PHÚC TRÌNH THỰC HÀNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

Giới thiệu Phương pháp xác định mật số vi sinh vật sử dụng buồng đếm hồngcầu có ưu điểm là xác định được mật số vi sinh vật một cách nhanhchóng với quy trình thực hiện đơn giản.. Trong m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ

SINH HỌC

PHÚC TRÌNH

THỰC HÀNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

(MSHP: CS119)

Bài 1 XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP

1 Giới thiệu

Phương pháp xác định mật số vi sinh vật sử dụng buồng đếm hồngcầu có ưu điểm là xác định được mật số vi sinh vật một cách nhanhchóng với quy trình thực hiện đơn giản Nhược điểm của phương phápnày là đễ nhầm lẫn, độ chính xác không cao, không thích hợp cho dungdịch có mật số vi sinh vật thấp và không phân biệt được tế bào sống vàchết Trong một số trường hợp cần phải xác định mật số tế bào vi sinhvật sống một cách nhanh chóng ở mức độ tương đối, tế bào vi sinh vật

sẽ được nhuộm với chất chỉ thị màu để phân biệt tế bào sống và chếttrước khi đếm dưới buồng đếm hồng cầu Phương pháp này cho phépxác định được tỷ lệ tế bào vi sinh vật sống rất nhanh chóng (từ vài phútđến vài giờ) so với phương pháp đếm mật số khuẩn lạc trên môi trườngdinh dưỡng (thường khoảng 3-4 ngày)

Phương pháp nhuộm methylene blue để xác định mật số tế

bào vi sinh vật sống dựa trên khả năng làm mất màu xanh củamethylene blue nhờ hoạt động của hệ enzyme trong tế bào vi sinh vậtsống Khi nhuộm với methylene blue, chất chỉ thị màu này sẽ xâmnhập vào tất cả tế bào vi sinh vật, chất chỉ thị màu sẽ bị khử màu bởihoạt động của enzyme 2 của tế bào sống và tế bào chết sẽ bị nhuộmmàu xanh khi quan sát dưới kính hiển vi (Painting và Kirsop, 1989)

Phương pháp đánh dấu chỉ thị huỳnh quang để xác định khả

năng sống của vi sinh vật đã được sử dụng bởi nhiều tác giả (Thanh vàNout, 2002; Breeuwer và Abee, 2000; Davey and Kell, 1996) Phươngpháp này dựa trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị huỳnh quang cFDA thểhiện cho hoạt động của enzyem nội bào (esterase) nằm ở màng tế bàochất (ở tế bào nguyên vẹn), enzyme này chỉ có được khi tế bào cònsống Khi được hấp thu vào, cFDA (bản thân chất này không màu) sẽ bịphân cắt cho ra cF (có màu xanh) tích luỹ tại màng tế bào chất vàchính cF làm bào tử phát quang màu xanh Tuy nhiên, cFDA cũng có

khả năng đi vào những tế bào có màng tế bào chất bị tổn thươngnhưng ở các tế bào này không có sự hiện diện của enzyme nội bào nênkhông phát quang xanh Còn chất chỉ thị huỳnh quang PI có thể đi vàonhững tế bào có màng tế bào chất bị tổn thương và đi vào nhân tế bào,

ở đây chúng gắn kết xen kẻ vào chuỗi ADN của tế bào làm cho các tếbào này phát quang đỏ Ngoài ra, những tế bào ở trạng thái miên trạngkhông phát màu huỳnh quang là do chúng có màng tế bào chấtnguyên vẹn nhưng thiếu đi sự hoạt động của enzyme nội bào (Thanh

và Nout, 2004) Ưu điểm của phương pháp huỳnh quang là xác định tếbào sống nhanh (30-40 phút) tiết kiệm được nhiều thời gian so vớiphương pháp đếm sống cổ điển (2-4 ngày), nhưng đảm bảo tính chínhxác khi so sánh giữa hai phương pháp (Thanh và Nout, 2002)

