Báo cáo “Phân lập và tuyển chọn một số chủng VK Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza"

1. Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Phân bón vi sinh (PBVS) có nhiều ưu điểm nổi trội so với phân bón hóa học, ngoài tác dụng nâng cao năng xuất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí

Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại

học Đà Nẵng - 2008 300 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN AZOTOBACTER CÓ HOẠT TÍNH NITROGENAZA VÀ SINH TỔNG HỢP IAA (INDOL AXETIC AXIT) TỪ ĐẤT THÔN BÌNH KỲ- HÒA QUÝ- NGŨ

HÀNH SƠN- TP ĐÀ NẴNG TO ISOLATE AND TO SELECT

NITROGENASES ACTIVE BACTERIAL GENERA AZOTOBACTER AND SYNTHESIZE AIA FROM HAMLET BINH KY- HOA QUY- NGU HANH SON LAND

SVTH: NGUYỄN KIM ANH, lớp 04SM PHẠM THỊ NGỌC ANH, lớp 05CSM1 LÊ THỊ THÚY HOA lớp 05CSM1

NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƯ, lớp 05CSM1 ĐẬU THỊ TỈNH, lớp 04SM

GVHD:TS ĐỖ THU HÀ

Khoa: Sinh- Môi trường, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng TÓM TẮT Từ 30 mẫu

đất trồng lúa, trồng rau và đất bỏ hoang… tại thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP.Đà Nẵng, đã phân lập và tuyển chọn được 08 chủng vi khuẩn Azotobacter có khả năng cố định đạm, trong đó có 02 chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA Tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính mạnh nhất: Chủng BK- 6 cố định đạm mạnh nhất, chủng BK- 5 sinh tổng hợp IAA mạnh nhất Có thể ứng dụng 2 chủng này làm phân bón vi sinh để kích thích sự sinh trưởng của thực vật hoặc bổ sung vào các vùng đất bạc màu, nghèo dinh dưỡng để nâng

cao nguồn đạm trong đất, cải thiện sinh thái đất SUMMARY Laterfrom 30 soil

sample is different: abandonned land rice cultivar, vegetable-raising,.at Binh Ky hamlet, us have already been isolated and selections to 8 genera have Azotobacter bacteria capable of nitrogen fixation, among them there iss 2 genera be capable to synthesize AIA can apply those active banian make cropped's growth excitation microbiological fertilizer or additives 2 bacterial genera to ash level of nitrogen exacerbation degraded earth regions

1 Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề Phân bón vi sinh (PBVS) có nhiều ưu điểm nổi trội so với phân bón

hóa học, ngoài tác dụng nâng cao năng xuất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản xuất thì PBVS còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững Tuy nhiên tình hình sản xuất PBVS ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định Do dó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng PBVS là việc làm hết sức cần thiết Trong đó, việc tuyển chọn, đánh giá hoạt tính của các chủng VSV là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm Azotobacter là một loại vi khuẩn (VK) hiếu khí, sống tự do trong đất, chúng có khả năng cố định đạm cao và không phụ thuộc vào cây chủ Ngoài đặc điểm trên thì một số chủng thuộc chi này còn có khả năng sinh tổng hợp nên IAA (chất kích thích sinh trưởng ở thực vật) Chính nhờ đặc điểm quan trọng đó VK Azotobacter được ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm PBVS làm tăng năng suất cây trồng

Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà

Nẵng - 2008 301

Xuất phát từ lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng

VK Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza và sinh tổng hợp IAA từ đất thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng” nhằm tìm ra các chủng VK Azobacter đa hoạt

tính để ứng dụng cho nền nông nghiệp tại đia phương 1.2 Mục đích của đề tài Phân

lập và tuyển chọn một số chủng VK Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza và sinh tổng

hợp IAA từ đất thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng 1.3 Nội dung của đề tài - Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính

nitrogenaza và sinh tổng hợp IAA (Indol Axetic Axit) từ đất thôn Bình Kỳ- Hoà Quý- Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng - Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái của các chủng vi khuẩn tuyển chọn - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh trưởng, khả năng cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn - Thăm dò ảnh hưởng của dịch nuôi cấy các chủng VK tuyển chọn

đến sự nảy mầm của hạt đậu đen 1.4 Những đóng góp mới của đề tài Đề tài đã đi sâu

vào nghiên cứu các chủng VK Azotobacter có khả năng cố định đạm và sinh tổng hợp IAA, có thể ứng dụng trong nông nghiệp làm phân bón vi sinh kích thích sinh trưởng của thực vật hoặc bổ sung vào các vùng đất bạc màu để nâng cao nguồn đạm trong đất, cải thiện hệ sinh thái đất

