Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài luận văn: "PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS CÓ ĐỘC TÍNH CAO ĐỐI VỚI CÔN TRÙNG HẠI CÂY TRỒNG" được thực hiện bởi Sinh viên Khoa Lâm Học của Đại Học Lâm Nghiệp. Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, không khí với độ ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông lâm nghiệp phát triển. Khi muốn bảo vệ năng suất cây trồng, theo thói quen, người nông dân thường sử dụng thuốc hoá học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát. Đối với cây lâm nghiệp, mỗi khi dịch xuất hiện ở vườn ươm, các cánh rừngtrồng thì số lượng hoá chất phải dùng là rất lớn. Trung bình mỗi ha cây trồng phải phun từ 5 – 7 kg thuốc. Điều đó quả thực là một vấn đề nghiêm trọng đòi hỏi các nhà khoa học nói chung và các nhà bảo vệ thực vật nói riêng cần nghiên cứu và xem xét một cách đầy đủ, bởi thuốc hoá học tuy dập tắt được nạn dịch nhanh nhưng cũng là con dao hai lưỡi, sẽ trực tiếp phá huỷ môi trường sống ở khu sản xuất đó, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ của con người,làm giảm số lượng sinh vật có lợi cho con người như chim chóc, tôm, cá, những ký sinh thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh…Tác hại của việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học đã rất rõ ràng. Trong khi đó việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, vi nấm, virus,côn trùng, thảo mộc đã được chứng minh rất an toàn đối với người và gia súc,không gây ô nhiễm môi trường, không giết chết thiên địch sâu hại và sinh vật có ích, có thể duy trì cân bằng sinh thái, không ảnh hưởng đến chất lượng nông,lâm sản...Trong khi đó, thuốc trừ sâu sinh học, kể cả thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis (được tiêu thụ nhiều nhất trong số các loại thuốc trừ sâu sinh học) vẫn chưa phổ biến. Nguyên nhân là do thói quen sử dụng thuốc trừ sâu hoá học đã ăn sâu vào tiềm thức người nông dân nước ta; thuốc trừ sâu sinh học sản suất trong nước có hiệu lực chưa cao, tính ổn định còn thấp; thuốc trừsâu sinh học nhập ngoại thì có giá thành cao; việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học vừa tiết kiệm hơn về chi phí, vừa đạt được hiệu quả tiêu diệt sâu nhanh hơn…Bởi những lý do đó nên thuốc trừ sâu sinh học vẫn không phải là lựa chọn hàng đầu của người nông dân khi muốn dập tắt nạn dịch sâu hại. Để đạt được lợi ích kinh tế trước mắt, người nông dân thường sử dụng thuốc trừ sâu hoá học. Do vậy, để góp phần đưa thuốc trừ sâu sinh học nói chung và thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ vi khuẩn Bt nói riêng đến với người nông dân, thì việc phổ biến nâng cao tầm nhận thức của người dân về thuốc trừ sâu sinh học kết hợp với việc các nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất được nhiều hơn các loại thuốc trừ sâu sinh học hoạt lực cao, giá thành hạ là rất quan trọng.Trong công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, yếu tố giống vi sinh vật giữ vai trò quyết định năng suất, chất lượng, sản lượng và giá thành sản phẩm nên công tác phân lập, tuyển chọn và bảo quản chủng giống có ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, cần tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu phân lập, tuyển chọn,ứng dụng, phân loại, nâng cao độc tính diệt sâu cũng như thúc đẩy sử dụng thuốc trừ sâu Bt trong nông – lâm nghiệp.Để tiếp tục hướng nghiên cứu phân lập và lựa chọn các chủng Bacillus thuringiensis có độc lực cao, ứng dụng có hiệu quả vào thực tiễn,tôi tiến hành khoá luận “ Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực cao với côn trùng hại cây trồng ”
TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP KHOA LÂM HỌC *** BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên khóa luận : PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS CĨ ĐỘC TÍNH CAO ĐỐI VỚI CÔN TRÙNG HẠI CÂY TRỒNG NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 307 Giáo viên hướng dẫn : Ths Nguyễn Thị Thu Hằng : Ths Hồ Văn Giảng Giảng Sinh viên thực : Trần Văn Tiến Khóa học : 2006 - 2010 Hà Nội, năm 2010 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ths Nguyễn Thị Thu Hằng – Bộ Bộ môn Giống Công nghệ Sinh học – Khoa Khoa Lâm học – Trường Đại học Lâm nghiệp tận tình trực tiếp hướng dẫn bảo tơi q trình thực khóa luận này. T xin gởi lời cảm ơn đến thầy thầy cô giáo trường Đại học Lâm nghiệp giảng dạy cho tảng kiến thức vững để tiếp thu tốt kiến thức khoa học tạo cho hội học hỏi quý giá này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Hồ Văn Giảng đóng góp ý kiến q giá cho tơi để hồn thành báo cáo Khóa luận cách tốt nhất( CHỖ NÀY CĨ CHO VÀO KHƠNG KHƠNG CƠ) Cùng với lịng biết ơn sâu sắc gứi tới tồn thể thầy , cô anh, chị Bộ môn Giống Cơng nghệ Sinh học, gia đình, bạn bè, những người giúp đỡ, dạy và động viên suốt tr ình ình học tập. Hà Nội, tháng năm 2010 2010 Sinh viên Trần Văn Tiến MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN STT Kí hiệu bảng Bảng 1.1 Tên bảng Một số type huyết chủng đại diện tương ứng Một số chủng Bt thường ứng dụng sản Bảng 1.2 xuất chế phẩm phẩm số nghiên cứu vi khuẩn Bt Bt Bảng 1.3 1.3 Một số trùng Bảng 2.1 Nguồn thu thập vi khuẩn Bt từ côn trùng Nguồn thu thập Bt từ mẫu đất khu vực Trường Bảng 2.2 Bảng 3.1 Bt phân lập từ mẫu sâu đất Bảng 3.2 Bt phân lập từ mẫu đất Hình dạng, màu sắc đường kính khuẩn lạc Bảng 3.3 chủng Bt Bt Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc chủng Bảng 3.4 Bt ĐHLN ĐHLN Số lượng bào tử/ml dịch lên lên men (thu hồi sau 60h lên 10 Bảng 3.5 men) Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá lá dưa chuột dưa hấu hấu chết 11 Bảng 3.6 bởi chế phẩm Bt Bt Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá lá cải bắp su hào chết 12 Bảng 3.7 3.7 chế phẩm Bt Bt 13 Bảng 3.8 Kết bảo quản chủng vi khuẩn Bt phân lập lập Tran g DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Kí hiệu viết tắt Giải thích Bt Bacillus thuringiensis G6 Hội trường G6 T5 Nhà thực hành T5 KTX Ký túc xá KHV Kính hiển vi vi Đk Đường kính kính ĐC ĐC Đối chứng chứng h Giờ DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG KHĨA LUẬN STT Kí hiệu Tên hình hình Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Bacillus thuringiensis độc củ nhập gây độc Bt Hình 1.2 Quá trình xâm nhập Hình 2.1 Hình ảnh nguồn mẫu thu thập vi khuẩn Bt Bt tính Hình 2.2 Hình ảnh sâu thử hoạt tính Bt Hình 3.1 Một số hình ảnh trình phân lập Bt Hình 3.2 Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc chủng Bt chủng Bt Hình ảnh hiệu diệt sâu ăn dưa chuột dưa Hình 3.3 Hình 3.4 Hình ảnh hiệu diệt sâu ăn cải bắp su hào hấu Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, khơng khí với độ ẩm cao đ iều kiện thuận lợi cho lồi sâu hại nơng - lâm nghiệp phát triển Khi muốn bảo vệ suất trồng, theo thói quen, người nơng dân thường sử dụng thuốc hoá học với nồng độ cao để phun sau dịch sâu hại bùng phát Đối với lâm nghiệp, dịch xuất vườn ươm, cánh rừng trồng số lượng hố chất phải dùng lớn Trung bình trồng phải phun từ – kg thuốc Điều thực vấn đề nghiêm trọng địi hỏi nhà khoa học nói chung nhà bảo vệ thực vật nói nói riêng cần nghiên cứu xem xét cách đầy đủ, thuốc hoá học dập tắt nạn dịch nhanh dao hai lưỡi, trực tiếp phá huỷ mơi trường sống ở khu sản xuất đó, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ người, làm giảm số lượng lượng sinh vật có lợi cho người chim chóc, tơm, cá, ký sinh thiên địch bọ rùa, ong ký sinh… sinh… Tác hại việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học rõ ràng Trong việc sử dụng thuốc trừ tr sâu sinh học có nguồn ng uồn gốc từ vi khuẩn, vi nấm, virus, virus , côn trùng, thảo mộc chứng minh an toàn người gia súc, không gây ô nhiễm môi trường, không giết chết thiên địch sâu hại sinh vật có ích, trì cân sinh thái, không ảnh hưởng đến chất lượng nông, lâm sản sản Trong đó, thuốc trừ sâu sinh học, kể thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis (được tiêu thụ nhiều số loại thuốc trừ sâu sinh học) chưa phổ biến biến Nguyên nhân thói quen sử dụng thuốc trừ sâu hoá học ăn sâu vào tiềm thức thức người nông dân dân nước ta; ta; thuốc trừ sâu sinh học sản suất nước có hiệu lực chưa cao, tính ổn định cịn thấp; thấp; thuốc trừ sâu sinh học nhập ngoại có giá thành cao; việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học vừa tiết kiệm chi phí, vừa đạt hiệu tiêu diệt sâu nhanh hơn… hơn… Bởi lý nên thuốc trừ sâu sinh học khơng phải lựa chọn hàng đầu người nông dân muốn dập tắt nạn dịch sâu hại Để đạt lợi ích kinh tế trước mắt, người nơng dân thường sử dụng thuốc trừ sâu hoá học Do vậy, để góp phần đưa thuốc trừ sâu sinh học nói chung thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ từ vi khuẩn khuẩn Bt nói riêng đến với người nơng dân, việc phổ biến nâng cao tầm nhận thức người dân thuốc trừ sâu sinh học kết hợp với việc nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất nhiều loại thuốc trừ sâu sinh học hoạt lực cao, giá thành hạ quan trọng Trong công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, yếu tố giống vi sinh vật giữ vai trò định suất, chất lượng, sản lượng giá thành sản sản phẩm phẩm nên công tác phân lập, tuyển chọn bảo quản chủng giống có ý nghĩa quan trọng Vì vậy, cần tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, ứng dụng, phân loại, nâng cao độc tính diệt sâu thúc đẩy sử dụng thuốc trừ sâu Bt trong nông – nông – lâm nghiệp nghiệp Để tiếp tục hướng nghiên cứu phân lập lựa chọn chủng Bacillus thuringiensis có độc lực cao, ứng dụng có hiệu vào thực tiễn, tơi tơi tiến hành khoá luận luận “ Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực cao với côn trùng hại trồng ” CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Lịch sử nghiên cứ u ứ ng ng dụng Bacillus thuringiensis Lịch sử nghiên cứu cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) ra đờ i phát triể triển vớ vớ i phát triể triển khoa họ học kỹ thu thuậật nhân loại, loại, Bt đượ c nghiên cứu ứng dụ dụng nhiều nhiều lĩnh vực vực khác [21],[2]. Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh vậ vật học học ngườ i Nhậ Nhật - ộc điều điều tra nghiên thự thực hi hiệện cu cứu nguyên nhân gây bệ b ệnh Sotto gây chế chết độtt ngộ độ ngột, giế giết chế chết nhiề nhiều qu quầần thể thể tằm, phân lập đượ c loạ loại vi khuẩ khuẩn (chính Bacillus thuringiensis) nguyên nhân gây bệnh, b ệnh, ông đặt đặt tên loạ loại vi khuẩn khuẩn là Bacillus sotto Đây lần ngườ i phát hiệ vi khuẩ khuẩn Bt Đến năm 1911, Er nst nst Berliner - nhà sinh vậ vật học học người Đức Đức - phân lập lập đượ c vi khuẩ khuẩn giế gi ết hạ h ại mố mối Mediterranean flour Ông phát hiện ẩn mà Ishiwatari Shigetane công bố, đặt đặt tên lạ loài vi khu khuẩn lại cho loài vi địa danh Thurigia khuẩẩn Bacillus thurigiensis (hay Bt), xu khu xuấất phát từ từ địa thị thị trấ trấn nhỏ nhỏ ở Đức, nơi phát hiện mối mối đó. đó. Năm 1915, Ernst Berliner tiếp tiếp tục đưa báo cáo loại độc tố có loại độc chất chất protein đượ c Bt sản sản sinh thể, theo ông ngun nhân khiế khiến mố mối bị bị giế giết hạ hại Tuy nhiên, tác dụng dụng chế ho hoạạt động độ ng củ loạ loại protein vẫn chưa đượ c khám phá Năm 1920, ngườ i nông dân ở các ở trang trạ trại lớ l ớ n nướ c phát đầu sử dụng sinh khố loạ triể triển bắt đầu khối vi khuẩ khuẩn Bt phun cho trồng trồng loại thuốốc phòng trừ thu trừ sâu bệnh bệnh Đặc Đặc biệt biệt nước Pháp, sớ m bắt b đầu đầu ch chếế tạo loạ loại thuố thuốc có nguồ nguồn gố gốc từ từ bào tử tử xác củ Bt, gọ gọi Sporine Năm 1956, Hannay, FitzFitz -James Angus nghiên cứu cứu phát hiệ ra tác nhân quyết định định khả khả tiêu diệt diệt mố mối sâu bọ bọ Bt phân tử protein protein đượ c sản sinh thể vi khuẩ khuẩn Bt, từ từ mở hướ ng ng nghiên cứu mớ mớ i củ nhà khoa họ h ọc về tác nhân, chế diệ diệt sâu di truyề truyền củ Bt đầu Từ năm 1958, chế ph phẩẩm thuố thuốc trừ trừ sâu có nguồ nguồn gốc từ Bt bắt đầu đượ c sử dụng rộng rãi ở M ở Mỹ, Anh, Đức… Tới năm 1961, Bt đánh giá loạ loại thuố thuốc trừ trừ sâu thân thiệ thiện với với người môi trườ ng ng chiến chiến lượ c phát tri triểển nông nghiệ nghiệp tổ ch chứức bảo vệ môi trườ ng ng EPA (Environmental Protection Agency) ccủủa Mỹ Năm 1977, có 13 loài vi khuẩn Bt đượ c phát hi hiệện công bố bố Các nghiên cứu khám phá về ph phổổ kháng củ Bt cho thấ thấy