2 Mục đích

Xác định tổng số vi sinh vật ( bào tử nấm mốc và tế bào nấm men) bằng phươngpháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Dựa vào phương pháp nhộm metyleneblue xác định số tế bào sống và chết trong tổng số tế bào đếm được

3 Vật liệu và phương tiện

3.1 Mẫu vật: Nấm men và nấm mốc

3.2 Hoá chất

- Nước cất

- Dung dịch Methylene blue (C16H18ClN3S): Hòa tan 0,01 g methylene blue vào

10 mL nước cất Thêm vào 2 g sodium citrate dihydrate và khuấy đều đến khi hoà tanhoàn toàn Dịch hòa tan sau đó được lọc qua giấy lọc và thêm nước cất đến 100 mL.Dung dịch được trữ trong chai màu nâu để tránh sáng

3.3 Thiết bị và Dụng cụ

- Kính hiển vi điện tử

- Bếp đun cách thuỷ (water-bath) Julabo TW20

- Máy ly tâm Eppendorf HERMLE Z233M-2

- Pipet, micro-pipet Biohit-6047831

- Buồng đếm hồng cầu Bürk – Türk

- Ống nghiệm, ống/tuýp Eppendorf

Và các thiết bị, dụng cụ thường dùng trong phòng thí nghiệm.

4 Phương pháp

Chuẩn bị dịch trích vi sinh vật: Bào tử nấm mốc hay tế bào nấm men tổng số

được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu Bürk-Türk.Chuẩn bị huyền phù bào tử nấm mốc hoặc tế bào nấm: cân 1 g mẫu bột vào ống nghiệm

vô trùng, cho vào 9 mL nước cất vô trùng, sau đó dùng máy vortex làm đều dịch huyềnphù

Cách thực hiện được tóm tắt theo quy trình sau:

1g mẫu + 9ml nước cất  nồng độ 101

Pha loãng mẫu (1ml mẫu + 9ml nước cất)  thêm 2 nồng độ 102, 103

Lấy 0.5 ml mẫu ở nồng độ 103 + 0.5 ml dung dịch methylene blue

Đếm mật số bào tử / tế bào trên buồng đếm Bürk-Türk dưới KHV điện tử

Trong đó: tế bào/ bào tử bị nhuộm màu là tế bào/bào tử chết và tếbào không bị nhuộm màu là tế bào sống/bào tử

Sau khi đếm tổng số vi sinh vật trên buồng đếm (tính cả sống vàchết), tính bào tử tổng số/ gam cơ chất theo công thức:

5 Kết quả và thảo luận

- Nấm men: ở nồng độ pha loãng 2 x 103 tổng số tế bào trong 4 ô lớn đếmđược là 94, trong đó có 91 tế bào sống (không bắt màu) và 3 tế bào chết (bắt màu)

Kết quả: N = [94/0,016] 103 2 103= 1,175 1010 (tế bào/ g)

- Nấm mốc: ở nồng độ pha loãng 2 x 103 tổng số tế bào trong 4 ô lớn đếmđược là 36, trong đó có 35 tế bào sống (không bắt màu) và 1 tế bào chết (bắt màu)

Kết quả: N= [36/0,016] 103 2 103= 4,5 109 (tế bào/ g)

6 Kết luận:

- Tế bào sống không bắt màu methylene blue và tế bào chết thì bắt màu xanh củamethylene blue

- Biết được cách đếm vi sinh vật tổng số bằng phương pháp đếm trực tiếp

Tài liệu tham khảo

Breeuwer, P., and Abee, T., 2000 Assessment of viability of microorganisms employing

fluorescence techniques International Journal of Food Microbiology 55, pp.193-200

Thanh, N V., and Nout, M J R., 2002 Rhizopus oligosporus biomass, sporangiospore yield and viability as influenced by harvesting age and processing conditions Food Microbiology