2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng - Các chủng VK Azotobacter được phân lâp từ một số mẫu đất thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng 2.2 Phương pháp nghiên cứu -

Phương pháp thu mẫu, theo Erogov (1983) - Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng VK Azotobacter , Erogov,(1983) - Phương pháp đếm số lượng tế bào CFU/ml, theo Nguyễn Lân Dũng (1982) - Phương pháp xác định khả năng cố định đạm của VK Azotobacter: - Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler, theo Lê Văn Khoa (1996) - Phương pháp xác định hàm lượng IAA theo Miska và Skovski,1983 - Phương pháp

nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái của các chủng VK tuyển chọn, theo Nguyễn

Lân Dũng (1988) - Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm dịch nuôi cấy các chủng VK tuyển chọn, Mai Thị Hằng, (2000) - Khóa phân loại của Bergey (1989), Gauzse và cộng sự (1983)

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng VK cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA 3.1.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng VK Azotobacter cố định nitơ Từ 30 mẫu

đất khác nhau (trồng lúa, trồng màu, đất bỏ hoang) tại thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP.Đà Nẵng Chúng tôi phân lập được 08 chủng VK có khả năng cố định nitơ, trên MT AT Qua nghiên cứu chúng tôi nhận thấy cả 08 chủng VK phân lập được

đều thuộc chi Azotobacter Bảng 3.1 Hàm lượng NH4+ trong dịch nuôi cấy của các

Hình 3.1: Hình ảnh ống giống và phản ứng màu của 08 chủng VK tuyển chọn với thuốc

thử Nessler 3.1.2 Tuyển chọn các chủng VK cố định nitơ mạnh

Sau khi sơ tuyển được 08 chủng VK Azotobacter cố định nitơ, chúng tôi tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng cố định nitơ mạnh dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Nessler Kết quả có 3 chủng mạnh, 2 chủng trung bình và 3 chủng yếu Trong đó chủng

BK- 6 có khả năng cố định đạm mạnh nhất (3,28mg/ml), chúng tôi chọn chủng này làm

đối tượng cho các nghiên cứu sau Hình 3.2: Hình ảnh ống giống và phản ứng màu của

chủng BK- 6 với thuốc thử Nessler 3.1.3 Tuyển chọn các chủng VK Azotobacter

sinh tổng hợp IAA Từ 8 chủng VK phân lập được, chúng tôi tiếp tục tuyển chọn các

chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA, dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Salkowski Kết quả, xác định được 2 chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA Trong đó chủng BK- 5 có khả năng sinh tổng hợp IAA mạnh (4,313 μg/ml) Chúng tôi chọn chủng này làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo

Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà

Nẵng - 2008 303

Hình 3.3: Hình dạng ống giống và phản ứng màu của chủng BK- 5 với thuốc thử

Salkowski 3.2 Đặc điểm sinh học của các chủng VK tuyển chọn 3.2.1 Đặc điểm

nuôi cấy và hình thái của các chủng VK tuyển chọn

Bảng 3.3: Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của chủng VK tuyển chọn

Ngày xuất hiện KL

Gram

Hình dạng tế bào BK- 5 2 - Non: Trắng trong

- Già: Trắng đục

- Bề mặt nhẵn nhầy nhớt, khi già thì nhăn nheo, tròn đều

- Gram âm

- Hình cầu

BK- 6 5 - Non màu trắng đục, khi già chuyển màu vàng

- KL lồi, bề mặt

nhẵn, nhầy nhớt - Gram âm - Hình que ngắn

Hình 3.4: Hình ảnh khuẩn lạc và hình dạng tế bào của chủng BK- 5 và BK- 6 Trên

MT lỏng, dịch nuôi cấy của cả 2 chủng đều có màu trắng đục đều đặn, có cặn Khi già

chuyển sang màu nâu đen, độ sánh cao 3.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố MT tới sự sinh trưởng và hoạt tính của các chủng VK tuyển chọn - Chủng BK- 6 có khả năng

sinh trưởng và cố định nitơ mạnh (4,52mg NH4+/ml) trên MT AT sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ từ 28-300C - Chủng BK- 5 có khả năng sinh tổng hợp IAA cao( 6,24μg/ml) trên MT nước mắm- pepton có bổ sung 0,1% tryptophan sau 5 ngày nuôi cấy lắc ở

nhiệt độ 300C 3.4 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng VK BK-5 tới sự nảy mầm của hạt đậu đen Sau 24 h, hạt đậu đen được xử lý bằng dịch nuôi cấy của chủng BK-

5 ở nồng độ pha loãng 10-2 và 10-3 Sau 72h, tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ pha loãng 10-2 vượt 23% so với đối chứng Như vậy dịch nuôi cấy của chủng BK- 5 đã kích thích và rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt giống Vì vậy, có thể ứng dụng chủng này để xử lý hạt giống trước khi gieo

Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà

Nẵng - 2008 304

Hình 3.5: Hình ảnh hạt đậu đen nảy mầm trong đĩa petri sau 72h 3 Kết luận: + Từ 30

mẫu đất tại thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng, chúng tôi phân lập và tuyển chọn được 08 chủng VK thuộc chi Azotobacter có khả năng cố định đạm, trong đó chủng BK- 6 có khả năng cố định đạm mạnh nhất (4,52mg NH4+) Chủng BK- 5 và BK- 6 vừa có khả năng cố định đạm, vừa có khả năng sinh tổng hợp IAA, trong đó chủng BK- 5 sinh tổng hợp IAA mạnh hơn (4,313μg/ml) + Từ 08 chủng VK Azotobacter trên, chúng tôi chọn được 02 chủng đầu dòng: - Chủng BK- 6 có khả năng

sinh trưởng và cố định nitơ mạnh (4,52mg NH4+/ml) trên MT AT sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ từ 28-300C KL non màu trắng đục, nhày nhớt, khi già chuyển màu vàng nâu, TB hình que ngắn, bắt màu Gram âm - Chủng BK- 5 có khả năng sinh tổng hợp IAA cao( 6,24μg/ml) trên MT 5 sau 5 ngày nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 300C KL màu trắng

đục, nhày nhớt, TB hình cầu, bắt màu Gram âm TÀI LIỆU THAM KHẢO

Xử lý bằng dịch ở nồng độ 10-2 Đối chứng

[1] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Muộn, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1972),

Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập 1 NXB KH-KT Hà Nội

[2] Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000), Sinh học vi sinh vật NXB GD, Hà Nội [3] Egorov N.X (1983) , Thực hành VSV ( Nguyễn Lân Dũng dịch) NXB MirMatcơva,

NXB KH-KT Hà Nội

[4] Bergey’s Manual systermatic Baderiology, vol.4(1989)

[5] G.F Gause T.P Preobrazenskai, M.A.Srensnicora, P.P Terekhova, T S Macsimova

“ Opredelitels actinomycetes”, Nauka, M.1983

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG AZOTOBACTER CHO SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH VẬT

trưởng thực vật (axit indolacetic, axit gibberellic).

Việc nghiên cứu để tận dụng khả năng cố định nitơ và khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của vi khuẩn Azotobacter nhằm góp phần tăng năng suất cây trồng là một hướng thiết thực Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành phân lập, tuyển chọn chủng Azotobacter cho sản xuất phân bón vi

2/ Xác định đặc điểm, hình thái khuẩn lạc, tế bào:

3/ Xác định ảnh hưởng của các chất kháng sinh tới sự phát triển của các chủng vi sinh vật phân lập:Bằng cách xác định vòng ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ.

4/ Xác định IAA thô:

Khả năng tổng hợp IAA thô của các chủng vi sinh vật được xác định theo phương pháp Salkowski cải tiến.

Tiến hành:

• Lấy 2ml dịch vi sinh vật đã li tâm loại bỏ tế bào, bổ sung thêm 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến, lắc đều.

• Theo Misra và Kauskik, IAA tác dụng với thuốc thử Salkowsli cải tiến sẽ cho màu hồng nhạt đến đỏ phụ thuộc hàm lượng IAA được sinh ra

• Hàm lượng IAA thô được xác định theo phương pháp so màu ở 530nm với đồ thị chuẩn IAA 5/ Xác định khả năng cố định nitơ:

Đo hoạt tính nitrogenaza bằng phương pháp khử axetylen trên máy sắc ký khí PYE UNICAM series 204 chromatograp (Anh).6/ Xác định ảnh hưởng của dịch vi sinh vật đối với mầm ngô:

Hạt giống ngô tẻ P.11 và ngô lai ĐK.888 được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng nhiều lần Ngâm hạt trong nước cất vô trùng từ 3 đến 4 giờ Sau đó ủ hạt với dịch vi sinh vật đã li tâm loại bỏ tế bào (pha loãng tỷ lệ 5%) ở 30 trong 2 ngày.

