PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI SINH VẬT SINH ENZYME BẺ NGẮN MẠCH POLYSACCHARIDE TỪ BÙN THẢI CỦA PILOT SẢN XUẤT FUCOIDAN LUẬN VĂN VIỆN CÔNG NGHỆ

   LỜI CẢM CẢM ƠN  Trước hết xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Thanh VânTrưởng phịng hóa phân tích triển khai cơng nghệ, Viện Nghiên cứu Ứng dụng  Công nghệ nghệ Nha Trang Trang TS Phạm Thu Thủ Thủyy tận tâm hướng dẫn, giú giúpp đỡ suốt thời gian thực đồ án Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tồn thể ban lãnh đạo, cán Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tạo điều kiện hỗ trợ giúp đỡ tơi để tơi có đủ điều kiện thực đồ án Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang,  Ban Giám Giám đốc Viện Công ngh nghệệ Sinh học Môi trường, phòn phòngg đào tạo Đại học  sau Đại học thầy cô Trường đại học Nha Trang Trang tận tình dạy hướng dẫn suốt trình học làm đồ án Cuối tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè quan tâm, chia sẻ khó khăn, động viên để tơi hồn thành đồ án  Nguyễn  Nguy ễn Thị Thị Khá Khánh nh Vy Vy   NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN   NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN   MỤC LỤC Trang   DANH MỤC BẢNG   DANH MỤC HÌNH   DANH MỤC SƠ ĐỒ   BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid FDA Food and Drug Administration Fuc Gal Fucose Galactose HCMV Human cytomegalo virus HGF Human Hepatocyte Growth Factor   HIV Human immunodeficiency immunodefic iency virus Man Mannose OD Op Opttic ical al Den enssity (M (Mật ật độ quang uang)) RNA Ribonucleic acid Xyl Xylose   MỞ ĐẦU Trong thảm thực vật đa dạng vô tận đại dương, rong Nâu số lồi thực vật biển có khả tự tái tạo đáng lưu ý Rong Nâu chứa nhiều hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng dược dụng cao Đó chất dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose,…); 17 acid amin; acid béo khơng no; chất khống; keo vitamin cần thiết cho thể sống;  polyphenol  polyp henol có khả nă ng chố chống ng ox oxyy hóa mạ mạnh nh mẽ bả bảoo vệ thể loại loại trừ các gốc tự ddoo nguy hiểm; iốt hữu giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu;alginat chất giải độc thiên nhiên; polyuronan có hoạt tính kháng u não[48]; laminaran có tác dụng tích cực việc hỗ trợ điều trị bệnh có liên quan đến mạch máu tim, chất kháng ung thư, chất bảo vệ phóng xạ, kháng đơng lạnh, chất kích thích hạt giống nảy mầm, tăng trưởng trồng [3]và fucoidan có khả kích thích hệ miễn dịch, chống viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư Trong rong Nâu, hàm lượng polysaccharid chiếm khoảng từ 40-80% khối lượng rong khô, chất có giá trị có ứng dụng rộng rãi nhờ đặc điểm cấu trúc tính chất đặc thù chúng Theo nhà khoa học Nga,  polysacch  polys accharide aride tồn rong nâu chia làm nhóm chính: nhóm tan kiềm acid alginic, nghiên cứu từ năm 30 kỷ trước sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh l ĩnh vực công nghiệp, thực phẩm, dược phẩm mỹ  phẩm; nhóm