19, pp.91-96

Thanh, N V., and Nout, M J R., 2004 Dormancy, activation and viability of Rhizopus oligosporus sporangiospores International Journal of Food Microbiology 92, pp.171-179

Painting, K and Kirsop, B., 1989 A quick method for estimating the percentage of viable cells in

a yeast population, using methylene blue staining World for Culture Collections, Technicalinformation Federation sheet No 2 UNESCO/WFCC - Education Committee

BÀI 2 XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM MỐC BẰNG

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRẢI

1 Giới thiệu

Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty Nấm men lànhững tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạngkhuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi Đơn vị hình thành khuẩn lạc củanấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường.Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty (Lê Thùy Linh, 2010).Tổng số nấm men và nấm mốc có thể được xác định bằng phương pháp đổ đĩa trong môitrường thạch hoặc xác định bằng phương pháp cấy gạt trên bề mặt thạch Trong thínghiệm nhóm sử dụng phưng pháp cấy gạc:

Phương pháp cấy gạt (kỹ thuật hộp trải)

- Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương đươngvới 2 giọt dịch) Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và không nên vượtquá vài trăm (có thể dùng thể tích mẫu cấy từ 0,05 - 0,5ml; tuy nhiên, thể tích mẫu cấycàng nhỏ thì sai số có thể xảy ra càng lớn)

- Khi tất cả các thể tích 0,1 ml tế bào ở các độ pha loãng khác nhau đều đã được chuyểnlên bề mặt thạch của đĩa pêtri, sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh hoặc kim loại để dànđều các tế bào trên bề mặt thạch Lưu ý rằng que cấy gạt thuỷ tinh phải được vô khuẩntrước khi được đưa vào đĩa petri tiếp theo

Phương pháp này có một số ưu nhược điểm sau:

+ Chỉ cấy được thể tích mẫu nhỏ

+ Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp

2 Mục đích

Trong thực phẩm, xác định lượng nấm mốc và nấm men hiện diện

để đánh giá chất lượng, tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quảnsản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm vì nấm men vàmốc tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùihay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm (Lê ThanhMai et al., 2004) Ngoài ra, nhiều nấm mốc có thể sản xuất ra các sảnphẩm phụ, các sản phẩm phụ này có thể là chất độc đối với con người.Một số nấm mốc có thể sản xuất độc tố (mycotoxin)

3 Vật liệu, phương tiện

3.1 Mẫu vật: chả lụa.

3.2 Hóa chất môi trường

Môi trường OGYA

Pha chế: Đun sôi để hòa tan thành phần trên trong nước cất, để

nguội khoảng 45oC trong nồi cách thủy, điều chỉnh để pH là 6,6 ± 0,1 ở25ºC, chứa từng lượng 250ml vào bình có dung tích phù hợp, hấpthanh trùng 121ºC trong 15 phút Trong trường hợp không cóoxytetracyline có thể thay bằng cloramphenicol (C11H12C12N2O5) và đượcchuẩn bị như sau: Từ các lọ đã chứa 100ml môi trường không cóoxytetracyline, làm chảy môi trường và duy trì ở 45ºC trong nồi chưngcách thủy Chuẩn bị dung dịch 0,1% oxytetracyline bằng cách hòa tan0,1g oxytetracyline trong 100ml nước cất, lọc thanh trùng Cho 25mldung dịch 0,1% oxytetracyline vào 250ml môi trường đã nóng chảy, lắc

để trộn đều

3.3 Dụng cụ, thiết bị:

- Đĩa pêtri

- Pipet, micro-pipet Biohit-6047831

- Các thiết bị, dụng cụ thường dùng trong phòng thí nghiệm

4 Phương pháp

Trong môi trường OGYA có oxytetracyline là chất kháng sinh ức chế vi khuẩnkhác

Cách thực hiện được tóm tắt theo quy trình sau:

Mẫu cắt nhỏ (đồng thời đổ môi trường OGYA vào 8 đĩa petri,

Ủ 300C trong 24-72 giờ

Đếm khuẩn lạc (chỉ ở đĩa có khuẩn lạc <300)

Tính kết quả (đơn vị CFU/g)

Kết quả và cách tính số khuẩn lạc trên đĩa petri dựa trên công thức:

N = x d

Trong đó:

N: Số khuẩn lạc trong 1g mẫu (CFU/g)

C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri

d: Nồng độ pha loãng mẫu, đĩa petri đầu tiên được chọn đểđếm có số khuẩn lạc thỏa điều kiện <300

n1: Số đĩa chọn đếm khuẩn lạc ở nồng độ đầu tiên

n2: Số đĩa chọn đếm khuẩn lạc ở nồng độ kế tiếp

5 Kết quả và thảo luận

Nhóm chọn tính kết quả ở nồng độ 101 Do trong bài chỉ dùng 0,1

ml mẫu ở các nồng độ chuyển vào môi trường đã chuẩn bị sẵn nênphải x10 để đổi thành 1 ml

6 Kết luận

- Xác định đựơc tổng số nấm men và nấm mốc bằng phương pháp cấytrải

- Biết cách thực hiện thao tác cấy trải

- Biết được ý nghĩa của các kết quả đối với quy định an toàn vệ sinhthực phẩm

Tài liệu tham khảo

Lê Thanh Mai 2008 Phân tích vi sinh thực phẩm Trường Đại học Bách khoa Hà

Nội

Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng và Lê Thị Lan

Chi 2004 Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Trường Đại học

Bách khoa Hà Nội

Lê Thùy Linh 2010 Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm Trường Đại học Công

nghiệp thực phẩm TP HCM

TCVN 5750:1993 1993 Phương pháp xác định nấm men và nấm mốc Hà Nội

Trần Linh Thước 1998 Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm, mỹ

phẩm NXB Giáo dục

BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU

KHÍ

1 Giới thiệu

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điềukiện có sự hiện diện của oxi phân tử, là vi sinh vật phát triển được ở nhiệt độ 30-37oCtrong điều kiện hiếu khí trên môi trường dinh dưỡng không chọn lọc Tổng số vi khuẩnhiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm

Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trườngthạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem khuẩn lạc là một sinh khốiphát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hìnhthành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm Chỉ

số này có một số tên gọi khác nhau như sau: số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count,APC), tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count, TPC), tổng số vi sinh vật sống ( TotalViable Count, TVC), số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count, SPC)

2 Mục đích

Xác định được tổng số Vi sinh vật trong môi trường hiếu khí bằng phương pháp đếm

3 Vật liệu, phương tiện

3.1 Mẫu vật: Chả lụa

3.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường PCA (Plate Count Agar)

Lấy môi trường PCA đã để nguội bớt (khoảng 45oC) rót vào mỗi

đĩa (15 -20 ml PCA) rồi lắc trộn đều theo hình số 8

Để nguội

Ủ 370C trong 24-72 giờ

Đếm khuẩn lạc (chỉ ở đĩa có khuẩn lạc <300)

Tính kết quả (đơn vị CFU/g)

Kết quả và cách tính số khuẩn lạc trên đĩa petri dựa trên công thức:

N = x d

Trong đó:

: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri

d: Nồng độ pha loãng mẫu, mà ở đó đĩa petri đầu tiên đượcchọn để đếm có số khuẩn lạc thỏa điều kiện 30 < x < 300.n1: Số đĩa chọn đếm các khuẩn lạc ở nồng độ đầu tiên(n1= 1 hoặc n1= 2)

n2: Số đĩa chọn đếm các khuẩn lạc ở nồng độ kế tiếp (n2

= 1 hoặc n2 = 2)

