PHÚC TRÌNH THỰC HÀNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÚC TRÌNH THỰC HÀNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT (MSHP: CS119) Bài XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP Giới thiệu Phương pháp xác định mật số vi sinh vật sử dụng buồng đếm hồng cầu có ưu điểm xác định mật số vi sinh vật cách nhanh chóng với quy trình thực đơn giản Nhược điểm phương pháp đễ nhầm lẫn, độ xác khơng cao, khơng thích hợp cho dung dịch có mật số vi sinh vật thấp không phân biệt tế bào sống chết Trong số trường hợp cần phải xác định mật số tế bào vi sinh vật sống cách nhanh chóng mức độ tương đối, tế bào vi sinh vật nhuộm với chất thị màu để phân biệt tế bào sống chết trước đếm buồng đếm hồng cầu Phương pháp cho phép xác định tỷ lệ tế bào vi sinh vật sống nhanh chóng (từ vài phút đến vài giờ) so với phương pháp đếm mật số khuẩn lạc môi trường dinh dưỡng (thường khoảng 3-4 ngày) Phương pháp nhuộm methylene blue để xác định mật số tế bào vi sinh vật sống dựa khả làm màu xanh methylene blue nhờ hoạt động hệ enzyme tế bào vi sinh vật sống Khi nhuộm với methylene blue, chất thị màu xâm nhập vào tất tế bào vi sinh vật, chất thị màu bị khử màu hoạt động enzyme tế bào sống tế bào chết bị nhuộm màu xanh quan sát kính hiển vi (Painting Kirsop, 1989) Phương pháp đánh dấu thị huỳnh quang để xác định khả sống vi sinh vật sử dụng nhiều tác giả (Thanh Nout, 2002; Breeuwer Abee, 2000; Davey and Kell, 1996) Phương pháp dựa sở sử dụng chất thị huỳnh quang cFDA thể cho hoạt động enzyem nội bào (esterase) nằm màng tế bào chất (ở tế bào nguyên vẹn), enzyme có tế bào sống Khi hấp thu vào, cFDA (bản thân chất không màu) bị phân cắt cho cF (có màu xanh) tích luỹ màng tế bào chất cF làm bào tử phát quang màu xanh Tuy nhiên, cFDA có khả vào tế bào có màng tế bào chất bị tổn thương tế bào khơng có diện enzyme nội bào nên khơng phát quang xanh Còn chất thị huỳnh quang PI vào tế bào có màng tế bào chất bị tổn thương vào nhân tế bào, chúng gắn kết xen kẻ vào chuỗi ADN tế bào làm cho tế bào phát quang đỏ Ngoài ra, tế bào trạng thái miên trạng không phát màu huỳnh quang chúng có màng tế bào chất nguyên vẹn thiếu hoạt động enzyme nội bào (Thanh Nout, 2004) Ưu điểm phương pháp huỳnh quang xác định tế bào sống nhanh (30-40 phút) tiết kiệm nhiều thời gian so với phương pháp đếm sống cổ điển (2-4 ngày), đảm bảo tính xác so sánh hai phương pháp (Thanh Nout, 2002) Mục đích Xác định tổng số vi sinh vật ( bào tử nấm mốc tế bào nấm men) phương pháp đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu Dựa vào phương pháp nhộm metylene blue xác định số tế bào sống chết tổng số tế bào đếm Vật liệu phương tiện 3.1 Mẫu vật: Nấm men nấm mốc 3.2 Hoá chất - Nước cất - Dung dịch Methylene blue (C16H18ClN3S): Hòa tan 0,01 g methylene blue vào 10 mL nước cất Thêm vào g sodium citrate dihydrate khuấy đến hoà tan hoàn toàn Dịch hòa tan sau lọc qua giấy lọc thêm nước cất đến 100 mL Dung dịch trữ chai màu nâu để tránh sáng 3.3 Thiết bị Dụng cụ - Kính hiển vi điện tử - Bếp đun cách thuỷ (water-bath) Julabo TW20 - Máy ly tâm Eppendorf HERMLE Z233M-2 - Pipet, micro-pipet