Bt không chỉ gây độc độc nhấ vớ i giai đoạn đoạn nh ất định định ấu trùng độc bộ cánh vảy, vảy, mà gây độc vớ i ấu trùng củ bộ cánh cứng thức ngườ i vớ i vấn đề đề môi trườ ng Từ năm 1980 trở đi, ý thức ng sống tăng cao, khả khả năng kháng độc độc củ sâu bệ bệnh vớ vớ i loạ loại thuố thuốc hoá họ học kể kể loạ loại cực độc DDT 666 … ngày gia tăng Đồng Đồng thời, thời, ngườ i phát lượ ng hoá chấ ng tồn tồn dư chất phòng trừ trừ sâu hại hại đượ c tích luỹ luỹ gia tăng dần môi trườ ng ng số sống gây ảnh hưở ng ng nghiêm trọ trọng tớ tớ i hệ hệ sinh thái sứ sức khoẻ khoẻ người Để giả giải quyế nh nhữững vấn đề đề đó, chế ph phẩẩm thuốốc trừ thu trừ sâu có nguồ nguồn gố gốc từ từ Bt ngày đượ c sử sử dụng rộ rộng rãi bở bở i tinh thể thể độc Bt tiế độc tiết có bả chấ chất mộ loạ loại protein, dễ dễ dàng bị bị phân huỷ huỷ nhanh chóng mơi trườ ng, đến sứ ng, không ảnh hưởng đến sức khoẻ khoẻ con ngườ i,i, vậ vật nuôi Ngày nay, nhà khoa học học phát 1000 biế biến dạng độc tố thể Bt Bên cạnh độc cạnh đó, phát triể triển nhanh chóng củ sinh họ học phân tử tử giúp nhà khoa họ học ứng dụ dụng công nghệ nghệ GMO (Genetically Modifie Organisms) chuyển chuyển gen điều điều khiể khiển sản sinh độc độc tố Bt vào thể thể trồ trồng, giúp trồ trồng chuyể chuyển gen thể tiết tiết độc độc tố t ố diệt diệt sâu ăn hoặc đục thân Ngô lúa hai giố đục gi ống trồng trồng đượ c chuyể chuyển gen Bt tổ tổ chứức EPA ccủủa Mỹ thự ch thực hiện năm 1995 Cho tớ i hiệ nay, công nghệ ngh ệ GMO chuyển chuy ển gen kháng sâu ứng ứng dụng thành công cho nhiề nhiều loạ loại trồ trồng khác như: Khoai tây, bông, khoai lang, đậu như: đậu [8],[2] 1.2 Đại cƣơng vi khuẩn Bacillus thurigiensis 1 .2.1 Đặc điểm hình thái Bacillus thurigiensis thurigiensis Bacillus thurigiensis vi khuẩn đất, gram (+), hơ hấp hiếu khí hiếu khí khơng bắt buộc Tế bào hình que, kích thước khoảng - 6µm, có tiêm 10 Cơng thức đối chứng dương chế phẩm thuốc trừ sâu Bt nhãn hiệu Anhuy Trung quốc sản xuất Chế phẩm chứa chủng Bt thuộc thứ kurstaki sinh tinh thể độc độc hình trám mặt, dạng bột hồ tan với nước cất vô trùng tạo thành dạng lỏng, đảm bảo số lượng bào tử khoảng 10 9 bào tử/ml. bào tử/ml. Kết xác định hoạt lực diệt sâu thời điểm sau 24h, 48h 72h (tính theo cơng thức Abbott), Abbott), ( xem Bảng 3.6 3.6 xem Hình 3.3). Bảng 3.6: Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá dƣa chuột dƣa hấu chết chế phẩm Bt Bt TT Kí hiệu chủng chủng Tỉ lệ (%) sâu chết sau thời gian ĐC BtAn huy BtK 24h 50 40 10 11 12 BtT H1.2 H1.5 T5.1 T5.2 G6.1 G6.2 MS8.1 MS11.1 30 20 60 40 30 20 30 10 20 40 30 80 60 40 40 50 30 30 60 50 100 80 60 80 50 40 80 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 MS15.3 MS 16.2 MS16.3 MS17.1 MS19.2 MS21.1 MS23 MS26.1 MS27.1 MS27.4 30 40 10 30 20 40 20 20 30 40 60 60 30 50 50 90 50 30 50 70 70 80 50 70 60 90 60 60 90 90 50 48h 100 50 72h 100 50 Xem kết bảng tôi tôi thấy thấy:: Công thức đối chứng âm (nhúng dưa với mơi trường lên men vơ trùng) có tỉ lệ sâu chết 0% sau ngày thí nghiệm Công thúc đối chứng dương (BtAnhuy) sử dụng chế phẩm phẩ m Bt thương mại quốc hiệu lực diệt sâu Trung quốc sâu dưa chuột dưa hấu hấu rất cao Sau 48h tất sâu thí nghiệm đều đều chết (100%) Trong số 20 chủng Bt sinh nhiều bào tử/tinh thể độc phân lập, đáng ý hiệu diệt sâu sâu ăn dưa chuột dưa hấu hấu của chủng sau: sau: - Chủng H1.5 có hiệu diệt sâu ăn dưa chuột dưa hấu cao tương tương đương hiệu diệt sâu ăn lá lá dưa chuột dưa hấu hấu của chủng Bt thương mại Trung quốc quốc Sau 24h (60%), sau 48h (80%) sâu cơng thức thí nghiệm chết, chết, chết sau 72h (100%) sâu thí nghiệm chết sâu ăn lá lá dưa chuột dưa - Chủng MS21.1; MS27.4 ; MS27.1 có hiệu diệt sâu hấu cao gần bằng bằng hiệu diệt sâu sâu ăn lá lá dưa chuột dưa hấu hấu chủng Bt thương mại Trung quốc. quốc. Hiệu diệt sâu sâu ăn lá lá dưa chuột dưa hấu 3 3 chủng như sau : Sau 24h - MS21.1 (40%), MS27.4 (40%), MS27.1( 30%); sau 48h chủng MS21.1 (90%), MS27.4 (70%), MS27.1(50%); sau 48h - MS21.1 (90%), MS27.4 (90%), MS27.1( 90%) sâu ăn lá lá dưa chuột dưa hấu 80% sau 72h thí - chủng có hiệu