5 Kết quả và thảo luận

Nhóm Mẫu Môi trường Nồng độ pha loãng

Kết quả cách tính số khuẩn lạc trong dĩa Petri của các mẫu:

- Mẫu chả lụa: N = [(47 + 56)/2] x 106 = 5,77 107 CFU/g

- Mẫu thịt cá: N= [(3+2)/2] x 104 = 2,5 104 CFU/g

- Mẫu thịt heo: N= [(15+39)/2] x 104 = 2,7 105 CFU/g

So sánh với quy định an toàn vệ sinh thực phẩm thì các mẫu nàynằm trong giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thựcphẩm

Mẫu ở nhóm I ở nồng độ 105 có sự bất thường khi số khuẩn lạcthấp hơn so với các nồng độ pha loãng sau Kết quả bất thường này cóthể là do trong quá trình thao tác có sai sót như: trộn mẫu không đềukhiến các vi sinh vật hiếu khí nằm ở dưới đáy, trong lúc lấy dung dịchmẫu chưa lắc đều chỉ lấy ở bề mặt

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Dénombrement des micro-organismes par comptage descolonies obtenus à 30oC Méthode de routine Microbiologiealimentaire 8e édition, Tome 2-AFNOR 2002, page 11 NF V08-051

BÀI 4 PHƯƠNG PHÁP ĐẾM COLIFORMS TỔNG SỐ,

COLIFORMS CHỊU NHIỆT VÀ E COLI

(Phương pháp MPN)

Phương pháp MPN NF ISO 4831, NF V08-016

I Giới Thiệu

1 Định nghĩa

Coliforms tổng số là những sinh vật hình que, Gram âm, hiếu khí,

kị khí tuỳ nghi, có khả năng phát triển trong môi trường có muối mật,

lên men đường lactose và sinh gas ở nhiệt độ 35-370C trong vòng

24-48 giờ, oxydase âm tính

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng sinh trưởng vàphát triển ở 44,5oC

E.coli là Coliforms chịu nhiệt nhưng có khả năng sinh Indol từTryptophane

- Phương pháp phải trải qua nhiều giai đoạn

-Dễ xảy ra sai số trong quá trình thao tác

2 Hoá chất – môi trường

Dung dịch pha loãng

Môi trường xanh lục sáng (Brilliant Green Bile Broth – BGBL)

Môi trường Peptone d’indol

- Nước cất 1.000 mL

Hòa tan 15 g bột khan trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn Chỉnh

pH = 7,3 Phân 5-10 mL môi trường vào các ống nghiệm 16 x 160 mm Khử trùng nhiệt ướt

ở 121oC/20 phút

Thuốc thử Kovac’s

- P.méthyl amino bezandéhyde 5 g

- Alcool amylique 75 mL

Hút 1ml mỗi mẫu pha

Ống nghiệm có chuông Durham

Durham

Môi trườngTLS

Ủ 370C trong 24-48h

Có bọtkhí Quan sát xem những ống dương

tínhỐng nghiệm có chuông Durham

Durham

Hút 1mlMôi trường

BGBL

Ủ 370C trong 24-48h

Quan sát những ống có bọt khí và vẫn đục

Tra bảng MPN và tính kết quả

Xác định Coliforms chịu nhiệt và E Coli :

V Kết quả - Thảo luận

Hút 1ml mỗi mẫu pha

Môi trường TLS trong ống nghiệm có chuông

Durham

Ủ 44.50C trong

24-48h Có bọtkhí

Vẫn đụcQuan sát và ghi nhận những ống dương

Môi trườngPeptone d’indol

Môi trường BGBL trong ống

nghiệm có chuông Durham

Ủ 44.50C trong 24-48h

Ủ 44.50C trong

24-48hQuan sát những ống có bọt khí và vẫn

đục

Quan sát những ống có bọt khí và vẫn

đụcThuốc thử Kovac’sTra bảng MPN và tính kết