựa vào đặc điểm đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học thấy rằng chúng thuộc vào hai giống vi khuẩn Acefobacfer có chu mao hoặc khơng có chu mao va Gluconobacter đơn mao, đó là hai giống vi khuẩn quan trọng nhất của họ Acefobacteriaceae (Lapent et al-1989), chúng sống phổ
Trang 13
$inh-biến trong tự nhiên, trên bề mặt lá, hoa quả .có khả năng tạo ra axit axetic từ rượu etylic Trong tế bào Œiuconobacter khơng có chu trình Tricacbonxylic (ATC) hoạt động nên nó khơng thể oxy hoá axit axetic song lại có một chu trình khác thay thế (chu trình Glyoxylat), khơng oxy hố axit axetic nhưng vẫn có chu trình photphoril hoá Ngược lại trong tế bào Acefobacfer xảy ra quá trình trên Khi so sánh vi khuẩn này với vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas thấy chúng có những đặc điểm tương tự Chúng chỉ khác Pseudomonas ở chỗ chịu được nồng độ axit cao hơn, khả năng chuyển hố pepton yếu, ít di động và không sinh sắc tố Nhiều loài vi khuẩn Acetobacter khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu ngày (môi trường già) dễ bị biến đổi hình thái (tế bào phình to, kéo dài hoặc phân nhánh)
Tuy nhiên, cơ sở để xếp vi khuẩn axefic vào nhóm độc lập là khả năng oxy hoá rượu etylic thành axit axetic ở pH = 4,5 Ngoài ra, chúng cịn thực hiện q trình oxy hố khơng hồn tồn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ tương ứng Vi khuẩn axetic chi phat triển tốt nhất trong điều kiện hiếu khí; nhiệt độ thích hợp từ 25°C - 30°C; pH thích hợp từ 4,5 - 6,8; hoá dị dưỡng
hữu cơ
Trang 14
$inh-Khod luận tốt nghiệp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe Bảng 1.1 Những đặc điểm phân biệt Acefobacfer và Gluconbacter
so sánh với Psewudomons
Đặc điểm so sánh Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas
1 Vi tri tiém mao Don mao 6 cuc Chu mao hoặc Chu mao ở cực
hoặc không khơng có
2 Phát triển ở pH = 4,5 + + -
3 Oxy hoá ethanol + + -
4 Oxy hoá axit axetic - +
5 Oxy hoa Lactat - +
6.Glucoza———> Gluconate + + 7 Sử dụng Gelatin 8.Sử dụng tỉnh bột Lactose 9, Sắc tố huỳnh quang H HỊ HỊ HỊ + + Ghi chú: Dấu (+): có Dấu (-): khơng
Dấu (+): có hoặc khơng
Về hình dạng tế bào, vi khuẩn Acefobacrer là những trực khuẩn hình que đến elip, kích thước từ 0,6 - 0,8m Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi hoặc có loại tế bào hình cầu, có loại hình chỉ Tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường, nhiệt độ nuôi cấy một số loại có hình bán nguyệt Vi khuẩn Acetobacter khéng c6 kha nang sinh bào tử, tạo màng nhày, một số có khả
năng di động nhờ tiêm mao, một số khơng có khả năng nay [1], [2], [3] Qua nhiều nghiên cứu về khuẩn lạc và màng vi khuẩn Acefobacfer trên môi trường nuôi cấy cho thấy vi khudn Acetobacter phát triển tốt nhất trên môi trường nước bia, môi trường có chứa nấm men, glucoza, rượu etylic hoặc
Trang 15
manitol Trên môi trường đặc chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn, déu đặn, đường kính trung bình là 3 mm
Một số loai nhu Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc rất nhỏ (d = 1mm), bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lac 16i lén, day va sim hơn các vùng xung quanh Một số loại khác có khuẩn lạc lớn hơn (d = 4-5 mm), khơng có màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, dễ dàng dùng que cấy gạt ra khỏi môi trường Có loại tạo thành khuẩn lạc ăn sâu vào mơi trường, khó lấy ra băng que cấy Trên môi trường lỏng vi khuẩn Acetobacter chi phat triển trên bể mặt môi trường tạo thành màng dày nhãn và trơn, khi lắc thì chìm xuống đáy bình và thay vào đó là mội lớp màng mới được tạo thành, dịch dưới màng này thường trong suốt Khi nghiên cứu màng này thấy có sợi xenluloza giống như sợi bông Loại thứ hai màng mỏng như giấy xefan, một số nữa thì tạo thành màng mỏng dễ vỡ, bám trên thành bình và dịch nuôi cấy không trong [8]
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi
khuẩn Acerobacter đối với nguồn cacbon, nitơ và các chất kích thích sinh trưởng là rất đa dạng Chúng sử dụng chủ yếu đường glucoza hoặc saccaroza, rượu etylic và các axit hữu cơ khác làm nguồn cacbon; muối amoni làm nguồn nitơ; muối photphat làm nguồn photpho Ngoài ra, trong quá trình phát triển chúng cịn có nhu cầu với một số chất kích thích sinh trưởng khác như: para-
aminobenzoic, axit nicotinic, axit pantoneic, biotin cdc chat nay cé vai trò
quan trọng trong sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter [9]
Một số vi khuẩn Acefobacter có khả năng tự tổng hợp polisaccarit phân tử lớn như: xenluloza, dextran và người ta ứng dụng khả năng này trong công nghiệp Một số ít vi khuẩn Acefobacter có thể tổng hợp được những sợi xenluloza giống như bông, dién hinh nhu 1a Acetobacter xylinum Một số loài tổng hợp được dextran giống nhu Leuconostoc mesenteroides khi môi trường thiếu dextran hoặc xenluloza
Trang 16
(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
Vi khuẩn Acetobacter c6 kha nang oxy hoá gluxit theo 4 hướng sau:
* Hướng thứ nhất: không có sự photphorit hố cơ chất với sự tham gia của các enzim đặc hiệu
* Hướng thứ hai: oxy hoá các hợp chất đã được photphorit hoá trong con đường Pentose phosphate
* Hướng thứ ba: theo sơ đồ Enter - Doudroff
* Hướng thứ tư: theo chu trình Crep (Krebs) hoặc Glyoxlat
1.3 Một số đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter
1.3.1 Acetobacter aceti
Trực khuẩn ngắn, kích thước 0,4 - 0,8 xI-1,2/;m không di động được, xếp thành chuỗi dài, bắt màu hồng khi nhuộm Gram, màu vàng với thuốc
nhuộm iốt Khuẩn lạc to, sáng trên Gelatin với dịch lên men chứa 10% đường
Saccaroza tạo thành màng nhầy, nhắn Chúng có khả năng phát triển trên mơi trường có nồng độ rươu cao (11%) và có thể tích luỹ đến 6% axit axetic trong môi trường bia với nhiệt độ thích hợp là 30°C
1.3.2 Acetobacter xylinum