tan nước bao gồm fucoid fucoidan, an, lamin laminaran aran polyu polyuronan ronan chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá nghiên cứu sử dụng khoảng vài thập kỷ trở lại Đặc biệt fucoidan tìm thấy vách tế bào rong nâu chất có nhiều hoạt tính sinh học q giá: Hoạt tính chống đơng máu chống đơng tụ (Anticoagulant Antithrombotic), hoạt tính kháng u, tăng cường miễn dịch, hoạt tính kháng virus, trị bệnh dày, bệnh da [5] Ngồi fucoidan cịn sử dụng để điều trị bệnh dị ứng, lão hóa, viêm khớp, suyễn, đái tháo đường, tăng nhãn áp, huyết áp cao, cholesterol cao, bệnh tim, viêm gan C, HIV, bệnh gan, loét dày, đột quỵ, tuyến giáp, thiên đầu thống  Nước ta có bbờờ biển dài hơ hơnn 3.200 200 kkm m trải dài từ Bắc xuống xuống Nam, Nam, bao bao bọc toàn  bộ phía Đơng phía Nam với diện tích mặt nước biển 1.000.00 1.000.0000 km2,   thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong Nâu đa dạng phong phú, rong Mơ (Sargassum (Sargassum)) phát 60 loài với sản lượng khai thác ước tính đạt 10.000 khơ/năm Mặc dù nghiên cứu nước chế biến rong Nâu quan tâm đến việc tách chiết thành phần đơn lẻ alginat, iodine, manitol, kích thích tố sinh trưởng trồng gần laminaran trình độ chưa cao, hiệu kinh tế thấp Thấy tiềm Viện Nghiên Cứu Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang triển khai nghiên cứu sản xuất thành công fucoidan hướng nghiên cứu thiết yếu cho khoa học có giá trị thực tiễn Để giúp cho việc nghiên cứu chế tác dụng polysacchrid rong Nâu lên tế bào sinh vật tiến tới sử dụng chúng để làm dược liệu việc xác định cấu trúc hóa học chúng điều kiện tiên thu hút ý nhà khoa học giới Các phương pháp sử dụng lý hóa trước phân tích sử dụng (thủy phân đề-sulfat hóa, đề actyl hóa) thường địi hỏi điều kiên acid kiềm mạnh nhiệt độ cao, làm thay đổi cấu trúc polysaccharid làm hoạt tính sinh học q chúng [7][8][9][10] Do enzyme công cụ hữu hiệu để thực phân tích Nguồn phân lập vi sinh vật bẻ ngắn mạch polysaccharid nơi có diện nguồn chất rong biển, môi trường xung quanh rong biển sinh sống nước biển, b iển, bùn biển [37] Hiện Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang chiết xuất thành công fucoidan, đưa vào sản xuất quy mô pilot Rong Nâu dùng để chiết xuất fucoidan, phần lại polysaccharid khác alginate, lamninaran, lượng nhỏ fucoidan nằm bả thải, thải xuống hầm cống Bã thải để lâu ngày, bị hệ vi sinh vật hầm phân hủy Đây nguồn phân lập vi sinh vật  bẻ ngắn mạch mạch polysac polysacchari charide de tốt tốt nơi có diện của chất nnơi có khả tồn vi sinh vật tiêu thụ Xuất phát từ lý nêu định chọn đề tài : “Phân lập sàng  lọc vi sinh vật sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharide từ bùn thải pilot sản  xuất Fucoidan Fucoidan” ”  Nội dung dung lluận uận văn văn bao gồm: Hình 3.2: Ảnh hưởng tốc độ nuôi cấy lắc lên khả sinh enzyme chủng SW21 Kết nghiên cứu cho thấy tốc độ khuấy có ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng phát triển chủng SW21 Chủng SW21 phát triển