7/ Xác định ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật phân lập đối với rau cải trắng:

Thí nghiệm được tiến hành trong 2 vụ Đông xuân và Hè thu 1998 trong chậu 7kg đất/chậu Nền phân bón: 40 N : 80 P205 : 40 KCông thức thí nghiệm được bón thêm 107 tế bào vi sinh vật/chậu Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Sau 45 ngày trồng, thu hoạch, đánh giá theo các chỉ tiêu: số lá/chậu, khối lượng tươi thân lá, cao cây, % vật chất khô, vitamin C, đường tổng số và hàm lượng N0

III/ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:1/ Phân lập chủng vi sinh vật từ đất:

Sau khi phân lập thu được kết quả: 13/38 mẫu đất khô và 6/12 mẫu đất ướt đã phát hiện được có chứa Azotobacter Các chủng thu nhận từ đất khô dễ tồn tại trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo Các chủng phân lập từ đất ướt kém ổn định hơn, một số bị chết sau thời gian bảo quản trong ống môi trường Do có khả năng hình thành cyst nên Azotobacter có thể chống chịu khô hạn, vì vậy để tăng cường tính chọn lọc, việc làm khô đất ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập Azotobacter là cần thiết.

Qua phân tích pH của các mẫu đất có chứa Azotobacter cho thấy các mẫu đẫt này có độ pH trong khoảng 5,15 - 7,75 Một số mẫu đất khác có độ pH thấp hơn không phát hiện thấy Azotobacter Điều này phù hợp với những nghiên cứu trước đây là Azotobacter thường được phát hiện ở đất có pH từ hơi axít đến kiềm.

Bảng 1:

sttMẫu đấtpHsttmẫu đấtpH1

Từ 18 chủng vi sinh vật phân lập được, chúng tôi chọn 3 chủng vi sinh vật phát triển ổn định, có sinh khối mạnh nhất cho các nghiên cứu tiếp theo Đồng thời, chúng tôi cũng sử dụng chủng AT.19 (chủng nhập nội, đang sử dụng cho sản xuất chế phẩm vi sinh vật) làm chủng đối chứng.

2/ Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc, tế bào của các chủng vi sinh vật:

ảnh:Hình dạng khuẩn lạc chủng 86.2 sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường Burk

Bảng 2:

Lúc còn non có màu trắng đục, lỏng Khi già ngả màu đen, không tiết sắc tố ra môi trường

Lúc còn non có màu trắng đục Khi già ngả màu vàng, không tiết sắc tố ra môi trường

tròn, 2 tế bào thường dính liền nhau thành hình số 8

Khi còn non có dạng tròn, thường 2-3 tế bào dính liền nhau

Khi còn non có dạng hình trứng, 2 tế bào thường dính liền nhau thành hình số 8

Một trong các tiêu chuẩn để đánh giá tính cạnh tranh của các vi sinh vật là sức đề kháng của chúng đối với các chất kháng sinh được tiết ra bởi các vi sinh vật sống lân cận

Bảng 3:

ảnh hưởng của các chất kháng sinh tới sự phát triển của các chủng vi sinh vật

ĐK vòng ức chếChủng (cm)vi sinh vật

100 m g/ml

1,0 m g/ml

0,5 m g/ml100 m g/ml

1,0 m g/ml

0,5 m g/ml

4/ Khả năng tổng hợp IAA thô của các chủng vi sinh vật:

Qua bảng 4 cho thấy, các chủng 86.2, 76.6, 20.2 đều có khả năng tổng hợp IAA thô Trong đó chủng 86.2 và 76.6 có hàm lượng IAA thô được tổng hợp tăng từ 6,17 đến 33,24% so với chủng AT.19 (chủng đối chứng).

5/ Khả năng cố định nitơ của các chủng vi sinh vật: Khả năng khử axetylen của các chủng vi sinh vật

Bảng 5:

Qua bảng 5 cho thấy, các chủng 86.2, 76.6, 20.2 đều có khả năng khử axelylen cao hơn chủng AT.19 (chủng đối chứng) từ 17,10 đến 56,78 nm c2h4/ml/h (13,7 - 45,49%).

6/ ảnh hưởng của dịch vi sinh vật đến sự nảy mầm của hạt ngô:Bảng 6:

Ngô lai ĐK.888Ngô tẻ P.11

7/ ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật đối với rau cải trắng:

Bảng 7: ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi sinh vật tới năng suất rau cải trắng vụ hè thu và vụ xuân 1998

Qua bảng 7 cho thấy, ở công thức nhiễm chủng 86.2, 76.6, 20.2 ở cả 2 vụ (xuân và hè thu 1998) đều cho năng suất rau cao hơn đối chứng (không nhiễm vi sinh vật) và tương đương với chủng AT.19 (chủng đối chứng).

Bảng 8: ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi sinh vật tới chất lượng rau cải trắng vụ hè thu và vụ xuân 1998

ttChủng vi sinh vậtvụ xuânvụ hè thu

Đường tổng số (%)

Vitamin C (mg/100g)

NO3- (mg/kg)Đường tổng số (%)

Vitamin C (mg/100g)

2/ 3 chủng 86.2, 76.6, 20.2 có triển vọng dùng để sản xuất phân bón vi sinh vật, Cần được tiếp tục đánh giá trên diện rộng.