Trực khuẩn hình que, kích thước khoang 24m té bao đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động được, các tế bào được bao bởi chất nhầy tạo váng nhăn và dày: váng có chứa hemixenluloza nên khi gặp H;SO, thuốc nhuộm ïốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemixenluloza), chúng có thể tích luỹ 4,5% axit axetic trong môi trường Chúng thường sống chung với nấm men trong “nấm chè” còn gọi là “thuỷ hoài sâm”, “hải bảo” hay “vị bảo”- một loại nước chua có vị thơm dùng để pha nước giải khát trong gia đình, trên bề mặt nước có một váng vi sinh vật dày được nuôi sống bằng nước chè đường
Trang 17
$inh-1.3.3 Acetobacter pasteurianum
Có hình dạng tương tu nhu Acetobacter aceri nhưng váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iôt, tế bào xếp dời nhau thành chuỗi, đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chuỳ phồng lên, di động không thường xuyên Khuẩn lạc trên Genlatin nhỏ, trịn Nhiệt độ thích hợp để phát triển là 30°C
1.3.4 Acetobacter acetosum
Trực khuẩn có kích thước 0,4 - 0,8 xI/m Các tế bào xếp riêng rế thành từng chuỗi, không di động được Nhiệt độ thích hợp nhất cho chúng phát triển là 30°C - 36°C
1.3.5 Acetobacter kiitzingianum
Có màng nhâầy, nhắn ở mép va được nâng cao lên theo thành bình Tế bào dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men nhớt, nhỏ tạo thành màng xếp nếp to trên môi trường ẩm Thích
hợp phát triển ở 30°C
1.3.6 Acetobacter shiitzenbacchii
Trực khuẩn khá dài, kích thước khoang 0,3 - 0,4 x 1,0 - 3,6 um, thudng xếp đôi hoặc đứng riêng rẽ, có thể tạo váng nhày và khơng bên vững Có khả năng tích luỹ trong môi trường đến 11,5% axit axetic do đó thường được sử dụng để chuyển hoá rượu thành giấm theo phương pháp Đức (phương pháp nhanh)
1.3.7 Acetobacter lindreni
Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo chuỗi, thỉnh thoảng có tế bào phồng to như hình cầu, khơng di động Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men tròn, nhỏ, màu vàng, trên môi trường lỏng tạo váng màu nâu, nhớt Thích hợp phát triển ở25°C
Trang 18
$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
1.3.8 Acetobactere orleanense
Trực khuẩn dài trung bình, khơng di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra tế bào đị hình kéo dài hoặc phình to ra Tạo váng vi khuẩn rất dày trên mơi trường lỏng Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu cao (10% - 12%) và tích luỹ đến 9,5% axit axetic Thường được dùng để chuyển hoá rượu vang thành giấm theo phương pháp Pháp (phương pháp chậm hay phương pháp Orleans) Thích hợp phát triển ở 25°C - 30°C
1.3.9 Acetobacter suboxydans
Có hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi ngắn, khơng có khả năng di động, tạo thành những váng mỏng, dễ vỡ, có khả năng chuyển hoá glucoza thành axit gluconic, oxy hoá rượu sobit thành socboza-dùng để sản xuất axit ascorbic-vitamin C Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng: axit para - aminobenzoic, axit
patoneic, axit nicotinic
1.3.10.Acetobacter hoshigakii
Trực khuẩn có kích thước 0,7 - 0,9 x 1,5 - 1,8m, thường xếp riêng rẽ không di động Khuẩn lạc trên thạch với chất chiết rút từ đậu nành nhỏ, tròn, dang hạt xám sau đó chuyển thành màu nâu Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên men tròn, màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hoá nâu, phía ngồi màu vàng nhạt Có khả năng tạo thành axit gluconic Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là từ 30°C - 35°C
1.3.11 Acetobacter ascendens
Trực khuẩn không di động, các khuẩn lạc trên glucoza, genlatin khô trắng với vành sáng chói Trên mơi trường lỏng tạo thành màng nhày chắc,
nâng lên theo thành bình Thích hợp phát triển ở 25°C
Trang 19
1.3.12.Acetobacter oxydans
Trực khuẩn có kích thước 0,8 - 1,2 x 2,4 - 2,7 um, cdc té bao rời nhau
hoặc xếp thành chuỗi Quan sát trong chuỗi thấy có tế bào phồng to lên, di động Khuẩn lạc trên gelatin tròn sau trở thành dạng không cân đối với sự phân nhánh đặc trưng Nhiệt độ thích hợp từ 18°C - 21°C
1.3.13 Acetobacter plicatum
Truc khuan c6 khich thudc 0,4 - 0,6 x1,4 - 1,64m không di động
Khuẩn lạc trên gelatin rượu vang tròn trịa, hơi nhô lên, sáng, ẩm ướt, nhớt
Nhiệt độ thích hợp từ 25°C - 30°C [4]
Hầu hết các loài Acerobacter thường phát triển tốt nhất ở 25°C - 30°C đều có khả năng sử dụng muối photphat, đa số đòi hỏi cung cấp thêm vitamin, chúng có khả năng oxy hoá rượu thành axit và trong quá trình sinh trưởng phát triển chúng tạo ra một lớp màng dày có bản chất hemixenluloza trên bề mặt môi trường nuôi cấy Với những nghiên cứu hiện nay cho thấy lớp màng này có thể được ứng dụng vào rất nhiều ngành quan trọng có ý nghĩa thực tiễn cuộc sống Đồng thời khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn trên rất khác nhau vì vậy cần phải tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt nhất và phù hợp với mục đích sử dụng của từng loại màng
Trang 20
$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
Chuong 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật thuần khiết được phân lập ở màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm: bia, rượu vang, dịch hoa quả, giấm làm theo phương pháp cổ truyền
2.2 Trang thiết bị và hoá chất 2.2.1 Trang thiết bị
Dụng cụ : hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thuỷ tỉnh, phễu thuỷ tỉnh, que cấy, đèn cồn, cốc thuỷ tinh
Thiết bị lên men: bình cầu, bình tam giác, nồi hấp Tommy (Nhật), máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh), buồng vô trùng, tủ sấy, cân phân tích, kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần và nhiều dụng cụ khác 2.2.2.Hoá chất
+ Các loại đường chuẩn: glucoza, saccaroza, fuctoza, mantoza, manitol + Một số hợp chất hữu cơ: rượu etylic (C;H;OH), axit axetic
(CH,COOH), pepoton, agar-agar, dich chiết nấm men (cao nấm men), axit xucxinic, axit lactic, phenolphtalein
+ Một số hợp chat v6 co: K,HPO,, KH,PO,, MgSO,.7H,O, (NH,),SO,, Na,HPO,.12H;O, CaCO;, NaOH chuẩn
+ Một số loại thuốc nhuộm: tím Gentian, dung dịch Eucshin, dung dịch Lugol, thuốc nhuộm ïốt và H;SO,