tốt khuấy trộn so với khơng khuấy nhờ khuấy trộn nên vi khuẩn tiếp xúc nhiều với chất dinh dưỡng có mơi trường ni cấy Khuấy trộn cịn giúp cho chất ức chế vi khuẩn sinh khơng bám dính vào vi khuẩn để gây ức chế trở lại Ngoài ra, khuấy trộn có tác dụng tăng hàm lượng oxy hịa tan mơi trường giúp vi khuẩn phát triển tốt hơn.Tuy nhiên tốc độ khuấy trộn cao phát triển triển chủng có phần phần chậm lại tố tốcc độ cao nên hoạt động hấp thu dinh dưỡng, chuyển hóa bị ảnh hưởng Qua thí nghiệm này, chúng tơi thấy chủng SW21 SW21có có khả sinh tổng hợp enzyme tốt tốc độ nuôi cấy lắ lắcc 160 vòng/phút   43 3.3.5 Ảnh hưởng thời gian ni q trình sinh trưởng tổng hợp  fucoidanase  fucoidana se Việc xác định thời gian nuôi cấy loài vi khuẩn quan trọng Nó cho biết khả thích nghi với mơi trường thời gian giai đoạn  phát triển chủng giúp ta kiểm sốt q trình ni cấy Bên cạnh đó, cịn cho biết thời điểm sinh khối tế bào lớn giúp ta dừng trình lên men thời gian hợp lý để thu sinh khối tế bào Hình 3.3: Ảnh hưởng thời gian ni q trình sinh trưởng tổng hợp fucoidanase Quan sát chủng q trình ni cấy, chủng SW21 phát triển qua pha lien tiếp bao gồm: pha lag, pha log, l og, pha cân pha tử vong   44 Ở pha lag (6h đầu q trình ni cấy), pha lag tính từ lúc bắt đầu cấy giống đến vi khuẩn đạt tốc độ sinh trưởng cực đại Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia, trọng lượng thể tích tế bào tăng rõ rệt thời kì vi khuẩn làm quen với mơi trường chất dinh dưỡng Kết (Hình 3.3) cho thấy, pha lag diễn vài đầu nuôi cấy Đến pha log (từ 6h đến 18h nuôi), nồng độ tế bào tăng nhanh chóng sau pha lag mơi trường ni có số lượng lớn tế bào thích nghi Bên cạnh đó, thời gian vi sinh vật có khả năn năngg tổng hợp enzyme ngoại bào lớn để phân giải chất dinh dưỡng mơi trường Vì vậy, giai đoạn tế bào vi sinh vật diễn trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ nhất, dẫn đến số lượng tế bào tăng theo lũy thừa.  Kết cho thấy sau 6h nuôi, giá trị OD đo chủng SW21 1,61 (đạt 70 % so với giá tri OD cực đại Ở pha OD 660 tăng liên tục, sau 6h nuôi cấy giá trị OD660 tăng khoảng 12 ÷ 14% (so với giá trị cực đại) chủng phát triển chậm lại sau 18h nuôi cấy Ở cuối pha này, số lượng tế bào chưa đạt lớn quần thể tế bào có trạng thái sinh hóa, sinh lý tế bào vi sinh vật hoàn thiện việc nuôi cấy ở  giai đoạn thường sử dụng để nghiên cứu sinh hóa sinh lý vi sinh vật Bước sang pha cân (từ 18h đến 36h ni) tốc độ sinh trưởng khả trao đổi chất giảm Số lượng tế bào chết cân với số tế bào sinh Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, chất độc tích lũy, pH giảm Mặc dù giai đoạn tốc độ tăng trưởng tế bào vi sinh vật chậm lại lại giai đoạn số lượng tế bào vi sinh vật lớn nên thường chọn thời điểm giai đoạn cân để thu sinh khối vi sinh vật Kết OD 660 nm đo thể rõ giá trị OD 660 nm pha cân lớn so với pha khác sau 24h ni chủng SW21 có nồng độ tế bào cao Pha suy vong ( sau 36h) nồng độ tế bào hai chủng bắt đầu giảm xuống Đến khoảng 41h ni mật độ tế bào chủng giảm nhanh, nồng độ tế bào chủng SW21 đạt 87% (so với giá trị cực đại) Điều cho thấy vi sinh vật đến giai đoạn suy vong chất dinh dưỡng môi trường giảm xuống, sản   45  phẩm tiết nhiều, vi khuẩn chết tự phân nhờ enzyme thân Vì q trình ni cấy tránh để vi sinh vật đạt đến giai đoạn Từ kết thí nghiệm ta thấy khả sinh trưởng hoạt tính enzyme chủng SW21 tăng mạnh sau 6h nuôi cấy,bắt đầu pha ổn định sau 18h nuôi cấy đạt giá trị cực đại sau 24 ni cấy lắc (Hì (Hình nh 3.3) Hoạ Hoạtt độ fucoidanase fucoidanase thu giảm nhanh chóng bắt đầu pha suy vong vong,, sau 36h nuôi cấy 3.4 Kết nghiên cứu điều kiện xúc tác enzyme 3.4.1 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme Hình 3.4: pH tối ưu fucoidanase chiết từ chủng SW21   46 Kết nghiên cứu cho thấy pH thích hợp cho hoạt động fucoidanase từ chủng SW 21 khoảng 6.0-7.5 (Hình 4) Trong enzym hoạt động tối ưu ở   pH 6,5 6,5 Kết nhận khác với số loài vi sinh vật khác vi sinh vật biển Vibrio sp N-5 có pH hoạt động tối ưu 7,5 [19] số vi sinh vật biển khác lại có pH tối ưu 6,5-8 Error: Reference source not found found pH tối ưu cho cho hoạt hoạt động động của enzy enzym m Fuco Fucoid idan anas asee của chủngg SW21 SW21 cũng khác khác với với Fucoidanase động vật thân mềm Hal mềm Halioti iotiss sp 5,4 [39] và Litt và Littorina orina kurila kurila 5,6 [23] 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme Hình3 5: Nhiệt độ tối ưu để enzyme fucoidanase từ chủng SW 21 hoạt động   47 Kết (Hình3.5) cho thấy fucoidanase hoạt động tốt 35 oC Từ 50oC trở  enzym bắt đầu bị biến tính nên hoạt tính giảm nhanh chóng Kết chúng tơi tơi nhận được tương tự so với cơng trì trình nh nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu enzym fucodanase từ số loài sinh vật  biển, vi sinh vật biển biển khác lại có eenzym nzym hoạt động nh nhiệt iệt độ tối tối ưu 30-35 [37]  Nhiệt độ tối ưu cho hoạt hoạt động động en enzym zym fucoid fucoidanase anase chủng chủng SW21 SW21 có có khác o  biệt với với Fuc Fucoida oidanase nase độ động ng vật thân mềm mềm Hali  Haliotis otis sp 38 C [39]   48 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau trình phân lập sang lọc l ọc khả sinh enzyme phân cắt polysaccharide từ  bùn thải trong trình trình sản xuất xuất củ củaa nhà máy sản sản xu xuất ất fucoidan fucoidan,, chúng ng tôi thu số kết sau: Chúng phân lập 30 chủng vi khuẩn từ bùn thải trình sản xuất fucoidan nhà máy sản xuất Fucoidan Trong đó, chủng (SW9, SW14, SW21, SW22, SW28) có khả năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan loại chất fucoidan chiết từ loài rong Nâu S.mcclurei S.mcclurei,, S.polycystum,, và Padi S.polycystum và Padina na sp sp với hoạt tính cao Chủng SW21 chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cao loại fucoidan Enzyme có hoạt tính bẻ ngắn mạch fucoidan enzyme nội bào Điều Điều kiện kiện lên men men tối tối ưu cho cho chủng chủng SW21 SW21 là: là: - Hàm Hàm lư lượng ợng fuc fucoi oiddan 0,0 0,011% - Nguồn