- Địa điểm lấy mẫu: Mẫu được lấy từ các quầy bán thức ăn trên vỉa hè, trước các chợ, cơng viên, trường học, tại các quận: Q. 3, Q. 5, Q. 8, Q. 10 và quận Tân Bình.
2.2.3.2. Tiêu chuẩn phân tích
Các mẫu được phân tích bằng phương pháp PCR và nuơi cấy theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế (QĐ867/98) đối với các chỉ tiêu vi sinh phân tích được chọn của đề tài
(E. coli, Salmonella, S. aureus, B. cereus và C. perfringens) tương ứng với nhĩm
thực phẩm (sữa, nước giải khát và kem) được thể hiện ở Bảng 2.1, Bảng 2.2 và Bảng 2.3 [2].
Bảng 2.1. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhĩm sữa
STT Vi sinh vật kiểm tra Mức độ tối đa cho phép (CFU/g)
1 E. coli/g 3
2 S. aureus/g 0
3 B. cereus/g 0
4 Salmonella/25g 0
Bảng 2.2 Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát
STT Vi sinh vật kiểm tra Mức độ tối đa cho phép (CFU/g)
1 E. coli/g 0
2 S. aureus/g 0
3 C. perfringens/g 0
Bảng 2.3. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhĩm kem
STT Vi sinh vật kiểm tra Mức độ tối đa cho phép (CFU/g)
1 E. coli/g 0
2 S. aureus/g 10
3 C. perfringens/g 10
4 Salmonella/25g 0
2.2.3.3. Địa điểm thực hiện
Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR và bằng phương pháp nuơi cấy được thực hiện tại phịng Thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh học Phân tử Trường ĐHKHTN, ĐHQG, TP. HCM vàphịngVi sinh Thực phẩm - Viện Vệ sinh y tế Cơng Cộng, TP. HCM.
2.2.3.4. Quy trình kiểm nghiệm
Các quy trình PCR xét nghiệm vi sinh gây ngộ độc dùng trong nghiên cứu này được xây dựng trên cơ sở định tính sự hiện diện của vi sinh gây ngộ độc trong thực phẩm (0CFU/g hay 0CFU/25g). Tuy nhiên, một số chỉ tiêu vi sinh như E. coli,
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens ở một số thực phẩm
đường phố lại được phép hiện diện ở một mật độ nhất định trong thực phẩm (thường trong khoảng 3 - 10CFU/g). Trong trường hợp này, các quy trình PCR định tính cũng được áp dụng để xét nghiệm mẫu cĩ đạt hay khơng bằng cách thêm một bước pha lỗng mẫu sau khi được đồng nhất thành một độ pha lỗng tương ứng với mật độ cho phép trước khi thực hiện bước ủ tăng sinh (ví dụ pha lỗng 3 lần nếu mật độ cho phép là 3CFU/g hoặc pha lỗng 10 lần nếu mật độ cho phép là 10CFU/g).
Quy trình xét nghiệm định tính và xét nghiệm định lượng chỉ khác nhau ở bước đồng nhất mẫu và pha lỗng trước khi tăng sinh. Các bước cịn lại của hai quy trình xét nghiệm này là như nhau. Quy trình xét nghiệm này bao gồm 5 bước:
a. Bước 1: Đồng nhất mẫu, pha lỗng và tăng sinh
* Chỉ tiêu E. coli (0CFU/g hoặc cho phép 3CFU/g tùy loại thực phẩm) - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml mơi trường tăng sinh TSB.
- Pha lỗng và tăng sinh tùy theo từng chỉ tiêu cụ thể như sau:
+ Đối với chỉ tiêu 0CFU/g (nhĩm nước giải khát và kem)
Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa E. coli ít nhất 1CFU/g mẫu khơng đạt.
+ Đối với chỉ tiêu 3CFU/g (nhĩm sữa)
Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) pha lỗng 3 lần bằng cách trộn với 20ml mơi trường TSB. Nếu mẫu chứa 3CFU/g thì 30ml dịch pha lỗng này chứa 3CFU hay 1CFU/10ml. Hút 9,9ml dịch pha lỗng để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa trên 3CFU/g mẫu khơng đạt.
* Chỉ tiêu Staphylococcus aureus (khơng cho phép hoặc cho phép 10 CFU/g tùy loại thực phẩm)
- Pha lỗng và tăng sinh theo từng chỉ tiêu cụ thể như sau:
+ Đối với chỉ tiêu 0CFU/g (nhĩm sữa và nước giải khát)
Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa S. aureus ít nhất 1CFU/g mẫu khơng đạt.