Trang 21
$inh-2.3 Môi trường
2.3.1 Môi trường phân lập vi khuẩn giấm (MT) (g/!)
Glucose : 20g (NH,),SO,: 3g Axit axetic: 2%
KH,PO, : 2g MgSO,.7H,O: 2g Rượu etylic: 2%
Thạch Agar: 20g
2.3.2 Môi trường nhân giống co ban (MT2) (g/l)
Glucose: 20g (NH,),SO,: 3g
KH,SO,: 2g MgSO,.7H,O: 2g
Pepton: 6g Axit axetic: 2%
Nước máy : 1000 ml Rượu etylic: 2%
2.3.3 Các môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng (g/l)
(MT3; MT4; MT5; MT6) TT Thành phần MT3 MT4 MT5 MT6 1 Glucose 20g 20g 0g 20g 2 (NH,),SO, 3 3 5 4 3 KH;PO, 2 2 2 1 4 MgSO,.7H;O 2 2 0 0 5 Axit axetic 2% 2% 5ml 2,5m] 6 Rượu etylic 2% 2% 0 0 7 Cao nấm men 0 5g 3g 0 8 Pepton 0 6g 2g 0 9 Nước mía ép 0 0 200ml] 0 10 Nước dừa 0 0 0 1000m1 11 Nước máy 1000m1 1000m1 1000m1 0
Chú ý: Axit axetic (CH;COOH) và rượu etylic (C,H;OH) bổ sung sau
khi hấp môi trường lần thứ 3 [6], [8].,[9]
Trang 22
$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
2.3.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định (MPA)
Cao thịt: 5ø Pepton: 5g
NaCl: 5g Thach agar: 20g
Nước: 1000 ml 2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Vinogradski Nguồn nguyên liệu là: bia, dịch hoa quả loãng và rượu vang, chúng tôi tiến hành phân lap vi khuan Acetobacter theo phương pháp của Vinogradski Trước hết, chúng tôi thực hiện lên men giấm trên các vật liệu trên.Vi khuẩn axetic là loại vi khuẩn hiếu khí nên chúng phát triển trên môi trường lông tạo thành lớp màng dai, màu trắng Màng đó bao gồm tập hợp các vi khuẩn axefic, lấy màng đó đưa vào môi trường số 2 Môi trường số 2 được pha chế đầy đủ các thành phần, khử trùng trong nồi hấp Autoclave ở áp xuất 1 atm, trong thời gian 15 phút, để nguội, bổ sung rượu etylic và axit axetic, chia vào các bình cầu hoặc bình tam giác Sau khi thả màng vào giữa trong tủ ấm 28°C - 30°C trong thời gian 4 - 7 ngày (chú ý khi nút bơng các bình khơng qua chặt cũng không quá lỏng) trên bề mặt môi trường xuất hiện một lớp màng mới Từ màng này tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn Acetobacter
Phương pháp pha loãng của Pasteur: Việc pha loãng được thực hiện với dung dịch NaCl 0,5% vô trùng hoặc nước cất vô trùng Chuẩn bị dung dịch pha loãng rồi khử trùng ở latm, ở 121°C, thời gian 15 phút, dùng 10 ống nghiệm định mức I0ml (đậy nút bông, đã khử trùng) Sử dụng pipet v6 trùng chia vào các ống nghiệm vô trùng mỗi ống 9ml dung dịch NaCl hoặc nước cất, sau đó dùng pipet lấy Iml dịch lên men cho vào một ống nghiệm có chữa sắn 9ml] nước cất hoặc dung dịch NaCI trên, đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách vontex trong 5 phút sẽ thu được dung dịch pha loãng với nồng độ 10” Dùng pipet lay Iml dung dịch ở ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10” nhỏ vào
Trang 23
$inh-ống nghiệm thứ 2 (cũng có 9 ml nước), đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách vontex trong 5 phút thu được dung dịch pha loãng với nồng độ 10” Tiếp tục
pha loãng như vậy đến nồng độ 10''° ta được 10 ống nghiệm chứa dung dịch
lên men với các nồng độ từ 10' đến 10” Căn cứ vào số lượng vi khuẩn có trong mẫu, chúng tôi chọn mẫu ở mức độ pha loãng 10” đến 107 để tiến hành phân lập lại trên môi trường thạch đĩa
Phương pháp thạch đĩa: Chuẩn bị môi trường 1 hấp khử trùng ở 121°C
và latm, để nguội, bổ sung rượu và axit, tiếp theo đổ vào hộp peri đã vô trùng,
để nguội khi đó bề mặt thạch sẽ đông lại Dùng pipét vô trùng hút 100 wl dich màng đã chuẩn bị ở trên (có độ pha loãng 10 đến 107) nhỏ vào hộp peri, sau đó dùng que trang dàn đều trên khắp bề mặt thạch Đặt ngược các hộp lồng, bao gói cẩn thận, cất trong tủ ấm ở 28°C - 30°C Sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (các đặc điểm về hình dạng, kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền mép quanh khuẩn lạc), vòng phân giải CaCO, quanh khuẩn lạc
Chú ý: tất cả các dụng cụ thí nghiệm, dung dịch và môi trường nuôi cấy trước khi sử dụng đều phải hoàn toàn vô trùng, các thao tác thí nghiệm đều được làm trong box cấy vô trùng
2.4.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acefobacfer cho màng xenluloza theo phương pháp của Graxinop
Trước khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn bằng cách: từ mỗi khuẩn lạc đã chọn trên dùng que cấy đầu tròn (đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợi lấy khuẩn lạc cấy vào một ống nghiệm đã được đổ môi trường thạch (môi trường số 2, đặt nghiêng, để nguội ) theo đường ziczăc Mỗi ống là một ký hiệu riêng Để vào tủ ấm 4 - 6 ngày các vi khuẩn sẽ phát triển theo đường cấy Tiếp theo là tuyển chọn các chủng vi khuẩn sẽ phát triển theo đường cấy Sau đó, tuyển chọn các chủng vi khuan Acetobacter trong moi trường oxy hoá (MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng Cho I ml nước cất
Trang 24
(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