Nguồn nitơ nitơ tố tốii ưu cho cho sinh sinh trưởn trưởngg ssinh inh tổng tổng hợp hợp fucoid fucoidanas anasee hỗn hợp Bacto pepton dịch chiết nấm men với tỉ lệ 5:1, - pH mô môii trư trườn ờngg nuô nuôii cấy cấy 7- 7.55 - Tốc Tốc đđộộ nuôi nuôi cấ cấyy tối tối ưu 160 160 vvòn òng/ g/ph phút út - Thời Thời gi gian an nuôi nuôi cấ cấyy tối tối ưu 24 gi  pH tối tối ưu cho hoạt động fucoida fucoidanase nase từ chủ chủng ng SW21 SW21 là 6,5  Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động fucoid fucoidanase anase từ chủ chủng ng SW SW21 21 là 35oC 4.22 Kiến Kiến nghị nghị Định Định da danh nh ch ủngg SW SW21 21   49 Tinh enzyme enzyme cắt mạch mạch fuc fucoid oidan an của chủng chủng SW21 SW21 Nghiên cứu sâu động học enzyme   50 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường phân lập l ập Môi trường phân lập  Nước cất 500 ml  Nước biển 500 ml Glucose 1g  Nấm men men 1g MgSO4.7H2O 0,05g K 2HPO4 0,2g Pepton 5g Agar 18g  pH 7,5 – 7,8 Phụ lục 2: Thành phần môi trường lên l ên men Môi trường lên men  Nước cất 500 ml  Nước biển 500 ml MgSO4.7H2O 0,1g K 2HPO4 0,1g Pepton 10g Fucoidan 50 mg  pH 7,0 – 7,2   51 Phụ lục 3: Cách pha hóa chất cho phương pháp Nelson Thuốc thử Nelson A  Na2CO3 25g KNaC4H8O6.4H2O 23g  NaHCO  NaHC O3 20g  Na2SO4 20g Định mức đủ lít Thuốc thử Nelson B CuSO4.5H2O 15g H2SO4 đậm đặc – giọt Định mức đủ 100 ml Thuốc thử Nelson C Dung dịch gồm Dung dịch gồm NH4Mo7O24.4H2O 33g H2O 50ml Na2HASO4 9,4g H2O 50 ml Trộn dung dịch với 42 ml H2SO4 đậm đặc, sau them dung dịch 2, khuấy đều, đưa lên mức lít nước cất đặt 37oC 1- ngày trước sử dụng   52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt  Ngô Đăng Đăng Nghĩa, Nghĩa, Lu Luận ận án tiến tiến sỹ, Tối Tối ưu hóa qquy uy trì trình nh cơng nghệ sản sản xuất alginate natri từ rong mơ Việt Nam ứng ứn g dụng số lĩnh vực sản xuất, 1999)  Nguyễn  Ngu yễn Duy Duy Nhứ Nhứt,t, Bùi Minh Lý, Nguyễn Nguyễn Mạnh Mạnh Cư Cường, ờng, T Trần rần Văn Sang ((2007) 2007),, Tạp chí Hóa học, tập 45, số 3, trang 339-342 Phạm Đức Thịnh Thịnh (20 (2007), 07), ‘Tách ‘Tách chi chiết ết phân tích tích thành thành phần polysac polysacchri chridd tan nước từ số loài rong nâu Việt Nam’’, luận văn thạc sĩ, Viện  Nghiên  Nghi ên Cứu Cứu Ứng D Dụng ụng C Công ông Nghệ Nha Trang Trang,, K Khánh hánh Hòa Trần Thị Luyến – Đỗ Minh Phụng – Nguyễn Anh Tuấn – Ngô Đăng Nghĩa (2003), Chế biến rong biển, biển, nhà xuất Nông nghiệp Tiếng anh Andrea, Andrea, eett al (2009) (2009),, Fucoid Fucoidan an and fuco fucoid idana anase se – foc focus us on techn techniqu iques es for  molecular structure elucidation and modification of marine polysaccharides Appl Microbiol Biotechnol 82: 1-11 B Tangorone, J.C.Royer, J.P Nakas, “Purification and characterization of an endo-(1,3)-β-D-g -D-glucan lucanase ase from Trichoder Trichoderma ma longi longibrach brachiatu iatum”, m”, App Applied lied and environmental Microbiology, Microbiology, (1989), Vol 55, No 1, pp 177 – 184) Bakunina, I.Y., O.I Nedashkov Shaia, S A Alekseeva, E P Ivanova, L.A Romanenko, N M Gorshkova, V V Isakov, T.N Zvyagintseva, and V.V Mikhailov (2002), “Degradation of Fucoidan by the marine proteobacterium  Pseudoa  Pse udoaltero lteromon monas as citrea” citrea”,, Micr  Microbio obiology logy,, 71, 41-47 Berteau O., McCort I., Goasdoue N et al.,(2002), “Characterization of a new αL-fucosidase isolated from the marine mollusk  m ollusk  Pecten  Pecten maxim maximus us hat catalyzes the hydrolysis of  α-L-fucose from Asco from  Ascophyl phylum um nodosum nodosum” ”, Glycobiology Glycobiology,, 12, 273282 Berteau O., Mulloy B (2003), “Sulfated fucans and an overview of enzimes active toward this Review”, Glycobiology B, Vol 13, N.6, 26R-40R   53 10 Bilan M I., Grachev A A and Usov Usov A I (2004), A highly regular fraction of a Fucoidan from the brown seaweed  Fucu  Fucuss disti distinchu nchuss, Carbonhydr Res., Res., 339, 511-517 11 Bo Li, Fei Lu, Xịnin Wei and Ruixiang Ruixiang Zhao (2008), (2008), “Fucoidan: Structure and Bioativity”, Mol Bioativity”,  Molecule eculess- 13, 13, 1671-1695 12 Daisuke Tachikawa, Masaji Nakamizo, Makoto Fujii, Anti-Turmo Activity and Enhancement of NK Cell Activity by Fucoidan, 12th International Congress of   Immunol  Imm unology ogy and and 4th Annual Conference of FOCIS, 2004 13 Dan Daniel iel R., Berteau Berteau O., Joz Jozefo efonvi nvicz cz J., et al (1999) (1999),, “Degr “Degrada adatio tionn of alg algal al ( Ascophyl  Ascophyllum lum nodosum nodosum)) Fu Fuco coid idan an by an enzym enzymat atic ic activ activit ityy cont contai aine nedd in digestive glands of the marine mollusk  Pecten  Pecten maxim maximus” us”,, Carbonhyd Res., Res., 322, 291-297 14 Darar Dararad ad Choos Choosawad awad,, Urepo Ureporn rn Legg Leggat, at, Chava Chavaboon boon Dechsukh Dechsukhum, um, Amornrat Amornrat Phongdara and Wilaiwan Chotigeat (2005), “Anti-turn our activities of Fucoidan from aquatic plant Utricularia aurea lour”, SongklanakarinJ.Sei Technol., 27, 779-807 15 Des esca camp mpss V., Kla lars rszi zins nskky O., O., Ba Barb rbey eyrron J et al al (199 (1998) 8),, “Fuc “Fucoo- oligosaccharides, enzym pour leur preparation a partir de fucanes, bacterie  productri  prod uctricede cede l’enzy l’enzym m et applicati application on des fuco-olig fuco-oligosacc osaccharid harides es a la protection protection des plantes” plantes”, Brev  Brevet, et, FR FR 278352 27835233 16 Do Dobas bashi, hi, K.; Nis Nishin hino, o, T.; Fuj Fujiha ihara, ra, M (1989) (1989),, “Isolat “Isolation ion and prelimi preliminar naryy characteri chara cterizatio zationn of fucos fucose-cont e-containin ainingg sulfated sulfated polysacch polysaccharide aridess with bloodbloodanticoagulant activity from seaweed Hizi seaweed  Hizikia fusiforme” fusiforme”,, Carbohydr Res., 194, 315-320 17 Fujimura, T.et (2000), “ Fucoidan is the component of focus vesiculosus that  promotes contractio  