diệt sâu nghiệm T5.1, MS11.1, MS16.2, G6.1 Các chủng Bt cịn lại có hiệu hiệu diệt sâu thấp hơn. hơn. Khi xem xét kích cỡ sâu lượng dưa tiêu thụ lơ thí nghiệm chúng tơi nhận thấy: Do sâu ăn dưu hấu dưa chuột ngày ăn hết lượng dưa đáng kể, tương ứng với lượng dưa sâu ăn, dễ dàng quan sát thấy kích cỡ sâu to lên sau ngày Do vậy, lượng dưa tiếp cho sâu ăn trước thí nghiệm đầy đĩa petri cũng chỉ đủ cho sâu ăn ă n 24h , sau lơ thí nghiệm sâu ăn hết thức ăn phải nhúng thêm dưa tươi với dịch khuẩn tương ứng với lơ thí nghiệm để tiếp thêm cho sâu sâu Ở lô đối chứng âm, lượng tiêu thụ hết sau ngày Do vậy, cứ sau khoảng 18h - 24h lại thực nhúng dưa tươi với môi trường lên men vô trùng để tiếp thêm thức ăn cho sâu Sâu sinh trưởng phát triển bình thường nên có lớn lên kích cỡ trọng lượng. lượng. Ở cơng thức thí nghiệm bố trí với chủng Bt có hiệu diệt sâu thấp (như MS23, MS26.1, MS19.3 ), phải tiếp thêm thức ăn 51 nhúng dịch khuẩn cho sâu, nhiên lượng thức ăn cần tiếp thêm khơng nhiều lơ đối chứng âm âm kích cỡ, trọng lượng sâu cịn sống sót tăngg lên. tăn Lơ thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu chủng BtAnhuy, H1.5 , MS21.1, MS27.4 , MS27.1 , T5.1, MS11.1, MS16.2, G6.1 Sau 24h thí nghiệm, lượng thức ăn dành cho sâu giảm đáng kể, phải tiếp thêm thức ăn cho sâu (tuy không cần lượng nhiều bằng bằng lô đối chứng âm lô thí nghiệm khác) Tuy nhiên, từ 24h trở đi, số lượng sâu cịn sống sót khơng nhiều, sâu cịn sống sót yếu nên lượng lá dưa đĩa không tiêu thụ thêm Sâu lượng lơ thí nghiệm khơng tăng lên kích cỡ trọng lượng. lượng. Tương tự, lơ thí nghiệm khác có tiêu thụ lượng dưa nhiều khác tương ứng với hiệu diệt sâu chủng Bt tương ứng với lơ thí nghiệm Hiệu diệt sâu thấp, lượng dưa sâu tiêu thụ nhiều Hiệu diệt sâu cao lượng dưa cần tiếp cho sâu ăn hơn. A B Hình 3.3: Hình ảnh hiệu diệt sâu ăn lá dƣa chuột dƣa hấu A : Hình ảnh hiệu diệt sâu ăn dưa chuột dưa hấu 3.3- A chủng H 1.5 1.5 3.3- B: B: Hình ảnh mẫu đối chứng chứng âm 3.3.3.2 Sâu ăn cải bắp su hào Sâu ăn cải bắp su hào Plutella xylostella Linnaeus phát triển mạnh vào vụ Đông – Xuân – Xuân Bướm dài từ - 10 mm, sải cánh rộng từ 10 - 15 mm Cánh trước màu nâu, lưng lưng có dải dải gợn sóng, sóng, màu trắng bướm đực màu 52 vàng bướm cái, chạy dài đến cuối cánh Bướm sống đến tuần đẻ độ 200 trứng. trứng. Ấu trùng màu xanh lục, nở to giữa, đầu nhọn, thân chia đốt rõ ràng có cặp chân giả từ đốt bụng thứ năm, lớn đủ sức sâu dài từ đến 11mm Sâu có tuổi với thời gian phát triển lâu độ - 10 ngày Thời gian làm nhộng lâu - ngày Khi hình thành nhộng có màu xanh nhạt, khoảng ngày sau thành màu vàng nhạt, chiều dài nhộng từ - 7mm, chung quanh nhộng có kén kén tơ bao phủ Thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu bố trí đĩa Petri giống với sâu ăn lá lá dưa hấu dưa chuột, đĩa 10 sâu (tương đối đồng kích thước) Công thức đối chứng âm môi trường lên men vô trùng Công thức đối chứng dương chế phẩm thuốc trừ sâu Bt nhãn hiệu Anhuy Trung quốc sản xuất Kết xác định hoạt lực diệt sâu thời điểm sau 24h, 48h 72h (tính theo cơng thức Abbott), Abbott), (xem Bảng Bảng 3.7 xem Hình 3.4). Bảng 3.7: Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá cải bắp su hào chết chế phẩm Bt Bt TT Kí hiệu chủng chủng Tỉ lệ (%) sâu chết sau thời gian ĐC BtAn huy BtK BtT H1.2 H1.5 24h 60 10 40 20 50 48h 100 50 40 20 90 72h 100 60 70 50 100 T5.1 T 5.2 G6.1 30 50 20 60 60 40 70 80 90 53 10 11 12 13 14 15 G6.2 MS8.1 MS11.1 MS15.3 MS16.2 MS16.3 20 20 40 30 40 20 30 30 60 60 50 30 30 50 80 40 90 70 16 17 18 19 20 21 22 MS17.1 MS19.2 MS21.1 MS23 MS26.1 MS27.1 MS27.4 20 20 40 20 20 40 50 50 50 80 60 40 70 90 60 50 90 60 50 90 100 Xem kết bảng tôi tôi thấy: thấy: Công thức đối chứng âm (nhúng dưa với mơi trường lên men vơ trùng) có tỉ lệ sâu chết 0% sau ngày thí nghiệm Công thúc đối chứng dương (Bt Anhuy) sử dụng chế phẩm phẩ m Bt thương mại Trungg quốc hiệu lực diệt sâu Trun sâu ăn lá lá Cải bắp Su hào hào rất cao Sau 48h (100%) sâu thí nghiệm đều đều chết chết Trong số 20 chủng Bt sinh nhiều bào tử/tinh thể độc phân lập, đáng ý hiệu diệt sâu sâu ăn cải