thanh trùng vào ống giống (ống nghiệm thạch nghiêng chứa các tế bào vi khuẩn đã được hoạt hoá bằng cách cấy chuyển ống giống được bảo quản trong tủ lạnh sang ống thạch nghiêng khác, khi tế bào vi khuẩn đã phát triển theo đường cấy sẽ được kiểm tra khả năng tạo màng), dùng que cấy vô trùng gợt các tế bào ra khỏi đường cấy hoà tan vào nước, dùng pipet vô trùng hút dịch vi
khuẩn đưa sang mơi trường oxi hố để thử khả năng tạo màng Dựa vào khả
năng tạo màng của các mẫu vi khuẩn trên môi trường dịch thể tuyển chọn sau ba lần liên tiếp chọn ra những chủng có khả năng tạo màng dai, mỏng, trong thời gian ngắn
Để giữ giống cần tiến hành cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng này sang ống thạch nghiêng khác với chu kỳ 2 tháng một lần
2.4.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter thuan khiết
2.4.3.1 Phương pháp quan sát tế bào
Sau khi sơ tuyển, chúng tôi đã chọn ra một số chủng, các chủng này tiếp tục được xác định bằng phương pháp quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học để xác định xem chúng có đúng là chủng vi khuẩn cần tìm khơng Quan sát hình dạng tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram: phương pháp này gồm các bước sau:
+ Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCI hoặc H;SO,
+ Rồi rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khô
+ Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít màng màu trắng hoặc dịch nuôi cấy hoặc giống vi khuẩn hoà vào giọt nước vơ trùng đó, hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi (cách ngọn lửa đèn cồn 10 - 15 cm)
+ Đặt lên trên vết bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian giữ trong 1 - 2 phút
Trang 25
$inh-+ Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho thuốc nhuộm chảy xuống chậu hứng, nhỏ dung dịch Lugol lên vết bơi, giữ trong vịng 5 phút
+ Rửa tiêu bản bằng nước, rửa bằng cồn (20 giây) sau đó rửa tiếp bằng nước + Nhỏ dung dịch Fucshin lên giữa trong l - 2 phút
+ Rửa lại tiêu bản bằng nước, hong khô tự nhiên
Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn gram âm (Gr) với vi khuẩn Gram dương (Gr”) Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr Ngược lại nếu bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gr" Khả năng bắt màu của vi khuẩn Gr” và vi khuẩn Gr khác nhau là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr* được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt chứa muối nucleatmagie có khả năng tạo với tím Gentian và Lugol một phức chất bề khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế
bào của vi khuẩn Gr* bat mau tim Gentian Trong khi đó những vi khuẩn Gr
khơng có khả năng tạo phức chất bên với thuốc nhuộm Gentian và Lugol nên dễ bị rửa trơi bởi cồn Do đó, khi nhỏ Fueshin lên tế bào vi khuẩn Gr bắt mau hồng màu cua Fucshin
Trang 26
Cc
Hình 2.1 Tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III a Hình thái mau sac té bao cua ching Cl
b Hình thái màu sắc tế bào của chủng C2 c Hình thái màu sắc tế bào của chủng C5
Từ những mẫu vi khuẩn axefic thu được ở trên chúng tôi tiến hành tuyển chọn ra những mẫu vi khuẩn Acetobacter thuần khiết và có khả năng tạo màng dai trên môi trường nuôi cấy dịch
2.4.3.2 Kiểm tra đặc tính sinh học của Acefobacfer
* Kiểm tra khả năng oxi hoá ethanol thành axit axetic
Sau khi đã có các chủng vi khudn Acetobacter cho mang xenluloza trên môi trường oxy hố chúng tơi tiến hành tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacrer thuần khiết dựa trên những đối chiếu định loại đặc điểm khuẩn lạc trên hai môi trường A và B
Môi trường A: dịch chiết nấm men 3%, CaCO; 2%, Agar-agar 2%, rượu etylic 15% - 2ml Khi nuôi cấy giống vi khuẩn axefic trên môi trường này nếu là Gluceonobacrer thì có một vịng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là Acetobacter thì vịng sáng rõ hơn và có một lớp cặn duc ở viền khuẩn lạc
hướng về phía vòng sáng do vi khuẩn sinh trưởng và phát triển sẽ tạo ra axit
axetic — axit này tạo ra sẽ kết hợp với CaCO; làm vòng sáng rộng hơn và tạo ra lớp cặn đục thấy rõ
Trang 27
Môi trường B: dịch chiết nấm men 3%, Agar — agar 2%, rượu etylic 15% - 1ml, xanh lục bromocresol 2,2% - 1 ml Khi cấy giống vi khuẩn axefic, nếu 1a Gluconobacter sẽ làm cho môi trường biến đổi thành màu vàng, nếu là Acetobacter cũng làm môi trường biến đổi thành màu vàng nhưng có một vành màu xanh lơ do q trình oxy hố các axit
* Phương pháp xác định khả năng tổng hợp axit axetic bằng chuẩn
độ với NaOH 0,1N có Phênolphtalein làm chỉ thị màu
Cho vào bình tam giác loại 100 ml hoặc 200mI, 10 mI dung dịch đã lên men, thêm vào đó 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N Tính SỐ gam axit axetic trong 100 gam dung dịch lên men.Cứ Iml NaOH 0,IN tương ứng với 0,006 gam axit axetic Chú ý khi chuẩn độ ta lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng là được