Biohit-6047831 - Buồng đếm hồng cầu Bürk – Türk - Ống nghiệm, ống/tuýp Eppendorf Và thiết bị, dụng cụ thường dùng phòng thí nghiệm Phương pháp Chuẩn bị dịch trích vi sinh vật: Bào tử nấm mốc hay tế bào nấm men tổng số xác định phương pháp đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu Bürk-Türk Chuẩn bị huyền phù bào tử nấm mốc tế bào nấm: cân g mẫu bột vào ống nghiệm vô trùng, cho vào mL nước cất vô trùng, sau dùng máy vortex làm dịch huyền phù Cách thực tóm tắt theo quy trình sau: 1g mẫu + 9ml nước cất  nồng độ 101 Pha loãng mẫu (1ml mẫu + 9ml nước cất)  thêm nồng độ 102, 103 Lấy 0.5 ml mẫu nồng độ 103 + 0.5 ml dung dịch methylene blue Đếm mật số bào tử / tế bào buồng đếm Bürk-Türk KHV điện tử Trong đó: tế bào/ bào tử bị nhuộm màu tế bào/bào tử chết tế bào không bị nhuộm màu tế bào sống/bào tử Sau đếm tổng số vi sinh vật buồng đếm (tính sống chết), tính bào tử tổng số/ gam chất theo công thức: N= [a/0,016] 103 10n (tế bào/ g) Trong đó: a: tổng số tế bào ô lớn 0,016: thể tích lớn () n: độ pha lỗng 103: số chuyển mm3 thành mL (1000 mm3 = 1mL) Kết thảo luận - Nấm men: nồng độ pha loãng x 10 tổng số tế bào ô lớn đếm 94, có 91 tế bào sống (khơng bắt màu) tế bào chết (bắt màu) Kết quả: N = [94/0,016] 103 103= 1,175 1010 (tế bào/ g) - Nấm mốc: nồng độ pha loãng x 10 tổng số tế bào ô lớn đếm 36, có 35 tế bào sống (không bắt màu) tế bào chết (bắt màu) Kết quả: N= [36/0,016] 103 103= 4,5 109 (tế bào/ g) Kết luận: - Tế bào sống khơng bắt màu methylene blue tế bào chết bắt màu xanh methylene blue - Biết cách đếm vi sinh vật tổng số phương pháp đếm trực tiếp Tài liệu tham khảo Breeuwer, P., and Abee, T., 2000 Assessment of viability of microorganisms employing fluorescence techniques International Journal of Food Microbiology 55, pp.193-200 Thanh, N V., and Nout, M J R., 2002 Rhizopus oligosporus biomass, sporangiospore yield and viability as influenced by harvesting age and processing conditions Food Microbiology 19, pp.91-96 Thanh, N V., and Nout, M J R., 2004 Dormancy, activation and viability of Rhizopus oligosporus sporangiospores International Journal of Food Microbiology 92, pp.171-179 Painting, K and Kirsop, B., 1989 A quick method for estimating the percentage of viable cells in a yeast population, using methylene blue staining World for Culture Collections, Technical information Federation sheet No UNESCO/WFCC - Education Committee BÀI XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM MỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP CẤY TRẢI Giới thiệu Nấm mốc vi nấm dạng sợi, sinh sản bào tử khuẩn ty Nấm men tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, tồn dạng khuẩn ty giả tế bào kết thành chuỗi Đơn vị hình thành khuẩn lạc nấm mốc nấm men mầm để tạo nên khuẩn lạc nuôi cấy môi trường Mầm bào tử, tế bào hay đoạn khuẩn ty (Lê Thùy Linh, 2010) Tổng số nấm men nấm mốc xác định phương pháp đổ đĩa môi trường thạch xác định phương pháp cấy gạt bề mặt thạch Trong thí nghiệm nhóm sử dụng phưng pháp cấy gạc: Phương pháp cấy gạt (kỹ thuật hộp trải) - Dùng pipet vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào đĩa thạch (tương đương với giọt dịch) Số tế bào cấy bề mặt thạch phải dàn không nên vượt q vài trăm (có thể dùng thể tích mẫu cấy từ 0,05 - 0,5ml; nhiên, thể tích mẫu cấy nhỏ sai số xảy lớn) - Khi tất thể tích 0,1 ml tế bào độ pha loãng khác chuyển lên bề mặt thạch đĩa pêtri, sử dụng que cấy gạt thuỷ tinh kim loại để dàn tế bào bề mặt thạch Lưu ý que cấy gạt thuỷ tinh phải vô khuẩn trước đưa vào đĩa petri Phương pháp có số ưu nhược điểm sau: - Ưu điểm: + Nhận dạng dạng khuẩn lạc đặc trưng + Dễ dàng làm dòng vi sinh vật + Xác định vi sinh vật nhạy nhiệt - Nhược điểm: + Chỉ cấy thể tích mẫu nhỏ + Chỉ cho phép đếm số lượng khuẩn lạc thấp Mục đích Trong thực phẩm, xác định lượng nấm mốc nấm men diện để đánh giá chất lượng, tình trạng vệ sinh điều kiện bảo quản sản phẩm dự đoán khả hư hỏng sản phẩm nấm men mốc tăng trưởng làm thay đổi màu thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu thực phẩm (Lê Thanh Mai et al., 2004) Ngoài ra, nhiều nấm mốc sản xuất sản phẩm phụ, sản phẩm phụ chất độc người Một số nấm mốc sản xuất độc tố (mycotoxin) Vật liệu, phương tiện 3.1 Mẫu vật: chả lụa 3.2 Hóa chất môi trường Môi trường OGYA Yeast extract 5g Glucose 20g Oxytetracyline 0,1g Agar 15g Nước cất 1000ml Pha chế: Đun sôi để hòa tan thành phần nước cất, để nguội khoảng 45oC nồi cách thủy, điều chỉnh để pH 6,6 ± 0,1 25ºC, chứa lượng 250ml vào bình có dung tích phù hợp, hấp trùng 121ºC 15 phút Trong trường hợp khơng có oxytetracyline thay cloramphenicol (C 11H12C12N2O5) chuẩn bị sau: Từ lọ chứa 100ml mơi trường khơng có oxytetracyline, làm chảy mơi trường trì 45ºC nồi chưng cách thủy Chuẩn bị dung dịch 0,1% oxytetracyline cách hòa tan 0,1g oxytetracyline 100ml nước cất, lọc trùng Cho 25ml dung dịch 0,1% oxytetracyline vào 250ml mơi trường nóng chảy, lắc để trộn 3.3 Dụng cụ, thiết bị: - Đĩa pêtri - Pipet, micro-pipet Biohit-6047831 - Các thiết bị, dụng cụ thường dùng phòng thí nghiệm Phương pháp Trong mơi trường OGYA có oxytetracyline chất kháng sinh ức chế vi khuẩn khác Cách thực tóm tắt theo quy trình sau: Mẫu cắt nhỏ (đồng thời đổ môi trường OGYA vào đĩa petri, để nguội) Lấy g mẫu cho vào 45 ml dung dịch chuẩn bị trước  Nồng độ 101 Pha loãng mẫu (5 ml dịch nồng độ 101 + 45 ml nước peptone chuẩn bị trước) thành nồng độ: 102, 103, 104 Dùng pipet lấy 0,1 ml mẫu nồng độ cho vào đĩa môi trường OGYA ( dùng que trải trải mẫu lên bề mặt đĩa môi trường ) Ủ 300C 24-72 Đếm khuẩn lạc (chỉ đĩa có khuẩn lạc 1.1 x 103 MPN/g * Kết quả: Coliforms tổng số >1.1 x 103 MPN/g ►Nhận xét: Dựa vào kết tra bảng MPN ta thấy coliforms tổng số mẫu thịt heo cao chả lụa thấp cá nhìn chung loại mẫu nầy có coliforms nên khơng an tồn cho sức khỏe Coliforms chịu nhiệt e.coli: Nhóm Mẫu Nhiệt độ Mơi Nồng độ pha loãng 101 102 103 104 I1 Chả lụa I2 Cá I3 44.540C Thịt trường TLS 1 BGBL 1 Pepton 1 TLS 0 BGBL 0 Pepton 0 TLS 3 BGBL 3 Pepton 3 Kết xét nghiệm Coliforms chịu nhiệt E.coli * Coliforms  Kết mẫu chả lụa - Ta lấy kết nồng độ 101→103 là: 211 - Tra vào bảng MPN - Vì nồng độ đầu 101 nên ta có kết x 101 MPN/g *Kết quả: Coliforms chiệu nhiệt x 101 MPN/g  Kết mẫu