bắp su hào hào của chủng sau: sau: 1.5, MS27.4 có hiệu diệt sâu Chủng H ăn cải bắp hào cao tương đương hiệu diệt sâu sâu ăn cải bắp susâuhào chủng Btsuthương mại Trung quốc. quốc. Hiệu diệt sâu sâu ăn lá lá cải bắp su hào 3 3 chủng chủng sau: Sau 24h - H1.5(50%), MS27.4(50%); sau 48h - H1.5(90%), MS27.4(90%); sau 72h – ( 100%) sâu thí nghiệm chết. chết. Chủng MS27.1, G6.1 , MS 16.2, MS21.1 có hiệu diệt sâu sâu ăn cải bắp su hào cao gần chủng Bt thương mại Trung quốc chủng H1.5 ,MS27.4 Hiệu diệt sâu sâu ăn cải bắp su hào 4 4 chủng chủng sau: sau: Sau 24h MS27.1(40%), G6.1 (20%), MS16.2 (40%), MS21.1(40%) ; sau 48h - MS27.1(70%), G6.1 (40%), MS16.2 (50%), MS21.1(80%); Sau 72h - MS27.1(90%), G6.1 (90%), MS16.2 (90%), MS21.1(90%) - chủng có hiệu quả quả diệt sâu 80% sau 72h thí nghiệm MS11.1, T5.2 54 Các chủng Bt cịn lại có hiệu diệt sâu thấp hơn. hơn. Khi xem xét kích cỡ sâu lượng cải bắp bắp tiêu thụ lô thí nghiệm chúng tơi nhận thấy: Sâu ăn lá lá cải bắp va su hào hào ngày ngày lượng sâu ăn ăn giảm nửa, tương ứng với lượng cải bắp bắp sâu ăn, ta thấy kích thước sâu tăng chậm Do vậy, lượng tiếp cho sâu ăn trước thí nghiệm đầy đĩa petr i petr i đủ cho sâu ăn 24h 24h – 36h – 36h , sau lơ thí nghiệm sâu ăn hết thức ăn sẽ phải nhúng thêm cải bắp bắp tươi với dịch khuẩn tương ứng với lơ thí nghiệm để tiếp thêm cho sâu Ở lô đối chứng âm, lượng tiêu thụ hết sau 36h 36h Do vậy, sau khoảng 24h lại thực nhúng cải bắp bắp tươi với môi trường lên men men vô trùng để tiếp thêm thức ăn cho sâu Sâu sinh trưởng phát triển bình thường nên có lớn lên kích cỡ trọng lượng. lượng. Ở cơng thức thí nghiệm bố trí với chủng Bt có hiệu diệt sâu thấp (như MS19.2, MS26.1, MS23 ),chúng phải tiếp thêm thức ăn nhúng dịch khuẩn cho sâu, nhiên lượng thức ăn cần tiếp thêm không nhiều lô đối chứng âm kích cỡ, trọng lượng sâu cịn sống sót tăng lên Lơ thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu chủng BtAnhuy, H1.5 , MS27.4 , MS21.1 , MS27.1, G6.1 Sau 24h thí nghiệm, lượng thức ăn dành cho sâu giảm đáng kể, phải tiếp thêm thức ăn cho sâu (tuy không cần lượng nhiều lô đối chứng âm lơ thí nghiệm khác) Tuy nhiên, từ 24 24hh trở đi, số lượng sâu cịn sống sót khơng nhiều, nhiều, những sâu cịn sống sót yếu nên lượng đĩa không tiêu thụ thêm Sâu lơ thí nghiệm khơng tăng lên kích cỡ trọng lượng. lượng. Tương tự, lơ thí nghiệm khác có tiêu thụ lượng nhiều khác nh au tương ứng với hiệu diệt sâu chủng Bt tương ứng với lơ thí nghiệm Hiệu diệt sâu thấp, lượng cải bắp bắp sâu tiêu thụ nhiều Hiệu diệt sâu cao lượng cần tiếp cho sâu ăn hơn. Từ số liệu thống kê phần trăm hoạt lực diệt sâu sâu ăn lá lá cải bắp su hào ta thấy sâu sâu ăn lá lá hại cải bắp su hào loài ký chủ đặc hiệu vi khuẩn Bt Kết thử hoạt tính với hoạt lực diệt sâu cải bắp su hào chủng không thay đổi nhiều so với kết thử hoạt tính 55 sâu sâu ăn lá lá dưa chuột dưa hấu Điều chứng tỏ kết thử hoạt tính tương đối xác, từ ta thấy chủng vi khuẩn Bt phân lập có hoạt lực cao chọn chủng tốt cần lưu giữ nghiên cứu sâu loài, loài, chi hoạt lực chúng loại trùng khác, tìm cách nâng cao hoạt lực chủng B A diệt sâu ăn lá cải bắp su hào Hình 3.4 : Hình ảnh hiệu diệt 3.4- A: A: Hình ảnh diệt sâu ăn lá cải bắp su hào chủng MS 27.4 27.4 B: Hình ảnh mẫu đối chứng chứng âm 3.4- B: 3.3 Kết quả bảo quản chủng vi khuẩn Bt phân lập Các chủng vi khuẩn Bt Bt phân phân lập khiết để ống nghiệm tủ lạnh C, sau tiến hành lên men thử hoạt tính để tìm chủng có hoạt lực cao Tơi Tôi tiến hành bảo quản chủng phương pháp cấy chuyển đông lạnh, nhằm lưu giữ cho nghiên cứu lâu dài dài Đối với chủng thử hoạt tính tính có hoạt lực thấp, hoạt lực tương đối chủng chưa thử hoạt tính( MS10.3, MS12.1, MS12.3 ), tơi tiến hành bảo quản đông lạnh bằng glycerol ở - 850C Đối với chủng thử hoạt tính xác định có hoạt lực diệt sâu 90% - 100% ( H1.5 , MS27.4 , MS21.1 , MS27.1, MS11.1,T5.2,G6.1 ……), để tiện cho việc nghiên cứu tiến hành lưu giữ điều kiện - 850C, - 200C 40C Sau tiến hành bảo quản 15 ngày, lấy 56 chủng bảo quản đem nuôi môi trường nhân giống thấy chủng phát triênt bình thường, chứng tỏ việc bảo quản thành công. công. Kết bảo quản chủng vi khuẩn Bt phân lập Trung tâm Giống & CNSH – CNSH – Trường ĐHLN (xem Bảng 3.8) Bảng 3.8 : Kết bảo quản chủng vi khuẩn Bt phân lập TT Kí hiệu chủng chủng Số lƣợng mẫu BtK Ở 850C Ở Ở 200C Ở 0 Ở 40C Ở 4 0 BtT 2 0 0 BtĐ 2 0 0 H1.1 2 0 0 2 0 0 H1.2 H1.3 2 0 0 H1.4 2 0 0 H1.5 2 0 2 T5.1 2 0 2 10 T5.2 2 0 2 11 G6.1 2 0 2 G6.2 12 13 MS2 2 2 0 0 0 0 14 MS8.1 2 0 0 15 MS8.2 2 0 0 16 MS9.1 2 0 0 17 MS9.2 2 0 0 18 MS9.3 2 0 0 19 MS10.2 2 0 0 20 21 MS10.3 MS10.4 2 2 0 0 0 0 57 22 MS10.5 2 0 0 23 MS11.1 2 0 2 24 MS11.2 2 0 0 25 MS12.1 2 0 0 26 MS12.3 2 0 0 27 MS13.1 2 0 0 28 MS13.3 2 0 0 29 MS14.1 2 0 0 30 MS14.2 2 0 0 31 MS14.3 2 0 0 32 MS14.4 2 0 0 33 MS15.1 2 0 0 34 35 MS15.2 MS15.3 2 2 0 0 0 0 36 MS16.1 2 0 0 37 MS16.2 2 0 38 MS16.3 2 0 0 39 MS16.4 2 0 0 40 MS17.1 2 0 0 41 MS17.2 2 0 0 42 2 0 0 43 MS18.1 MS18.3 2 0 0 44 MS19.1 2 0 0 45 MS19.2 2 0 0 46 MS20 2 0 0 47 MS21.1 2 0 2 48 MS21.2 2 0 0 2 2 0 0 0 0 MS22.1 49 50 MS22.2 58 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 MS23 MS24.1 MS24.2 MS24.3 MS25.1 MS25.2 MS26.1 MS26.2 MS27.1 MS27.2 MS27.3 MS27.4 MS27.5 MS28 MS29.1 MS29.2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 59 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2 0 0 0 0 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dựa vào kết thu từ thí nghiệm, chúng tơi rút số kết luận sau: - Đã phân lập 66 chủng vi khuẩn Bt Trong đó: đó: được 3 chủng chủng vi khuẩn Bt + Từ mẫu côn trùng, phân lập được + Từ 32 mẫu đất, phân lập 63 chủng chủng vi khuẩn Bt - Đã xác định đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc 66 chủng vi khuẩn Bt - Đã xác định hình dạng tế bào, bào tử tinh thể độc 66 chủng vi khuẩn Bt - Đã xác định hoạt lực diệt sâu chủng vi khuẩn Bt sản sinh nhiều bào tử tinh thể độc số số 66 chủng phân lập. lập. + Đối với sâu ăn lá lá dưa chuột dưa hấu, số 20 chủng Bt đã xác định được:: * Có 1/20 chủng có hoạt lực diệt sâu mạnh, mạnh , chủng H1.5 có hoạt lực diệt sâu sâu cao (tỉ lệ sâu chết) 100% sau 72h sâu đạt 80% - 90% sau 72h; * Có 7/20 chủng có hoạt lực diệt sâu chủng T5.1, MS16.2 , MS27.1, MS11.1, G6.1, MS21.1, MS27.4 + Đối với sâu ăn cải bắp su hào, số 20 chủng Bt xác định : : * Có 2/20 chủng có hoạt lực diệt sâu mạnh, chủng H 1.5, MS27.4 có hoạt lực diệt sâu sâu cao (tỉ lệ sâu chết) 100% sau 72h. 72h. * Có 6/20 chủng có hoạt lực diệt sâu đạt 80% - 90% sau 72h; chủng MS16.2 , MS27.1, MS11.1,T5.2,G6.1, MS21.1, MS11.1 - Đã bảo quản 66 chủng vi khuẩn Bt phân lập Trung tâm Giống & CNSH – CNSH – Trường ĐHLN. ĐHLN. Tồn Do thời gian thực khoá luận, luận , trang thiết bị, bị, số lượng sâu thí nghiệm nghiệm có hạn, trình trình độ thân thân nên: 60 - Chưa xác định xác chủng vi khuẩn Bt phân lập thuộc lồi, chi chúng có bị trùng lặp hay khơng. khơng - Chưa xác định xác tiềm chủng vi khuẩn Bt phân lập tơi sử dụng mơi trường ni cấy chung cho vi khuẩn Bt - Chưa xác định xác hình dạng tinh thể độc chủng vi khuẩn Bt đã đã phân phân lập. lập. lập. - Chưa thử hoạt lực diệt sâu 66 chủng Bt phân lập. - Chưa thử hoạt lực diệt diệt sâu với với số loại sâu hại nông - lâm nghiệp khác khác Kiến nghị - Tiếp tục phân lập thêm vi khuẩn Bt địa điểm khác quanh khu vực Trường ĐHLN (đây địa điểm có tiềm xuất Bt với tần suất cao có hoạt lực diệt sâu mạnh). mạnh). - Thử hoạt lực diệt số loài sâu khác (ngoài sâu dưa) của tất cả cả chủng Bt phân lâp lâp - Tiếp tục nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn Bt xác định có hoạt lực mạnh ( H1.5, MS21.1,và MS27.4) thuộc loài, chi nào, chúng có bị trùng lặp hay khơng tìm cách nâng cao hoạt lực diệt sâu chúng Tìm mơi trường nuôi cấy phù hợp chủng, để chúng có khả phát triển sinh tinh thể độc tốt nhất. nhất. 