+ Đối với chỉ tiêu 10CFU/g (nhĩm kem)
Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) pha lỗng 10 lần bằng cách trộn với 90ml mơi trường TSB. Nếu mẫu chứa 10CFU/g thì 100ml dịch pha lỗng này chứa 10CFU hay 1CFU/10ml. Hút 9,9ml dịch pha lỗng để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa S. aureus trên 10CFU/g mẫu khơng đạt.
* Chỉ tiêu Bacillus cereus (khơng cho phép ở cả 3 nhĩm kem, nước giải khát và sữa)
- Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml mơi trường tăng sinh TSB. - Pha lỗng và tăng sinh như sau:
Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa B. cereus ít nhất 1CFU/g mẫu khơng đạt.
* Chỉ tiêu Clostridium perfringens (khơng cho phép hoặc cho phép 10CFU/g tùy loại thực phẩm)
- Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml mơi trường tăng sinh Thioglycolate. - Pha lỗng và tăng sinh tùy theo từng chỉ tiêu cụ thể như sau:
+ Đối với chỉ tiêu 0CFU/g (nhĩm nước giải khát)
Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa C. perfringens ít nhất 1CFU/g mẫu khơng đạt.
+ Đối với chỉ tiêu 10CFU/g (nhĩm kem, chỉ tiêu này khơng quy định ở nhĩm
sữa).
Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) pha lỗng 10 lần bằng cách trộn với 90ml mơi trường Thioglycolate. Nếu mẫu chứa 10CFU/g thì 100ml dịch pha
lỗng này chứa 10CFU hay 1CFU/10ml. Hút 9,9ml dịch pha lỗng để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa trên 10CFU/g mẫu khơng đạt.
* Chỉ tiêu Salmonella (khơng cho phép hiện diện 0CFU/25g)
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml mơi trường tăng sinh TSB, ủ 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa trên 1CFU/25g mẫu khơng đạt.
b. Bước 2: Tách chiết DNA mẫu
- Lấy 1ml dịch sau tăng sinh cho vào ống eppendorf 1,5 - 2,0ml.
- Ly tâm 800vịng/phút, chuyển dịch trên qua một ống eppendorf khác. - Ly tâm 5000vịng/5phút, bỏ dịch nổi, lấy cặn.
- Thêm 1ml nước cất vơ trùng vào ống eppendorf, vortex để huyền phù cặn. - Ly tâm 5000vịng/5phút, bỏ dịch nổi, lấy cặn.
- Thêm 300l TE, vortex.
- Đun ở 100oC/5phút (chú ý mở hờ nắp đậy trong khi đun). - Ly tâm 12.000 vịng/5 phút thu dịch nổi là DNA bản mẫu. - Bảo quản dịch DNA ở nhiệt độ 4oC.
c. Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR
- Hút 21l PCR mix bao gồm các thành phần: PCR buffer (500mM KCl, 100mM Tris-HCl), MgCl2, dNTP, mồi, khuơn DNA.
- Cho thêm 3l DNA bản mẫu vừa xử lý nhiệt vào ống PCR.
- Bổ sung 1l Taq DNA polymerase vào ống. Tổng thể tích phản ứng PCR là 25l.
Hình 2.4. Đưa mẫu vào máy PCR d. Bước 4: Thực hiện chương trình PCR như sau:
Biến tính 94oC / 5 phút 35 chu kỳ 94oC / 30 giây 55oC / 40 giây 72oC / 45 giây Giai đoạn kéo dài: 72oC / 5 phút Giai đoạn cuối: 10oC/ 5 phút
Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, sản phẩm PCR bảo quản trong tủ mát 4oC cho đến khi chạy điện di.
e. Bước 5: Điện di và đọc kết quả
- Trộn đều 8l sản phẩm PCR và 2l dung dịch nạp mẫu, sau đĩ hút 10l sản phẩm PCR này vào giếng gel, điện di trong gel agarose 1,5%, trong đệm TAE 1X với thời gian từ 30 - 45 phút, ở điện thế 100V.
- Nhuộm gel bằng Ethidium bromide 1mg/ml trong 10 - 15 phút. - Xem kết quả dưới đèn UV ở bước sĩng 312nm.
Tìm vạch sản phẩm PCR với các kích thước khuếch đại đặc trưng theo từng vi sinh vật như trình bày ở Bảng 2. 4.
Bảng 2.4. Kích thước vạch khuếch đại của các vi khuẩn nghiên cứu