cá - Ta lấy kết nồng độ 101→103 là: 210 - Tra vào bảng MPN 1,5 - Vì nồng độ đầu 101 nên ta có kết 1,5 x 101 MPN/g *Kết quả: Coliforms chiệu nhiệt 1,5 x101 MPN/g  Kết mẫu thịt - Ta lấy kết nồng độ 101→103 là: 333 - Tra vào bảng MPN >110 Vì nồng độ đầu 101 nên ta có kết >1.1 x 103 MPN/g *Kết quả: Coliforms chiệu nhiệt >1.5 x 103 MPN/g * E.coli  Kết mẫu chả lụa - Ta lấy kết nồng độ 101→103 là: 111 - Tra vào bảng MPN 1,1 - Vì nồng độ đầu 101 nên ta có kết 1.1 x 101 MPN/g *Kết quả: Tổng số E.coli 1,1 x 101MPN/g  Kết mẫu cá - Ta lấy kết nồng độ 101→103 là: 210 - Tra vào bảng MPN 1.5 - Vì nồng độ đầu 101 nên ta có kết 1,5 x 101 MPN/g - *Kết quả: Tổng số E.coli 1,5 x 101 MPN/g  Kết mẫu thịt - Ta lấy kết nồng độ 101→103 là: 333 - Tra vào bảng MPN >110 - Vì nồng độ đầu 101 nên ta có kết > 1,1 x 103 MPN/g *Kết quả: Tổng số E.coli >1.1 x 103 MPN/g ►Nhận xét: ống nghiệm có bọt khí chng Duham giá ống nghiệm ủ 44,5oC ( dương tính ) khoảng 99% dương tính với thuốc thử Kovac’s( có e.coli) Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả: - Trong trình nghiền mẫu chưa nát làm vi sinh vật tách khỏi mẫu không nhiều - Do mẫu phải pha lỗng nhiều lần q trình pha lỗng chưa thực thao tác trộn mẫu nồng độ đậm đặc, vi sinh vật tụ lại chưa tách ra, nên ta pha lỗng từ mẫu đậm đặc sang mẫu lỗng có phân bố không mẫu pha lỗng.Từ dẫn đến khơng có khơng có vi sinh vật phát triển - Hiện tượng sủi bột khí đục mơi trường: Ngun nhân dẫn đến khơng có tượng sủi bọt khí: Chưa trộn mẫu nồng độ đậm đặc kĩ trước pha loãng mẫu - Các ống nghiệm pha loãng xong chưa lắc kĩ  Từ nguyên nhân cần lưu ý, trình thực thí nghiệm đặc biệt thí nghiệm liên quan đến vi sinh vật cần có xác, cẩn thận tĩ mĩ thao tác thực VI Kết luận Kinh nghiệm thực thao tác thí nghiệm: - Trước pha lỗng mẫu nồng độ đậm đặc sang mẫu nồng độ loãng phải trộn mẫu để vi sinh vật phân bố đều, nên pha lỗng mẫu mật số vi sinh vật - phân bố đồng mẫu pha lỗng Trong thí ngiệm u cầu trước đưa vào tủ ủ cần lắc ống nghiệm khơng bọt khí ống Durham, khơng làm nhằm lẫn với tượng sủi bọt khí ống Durham dẫn đến kết luận sai ống nghiệm khơng có vi sinh vật phát triển Tài liệu tham khảo Directives générales pour le dénombrement des Coliformes Technique du nombre le plus probable” Microbiologie alimentaire 8e édition, Tome – AFNOR 2002, page 239 NF ISO 4831, NF V08-016 Directives générales pour le dénombrement des Escherichia coli Technique du nombre le plus probable” Microbiologie alimentaire 8e édition, Tome – AFNOR 2002, page 265 NF ISO 7251, NF V08020  ... 5750:1993 1993 Phương pháp xác định nấm men nấm mốc Hà Nội Trần Linh Thước 1998 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm, mỹ phẩm NXB Giáo dục BÀI PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU... ĐỊNH VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP Giới thiệu Phương pháp xác định mật số vi sinh vật sử dụng buồng đếm hồng cầu có ưu điểm xác định mật số vi sinh vật cách nhanh chóng với quy trình. .. Lan Chi 2004 Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Lê Thùy Linh 2010 Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP HCM