Cách tinh: ©
ve < (eM)
X: số gam axit axetic có trong | lft dung dịch lên men V: s6 ml NaOH 0.1 N ding chuẩn 10 ml dung dịch lên men * Phat hién hoat tinh catalase
Nhỏ I giọt H;O; 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu được tách từ dịch, nuôi cấy bằng li tâm 3000 vòng trong 20 phút Nếu thấy hiện tượng sủi bọt thì chủng đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +), nếu khơng thấy sủi bọt thì chủng vi khuẩn đó khơng có hoạt tính catalase (catalase-)
2.4.3.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn
Lấy I ml dịch huyền phù có chứa tế bào vi khuẩn có thời gian nuôi cấy khác nhau tuỳ theo yêu cầu của nghiên cứu, pha loãng theo phương pháp pha loãng Pasteur, dùng micropipet hút 100 #1 dịch pha lỗng, trang đều trên mơi
Trang 28
$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
trường thạch đĩa Nuôi ở 30°C trong 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CEU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dich nuôi cấy ban đầu theo công thức:
x_ 100 10”
Trong đó: N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu
A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri 10” - Độ pha loãng
2.4.4 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acefobacter cho
màng mỏng
Mục đích khi tiến hành nghiên cứu này là để chọn ra những chủng vi khuẩn Acefobacrer cho màng mỏng Vì vậy, chúng tơi tiến hành tuyển chọn các chủng cho màng mỏng nhất dựa trên những quan sát cụ thể sau:
* Quan sát quá trình hình thành màng
* Quan sát đặc điểm màng tạo thành trên môi trường lỏng (dày, mỏng trơn, có ăn theo thành bình hay khơng)
* Dùng thước đo độ dày màng
* Quan sát đặc điểm môi trường nuôi cấy mẫu vi khudn Acetobacter xylinum (duc hay trong)
* Quan sát hình dạng tế bào trên kình hiển vi quang học * Nghiên cứu đặc tính sinh lý của chủng đã chọn
*- Kiểm tra tính chịu lực của màng 2.4.5 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp sau:
x,
+ Số trung bình cộng: M= » n i=l
Trang 29
+ Trung bình bình phương các sai lệch: 6 =
ổ
+ Sai số đại diện của trung bình cộng: +m=——= 1
cya 6 x100
+ Hệ số biến thiên trung bình cộng: C, = uM Trong đó: M : là giá trị trung bình
X,: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ 1 đến n n : số lần thí nghiệm
2.4.6 Phương pháp tạo chế phẩm màng sinh học cellulose từ Acetobacter xylinum
2.4.6.1 Công đoạn sinh học
Các chủng A xymum được bảo quản trong các ống thạch nghiêng cần được hoạt hoá trở lại trước khi nhân giống các cấp và nuôi cấy tạo màng sinh học
+ Nhân giống: nhân giống cấp 1 với mỗi ống thạch nghiêng chứa giống cho vào bình tam giác chứa sẵn 200 ml dịch lên men, để trong điều kiện nhiệt độ 28 — 30°C, cho vi sinh vật phát triển trong 72 giờ Sau đó, tiến hành nhân giống cấp 2 với tỷ lệ nhân giống là 10%, sau 72 giờ lại tiếp tục nhân giống cấp 3 Quá trình nhân giống nhằm đảm bảo có đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men
+ Tiến hành lên men: chúng tôi tiến hành lên men với điều kiện và môi trường nuôi cấy đã khảo sát phù hợp nhất cho sự phát triển và sinh trưởng của của chủng vi khuẩn để thu màng (sử dụng giống cấp 3) Sau 4 ngày lên men chúng tôi thu hoạch màng và chuyển sang công đoạn tiếp theo
2.4.6.2 Cơng đoạn hố học
Trong giai đoạn này chúng tôi tiến hành tách sản phẩm: Sau 3 - 4 ngày
Trang 30
$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
trong dịch lên men đã hình thành lớp màng ở phía trên, tiến hành thu sinh khối, vớt lớp mang ra khỏi dịch nuôi cấy bằng đũa thuỷ tỉnh Trong quá trình vớt màng phải tuyệt đối vô trùng để các vi sinh vật khác không nhiễm vào dịch lên men, dịch lên men sau khi thu sinh khối có thể bổ sung thêm chất dinh dưỡng để tiếp tục thu sinh khối (các công đoạn đều được làm trong box cấy vô trùng) Sau các bước xử lý màng, màng BC được tẩm mật ong để tăng tác dụng của màng BC và thử nghiệm đắp trên da Thỏ
2.4.7 Lập phiếu thăm dò lấy ý kiến của một số người dùng màng BC đắp
mặt nạ
Trên cơ sở thăm dò ý kiến khách hàng khi sử dụng các loại mặt nạ dưỡng đa khác nhau, tôi đưa ra các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng của mặt nạ làm bằng màng BC cho người tiêu dùng như sau:
-Tiêu chuẩn cảm quan: + Mùi vị
+ Độ dày mỏng
+ Độ đồng nhất
+ Độ dai và độ đàn hồi
-Phản ứng sau đắp mặt nạ
+ Độ se của lỗ chân lông + Độ sạch
+ Phán ứng để lại của da
Trang 31
Chuong 3
KET QUA NGHIEN CUU VA THAO LUAN
3.1 Phân lập vỉ khuẩn zxefic từ một số nguồn nguyên liệu
Để tuyển chọn được các chủng vi khuẩn axetic khéc nhau, chúng tôi tiến hành lên men từ các nguồn nguyên liệu khác nhau: dịch hoa quả loãng,
bia, rượu vang