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thị Thu Hiền, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình, Nơng Văn Hải( 1998), “ Gen kháng côn trùng ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật “ Kỉ yếu viên công nghệ sinh học. học. Lưu Đình Thúy (2005), Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bacillus thruringiensis ứng dụng phịng trừ sâu hại hại ( Khóa luận tơt nghiệp ). ). Ngơ Đình Bính Bính ( 2005), “ Thuốc trừ sâu vi sinh” Nhà xuất Đại Học Quốc 3. Ngô Gia Hà Nội, tr 10 – 43 – 43 Nguyễn Thị Chính, Nguyễn Đình Quyến(1998), “Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu Bt ứng dụng phòng trừ sâu hại ”, Báo cáo nghiệm thu nhánh đề tài thuộc dự án hợp tác Việt Nam – CHLB Đức VNM 9510-017 9510-017 Nguyễn Lân Dũng,( 1981) Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng, nhà xuất KHKT. KHKT. Ngơ Đình Quang Đính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Hoài Trâm, Trịnh Thế Cường( 2000), “Nghiên cứu phân bố đa dạng sinh học Bacillus thurigiensis phân phân lập số s ố tỉnh ở Việt Nam”, Những vấn đề nghiên cứu công nghệ sinh học, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội, tr 484 – 488 – 488 Nguyễn Thị Thanh Vân (1996), Nghiên cứu điều kiện kiện đơn giản nhân giống Bacillus thurigiensis, lựa chọn phương pháp sản xuất giống để cung cấp cho vùng trồng rau sạch.( Luận văn thạc sĩ sinh học). học). Phạm Thị Thuỳ (2004) Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật, NXB Đại học quốc gia Hà Nội, tr 235 - 243 Tài liệu tiếng Anh “Control of Lepidoteran pets with Bacillus thurigiensis ", Amos Navon(1993), “Control Bacillus thurigiensis an environment biopestiside theory and practide, tr 126 – 126 – 146 62 “Insecticidal activity of Bacillus 10 Chilcot C.N and P J Wigley (1994), “Insecticidal thurigiensis crystal protein", Proceeding of the 2nd Canberra meeting on Bacillus thurigiensis, tr 43 – 43 – 52 52 11 Choma C T W K surewicz, P R Carey, M Pozsgay, T Raynor and H Kaplan (1990), Unusual proteolysis of the protoxin and toxin Bacillus thurigiensis”, Eur.J Biochem189: tr 523 – 527 – 527 12 Deluca A.J, Simonson J.G and larson A D(1981), “ Bacillus thurigiensis 12 distribution on soil of the United States”, Microbiol, 27: tr 865 – – 870 870 “Insecticidal crystal protein of Bacillus Bacillus 13 Hofte H and H R Whitelog (1989) “Insecticidal thurigiensis", Microbiol Rev 53: tr 242 – 242 – 255 255 14 Iizuka T(1999), “Historical 14 “Historical review on Bacillus thurigiensis", Biotechnology of Bacillus Bacillus thurigiensis , Eds : Yuzinin, Sun Ming and Liu Ziduo, Vol 3: tr 35 15 Laurent P H, Ripauteau H, Dumamoir V.C, Frachon E, Lecadet M-M(1996), “ A micromethod for serotyring Bacillus thurigiensis”, Microbiol.22: tr 259-261 259-261 16 Pries F G(1992), “ Biological control of Mosquitoes and other bitting flies 16 by Bacillus thurigiensis and B sphaericus”, Journal of Applied Bacteriology,72: tr 357- 369 “Recent advences in structure 17 Powel, C.A Charlton Charlton and T Yanamoto(1994), “Recent and fuction reseach on Bacillus thurigiensis crystal protein”, Bacillus thurigiensis biotechnology and environmental benefits, Vol 1: tr 1-20 18 Sakhi V F P Parenti, G.M.Hanazet, B.Giordara, P Lluthy(1986), “ Bacillus thurigiensis toxin inhibits K+ - gradient dependent amino acid transport across the brush border membrane of pieris brassicae midgut cell”, M Microbiol icrobiol Rev.53: tr 213 – 213 – 218 218 19 Thiery and E Frachon( 1997), “ Indentification, isolation culture and preservation enbromo pathogenic Biologocal techniques manual of technology in Insect pathology”, A academicpress, tr 55 – 56 – 56 63 Các trang web 20. http\\:www.agbiotech.com.vn 21 http\\:www.ebook.edu h ttp\\:www.ebook.edu.vn 22 http\\:www.thiennhien.net http\\:www.thiennhien.net 64 ... nông – ? ?lâm nghiệp nghiệp Để tiếp tục hướng nghiên cứu phân lập lựa chọn chủng ? ?Bacillus thuringiensis? ?có độc lực cao, ứng dụng có hiệu vào thực tiễn, tơi tơi tiến hành khoá luận luận “? ?Phân lập tuyển. .. xác khác chủng Bt phân lập có trùng lặp khơng tương đối. Khóa luận tập trung đối trung vào phân lập chủng vi khuẩn Bt có hoạt lực cao việc tiêu diệt côn trùng gây hại trồng. trồng. 25 ... Phân lập chủng Bt từ đất, côn trùng. trùng. + Xác định số đặc điểm chủng Bt phân lập lập:: hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, tế bào bào,, bào tử, tinh thể độc độc + Thử hoạt lực diệt sâu hại trồng