Trước tiên, cần chuẩn bị dịch lên men giấm và dịch hoa quả loãng Cho vào bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 500 ml khoảng 200ml giấm, hoặc dịch hoa quả, thêm vào đó một vài lát chuối tiêu đã bóc vỏ để cung cấp thêm nguồn gluxit, vitamin cho vi khuẩn axeiic phát triển, bổ sung 2 ml rượu etylic và axit axetic Mục đích của chúng tơi là lựa chọn vi khuẩn axefic nên việc bổ sung axit axetic nhằm axit hố mơi trường kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn khác chỉ để nồng độ axit trong mơi trường thích hợp cho sự phát triển của các chủng øxefic Đậy bằng nút bông, cho vào tủ ấm nuôi ở 28°C - 30°C Sau 5 - 7 ngày trên bể mặt thoáng của bình cầu sẽ xuất hiện lớp màng màu trắng, màng đó chính là tập hợp tế bào vi khuẩn zxeiic có trong dịch lên men từ các nguồn nguyên liệu trên (hình 2) Từ các mẫu màng này chúng tôi tiến hành phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter
Môi trường dé phan lap vi khudn Acetobacter là môi trường số 1 (thành
phần môi trường đã trình bày ở mục 2.3) Môi trường số 1(môi trường thạch đĩa) được khử trùng bằng nồi hấp cao áp Autoclave ở áp suất 0,5 atm, nhiệt độ 110°C, hấp 3 lần trong ngày liên tiếp Nguyên tắc của phương pháp khử trùng bằng nồi cao áp : là sự kết hợp giữa tác động của áp lực và nhiệt độ cao để tiêu diệt vi sinh vật (kể cả các nội bào tử chịu nhiệt của vi sinh vật) Trong nồi hấp cao áp, môi trường bị làm nóng bằng hơi nước bão hoà, áp suất trong nồi được tạo bởi áp suất của hơi nước Khi áp suất của đồng hồ áp kế chỉ khoảng 0,2 atm dùng van xả hết trong nồi cho đến khi kim áp suất chỉ về số 0 (để loại hết
Trang 32
$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
không khí cịn sót lại trong nồi ) Đóng van lại và đưa áp suất đến mức cần thiết, giữ đủ theo thời gian yêu cầu, ở lần hấp cuối cùng bổ sung rượu etylic và axit axetic Sau khi thanh trùng cần để vào tủ ấm 24h - 28h để kiểm tra độ vô trùng của môi trường
Hình 3.2 Mẫu dịch lên men giấm
Tiến hành phân lập trên môi trường thạch đĩa: dùng que cấy lấy một lượng màng nhất định cho vào ống nghiệm chứa nước cất, vontex đều, tiến hành pha loãng nồng độ theo phương pháp của Pasteur Sử dụng nồng độ pha
loãng 10” - 107” để tiến hành phân lập trên môi trường thạch đĩa Dùng bàn
trang thuỷ tinh vô trùng dàn đều giọt dung dịch khắp bề mặt thạch để tách riêng rẽ các tế bào vi sinh vật Mỗi độ pha loãng trang 3 hộp peri Sau đó bao gói cẩn thận cho vào th 4m 28°C - 30°C nuôi cấy 3 - 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc Dựa vào quan sát về đặc điểm hình dạng, kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền mép quanh khuẩn lạc, vòng phân giải CaCO; quanh khuẩn lạc với mức độ tương đồng của từng nhóm như sau:
Trang 33
$inh-+ Nhóm T: các khuẩn lạc có đường kính khoảng 3,5 - 5mm, bề mặt trơn
bóng, ở giữa lồi lên, dày và đậm màu sắc hơn các vùng xung quanh (gồm 30 mẫu)
+ Nhóm II: các khuẩn lạc có đường kính từ 2- 3,5 mm, bể mặt trơn bóng, ở giữa lồi lên, có màu vàng nâu (30 mẫu)
+ Nhóm III: các khuẩn lạc có đường kính nhỏ 0,8 - 2 mm tròn, đều đặn, mầu trắng sữa quanh khuẩn lạc (35mẫu)
Hình 3.3 Khuẩn lạc vi khuẩn axefic của 3 mẫu phân lập
Sau khi có các khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa, dựa vào đặc điểm
của khuẩn lạc vi khuẩn Acefobacfer (đã nêu), chúng tôi chọn ra những khuẩn lạc riêng rẽ, kích thước lớn, trịn, bể mặt trơn bóng, đường kính 0,8 - 2 mm Dùng que cấy đầu tròn đã được khử trùng trên gọn lửa đèn cồn, gợt lấy từng khuẩn lạc riêng rẽ cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, mỗi ống là một mẫu vi khuẩn được mã hoá bằng các ký hiệu khác nhau
Khi các tế bào trên môi trường thạch nghiêng đã phát triển, chúng tôi tiến hành thử khả năng tạo màng của các chủng trên môi trường số 2, chúng tôi chỉ lựa chọn những chủng tạo màng mỏng, độ đàn hồi tốt, nhắn, không nhăn, không ăn theo thành bình Qua 3 lần liên tiếp từ 95 mẫu này chúng tôi thu được 25 mẫu tạo màng cellulose tốt nhất - đây là các chủng vi khuẩn axit axetic
Trang 34
(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe Theo Bergey vi khuẩn axefic thuộc họ Acefobacteriaceae gồm 2 chi quan trong 1a Acetobacter va Gluconobacter, diém khác nhau cơ bản nhất giữa 2 chi nay là kha năng oxy hoá axit axetic thành CO; và H;0 và giải phóng ATP cung cấp cho hoạt động sống của tế bào, đồng thời giải phóng Ca”” tạo vịng phân giải khơng màu xung quanh khuẩn lạc
Bên cạnh đó q trình hình thành màng BC chỉ gặp ở những loài thuộc chi Acetobacter Vi vay, tit nhitng mau vi khuẩn axeric thu được ở trên chúng tôi tiến hành tuyển chọn ra những mẫu vi khudn Acetobacter thuần khiết và có khả năng tạo màng dai trên môi trường nuôi cấy dịch thể bằng cách sử dụng 2 môi trường A và B:
Môi trường A Môi trường B
- Dịch chiết nấm men 3% | - Dịch chiết nấm men 3% - Rượu etylic 15% - Iml - Rượu etylic 15% - Iml - CaCO; 2% - Xanh lục bromocrerol - Agar: 20 g 1ml của dung dịch 2,2 %
- Agar: 20g
Với môi trường A và B dùng để thử khả năng oxi hoá ethanol của chủng vi khuẩn axeiic đã phân lập được Khi cấy các chủng trên vào môi trường A và B, môi trường A thấy xuất hiện vòng sáng ở xung quanh khuẩn lạc và một lớp căn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phía vùng sáng, môi trường B làm biến đổi thành màu vàng, tạo thành viên xanh lơ khi oxy hoá axit
Dựa vào kết quả thí nghiệm và một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá phân biệt giữa 2 giống Acetobacter và Œluconobacter chúng tôi nhận thấy các chủng đều có khả năng oxy hoá etanol thành axit axetic và oxy hoá lactic điều này chỉ có thể thực hiện được đối với chủng thuộc giống Acefobacfer , còn
Trang 35
$inh-Gluconbacter không xảy ra quá trình đó Chúng tơi lựa chon nhóm khuẩn lạc có đường kính nhỏ (thuộc nhóm HII, gồm 5 chủng ký hiệu từ C1 đến C5) nuôi cấy trên môi trường số 2 sau 5 ngày chuẩn độ để xác định lượng axit tạo thành
Bảng 3.2 Hàm lượng axit axetic của một số chủng Acefobacfer
Stt Tên chủng | Lượng axit tạo thanh(%)
1 Cl 2,15 2 C2 2,34 3 C3 2,26 4 C4 2,41 5 C5 2,45
Kết quả thực nghiệm cho thấy các chủng thuộc nhóm III xuất hiện viền sáng nhỏ ở xung quanh khuẩn lạc do có sự phân giải CaCO; xuất hiện vào ngày thứ 7 và thứ 8 có một viên sáng rất nhỏ chứng tỏ axit axetic là một sản phẩm trao đổi thứ cấp vả các chủng thuộc nhóm III có khả năng axit axetic thấp
Hình 3 4 Khả năng oxy hoá axetat của vi khuẩn Acetobacter Tóm lại: Chúng tơi đã phân lập và thu được 25 mẫu vi khuẩn zxeic từ các nguồn nguyên liệu là giấm và dịch hoa quả loãng và chia làm 3 nhóm, đã xác định được hàm lượng axit axetic của 5 mẫu thuộc nhóm III Những mẫu vi
Trang 36
(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
khuẩn phan lập được ở trên được giữ trong ống thạch nghiêng, cấy chuyển từ ống thạch nghiêng này sang ống thạch nghiêng kia với chu kỳ 2 tháng một lần để tránh thoái hoá giống
3.2 Tuyển chọn ching vi khuan Acetobacter cho màng mồng
3.2.1 Tuyển chọn các ching vi khuan Acetobacter có khả năng
tạo màng cellulose theo phương pháp của Graxinop (sơ tuyển lần 1) Từ 3 nhóm khuẩn lạc đã sơ bộ phân loại ở trên, chúng tôi đã thử khả năng tạo màng của 3 nhóm trên môi trường dịch thể là nước dừa Từ đó chọn ra những chủng có khả năng tạo màng dai Để thuận tiện cho việc nghiên cứu chúng tôi tạm gọi mỗi khuẩn lạc thu được là một chủng và mã hoá theo ký hiệu sau: *NhémI: AI —> AI0
* Nhóm II: BI —> BI0 * Nhóm III: CI—> CI0
Mỗi khuẩn lạc đó tiến hành nhân giống bằng cách cấy lại trên một ống thạch nghiêng theo đường cấy ziczắc Sau 4-5 ngày thấy xuất hiện khuẩn lạc ở ống thạch nghiêng, tiếp tục dùng que cấy vô trùng gợi các khuẩn lạc đó ni trong mơi trường dịch thể (môi trường số 2 đã được khử trùng) rồi quan sát khả năng tạo màng Để ở nhiệt độ phòng (vào mùa hè là điều kiện nhiệt độ thích hợp nhất cho khả năng tạo màng), quan sát từ ngày thứ 3 đã có một số chủng tạo màng còn một số chủng khác màng bắt đầu tạo thành từ ngày thứ 4 họăc ngày thứ 5 Kết quả được dẫn ra ở bảng 3.2
Qua kết quả trên cho thấy các mẫu thuộc nhóm III đặc điểm khuẩn lạc khá đồng nhất, lại xuất hiện vòng phân giải CaCO; là viền nhỏ xung quanh khuẩn lạc, đều có khả năng tạo màng mỏng Theo mục đích nghiên cứu cần chọn các chủng tạo màng mỏng, do vậy chúng tôi lựa chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm TII để tiến hành các ngiên cứu tiếp theo Kết quả nghiên cứu này đồng nhất với nghiên cứu cuả Alina Krystynowicz và cs (2005) [10]
Trang 37
khi tiến hành nghiên cứu hình dạng vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường thạch đĩa
Bảng 3.3 Quan sát thời gian, đặc điểm màng tạo thành và đặc điểm
khuẩn lạc của các ching vi khuan Acetobacter phan lap duoc
Chủng | Đặc điểm khuẩn lạc | Có tạo màng(+) Thời gian | Đặc điểm của màng
Không tao mang(-) _| tao mang
Al Đường kính lớn -
A2 3,5-5mm, bé mat -
A3 trơn bóng ở giữa -
A4 lôi lên, dày và + 7 ngày Màng mỏng, dễ vỡ
A5 đâm mau sac hon + 7 ngày Màng mỏng, dễ vỡ
A6 các vùng xung -
A7 quanh + 7 ngày Màng mỏng, nhăn
nheo bám theo thành bình mỏng,
dễ vỡ, dịch nuôi cấy
đục
A8 -
A9 + 5 ngay Mong, dé v6, dich
nuôi cấy đục
A10 -
Bl Khuẩn lac đường -
B2 kinh 1,5 mm, mau + 6 ngay Mang rat day, kha
vang nau dai
B3 Khuẩn lạc đường -
B4 kính 2mm _
BS + 6 ngay Mang day vừa phải,
nhắn khá dai
B6 + 7 ngày Màng dày, không
dai
CI Khuẩn lạc nhỏ + 5 ngày Màng khá dai,
0,8 - Imm , bé mỏng
C2 mặt trơn bóng, màu + 3 ngày Màng mỏng, khá
trắng sữa dai C3 + 5 ngày Màng mỏng , không nhắn C4 + 6 ngày Màng mỏng, không dai C5 + 4 ngày Màng rất dai , nhắn
Trang 38(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe
3.2.2 Tuyén chon ching vi khuan Acetobacter xylinum tao mang cellulse
mỏng (tuyển chọn lần 2)
Cơ sở để tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum
* Đặc điểm khuẩn lạc: tròn, đều, trơn bóng, màu sắc trắng trong hoặc trắng sữa (tuỳ môi trường nuôi cấy), mép khuẩn lạc nhẵn, sau 5 - 6 ngày kích thước đạt từ 0,8 - I mm
* Quan sát vi thé bằng nhuộm Gram, vi khuẩn Acefobacter xylinum bắt màu Gram âm, nhuộm tế bào có dạng hình que đứng riêng lẻ hay xếp thành từng chuỗi
* Kiểm tra thông qua các đặc điểm sinh hoá sau:
Bảng 3.4 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuan Acetobacter xylinum
STT |Đặc điểm sinh hoá của vi | Hiện tượng Kết
khuan Acetobacter xylinum qua
1 - Oxy hoa ethanol thanh axit | - Axit axetic tao ra két hop) +
axetic với CaCO; làm vòng sáng
rộng hơn và tạo lớp cặn đục TỐ
2 - Catalase - Sui bọt khí +
3 | - Hoyer - Sinh khối không phát triển | - 4_ |- Chuyển hoá glycerol thành | - Vòng CuO xuất hiện xung | +
dihydroxyaceton quanh khuẩn lạc
5 - Chuyển hoá glucose thành | - Vòng sáng xuất hiện xung | +
axit quanh khuẩn lạc
6 |- Kiểm tra khả năng sinh sắc | - Không thấy sắc tố nâu - tố nâu
7 |- Kiểm tra khả năng tổng hợp | - Vang vi khuẩn xuất hiện| +
cellulsse màu lam
Dựa theo các cơ sở tuyển chọn trên thì các chủng vi khuẩn thuộc nhóm
HII đều có đặc điểm khuẩn lạc (đường kính, màu sắc, kích thước khuẩn lạc) phù hợp Qua kiểm tra hoạt tính catalase thấy có hiện tượng sủi bọt khí chứng tỏ các chủng đều có họat tính catalase dương Mặt khác, các chủng có khả
Trang 39
$inh-năng chuyển hoá etanol thành axit axetic trên môi trường A và B, chuyển hoá glucose thành axit với sự xuất hiện của vòng phân giải CaCO:
Acetobacter xylinum là nhóm vi khuẩn duy nhất có khả năng tổng hợp cellulose mạnh Do vậy chúng tôi tuyển chọn bằng cách thử khả năng tạo
màng trên môi trường dịch thể Kết quả tất cả 5 chủng vi khuẩn thuộc nhóm
II đều có khả năng tạo màng trên môi trường lỏng Màng này là sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng và phát triển Màng cellulose gồm những bó vi sợi cellulose được đẩy ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm trên màng tế bào của vi khudn Acetobacter xylinum Những dải cellulose này bện vào nhau tạo thành màng Chất kiến tạo cơ bản của quá trình tổng hợp cellulose là glucoza là thành phần chính của mơi trường nuôi cấy Acetobacter
Như vậy chúng tôi khẳng định 5 chủng vi khuẩn này là vi khuẩn Acetobacter xylinum Từ 5 chủng vi khuẩn này chúng tơi tiến hành làm thí nghiệm tiếp nhằm tìm ra chủng vi khuẩn Ace/obacter xylinum cho màng mỏng nhất
Chúng tôi tiến hành tuyển chọn chủng vi khuẩn Acefobacter xylinum cho màng mỏng theo các tiêu chí sau:
+ Màng tạo ra mỏng, dai + Bề mặt màng trơn
+ Thời gian tạo màng ngắn
Chúng tôi dùng 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum tuyển chọn được cấy sang mô lỏng (môi trường số 2, thay nước máy bằng nước dừa) Môi trường đã được khử trùng trong nồi hấp Autoclave ở áp suất 0,5 atm trong thời gian 30 phút, 3 ngày liên tiếp để nguội, bổ sung thêm etylic, axit axetic 2% cấy giống Theo dõi khả năng tạo màng, độ dày màng, đặc điểm môi trường nuôi cấy
Khi theo dõi quá trình hình thành màng của vi khuẩn trên môi trường số 2, chúng tôi thấy rằng đa số mẫu màng bắt đầu hình thành ở ngày thứ 3, thứ 4
Trang 40
$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe Khoảng 4 ngày sau khi màng xuất hiện, màng dày lên rất nhanh, những ngày sau đó chậm dần Màng có thể mỏng, dày, trơn, nhăn, khá dai, môi trường nuôi cấy trong hoặc đục Thu màng, rửa sạch, đem cân thu được kết quả:
Bảng 3.5 Khảo sát khả năng tạo màng của một số chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum
Tén Khối lượng mang/1 | Thoi gian | Độ dày màng | Đặc điểm của màng chủng | I môi trường nuôi tạo màng (mm)
cấy (g) (ngày)
Cl 3,73 5 1,2 Mang mong, dai ,
dịch nuôi cấy đục
C2 3,11 4 0.8 Màng mỏng, dai,
nhắn, có màu sáng , dịch nuôi cấy trong
C3 3,29 6 1,5 Màng mỏng, dai,
màu đậm
C4 3,93 6 1,65 Mang day, mau vang
ngà, dịch nuôi cấy đục
C5 3,32 4 0.5 Màng mỏng, dai,
nhắn, trắng trong, dịch nuôi cấy trong
Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi bước đầu khẳng định chủng vi khuẩn Acerobacter C5 thuộc loại vi khuẩn Acetobacter xylinum c6 kha nang tạo thành màng cellulose mỏng, dai Chúng tôi quyết định lựa chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum C5 lam đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo
Kiểm tra khả năng tạo màng ổn định của chủng vi khuẩn C5 qua 3 lần liên tiếp bằng cách: từ các mẫu màng dai, nhắn, mỏng thu được (do các khuẩn lạc của chủng C5 vào môi trường dịch thể) tiến hành phân lập lại trên môi trường thạch đĩa Các khuẩn lạc biểu hiện khá đồng nhất (đặc điểm màu sắc, kích thước của khuẩn lạc giống với chủng C5)
Từ các khuẩn lạc này tiếp tục tiến hành nuôi cấy trên môi trường dịch thể cũng thấy xuất hiện màng sau 3 - 4 ngày nuôi cấy Qua 3 lần tuyển chọn