promotes contractionn of fubro fubroblast blast – populated populated collgen collgen gels’’ gels’’,, Biological   Pharma  Pha rmacolo cology gy Bullet Bulleton, on, 223, 3, pp 1180 – 1184 1184 18 Furukawa S, Fujikawa T, Koga D, Ide A (1992), “Production of Fucoidan- degrading enzyms, Fucoidanase and Fucoidan sulfatase by Vibrio sp N-5”, N-5”,  Nippon  Nipp on Suisa Suisann Gakkais Gakkaishi hi,, 58, 1499–1503   54 19 Furukawa, S.; Fujikawa, T.; Koga, D.; Ide, A (1992), “Purification and some  propertie  prop ertiess of exoexo-type type Fucoi Fucoidana danases ses from Vibrio Vibrio sp N-5”, Biosci Biosci Biotec Biotechnol hnol Biochem.,56, 409-494 20 Kitamura K, Matsuo M, Yasui T (1992), “Enzymic degradation of Fucoidan by Fucoid Fuc oidana anase se fro from m the hepato hepatopan pancre creas as of Pat Patino inopec pecten ten yessoe yessoensi nsis”, s”,  Bio  Biosci sci  Biotechn  Biot echnol ol Biochem Biochem,, 56, 490–494 21 Kloareg, B., Dematry, M., and Mbeau, S (1986), “Polyanionic characteristic of  furified sulphated homofucans from brown algae”  Int.J  Int.J.Bio Bio Macromol Macromol-8, -8, pp  pp 380-386 22 Kobayashi T, Honke K, Miyazaki T, Matsumota K, Nakamura T, Ishizuka I, Makita Mak ita A (1994) (1994),, “He “Hepat patoc ocyte yte growth growth factor factor (HGF) (HGF) specif specifica ically lly binds binds to sulfoglycolipids”, J.Bi sulfoglycolipids”,  J.Biol ol ch chem-2 em-269, 69, pp98  pp9817-9 17-9821 821 23 Kusaykin, M.I.; Burtseva, Y.V.; Svetasheva, T.G.; Sova, V.V.; Zvyagintseva, T.N (2003), “Distribution of O-glycosylhyd O-glycosylhydrolases rolases in marine invertebrates Enzyms of the marine mollusk  Littorin  Littorinaa kurila kurila that catalyze Fucoidan transformation”, Bio transformation”,  Biochemi chemistry stry (Moscow), 68, 317,324 24 Maria E.R Duarte,a Marc A Cardoso,a Miguel D Noseda,a,1 Alberto S Cerezo Cer ezo (20 (2001) 01),, “Struct “Structura urall studi studies es on Fucoid Fucoidans ans from from the brown brown seawee seaweedd Sargassum stenophyllum”,  stenophyllum”, Carbohydrate Research 333, pp 281–293 25 Ma Mari riaa I Bi Bilan lan,, Alex Alexey ey A Gr Grac ache hev, v, Alex Alexand ander er S Shash Shashko kov, v, Niko Nikola layy E,  Nifantiev  Nifan tiev and An Anatoli atoliii I Usov (2006) “Str “Structu ucture re of a Fucoidan Fucoidan from the brow brownn seaweed Fucu seaweed  Fucuss ser serratu ratuss L”, Carbohydrate Research 341, pp 238-245 26 Maruyama, Hiroko, Tâmuchi, Hidekazu; Hashimota, Minoru; Makano, Takahisa (2 (200 003) 3),, “A “Ant ntit itum umor or ac acti tivi vity ty an andd immu immune ne respo respons nsee of Meka Mekabu bu Fu Fuco coid idan an extracted from sporophyll of Undaria of Undaria pinnatifida”,  pinnatifida”, In  In Vivo Vivo,, 17(3), 245-249 27 Morigana T, Araki T, Ito M, Kitamikado M (1981), “A search for Fucoidandegrading bacteria in coastal sea environments of Japan”, Bull Japan”, Bull Jpn Jpn Soc Sci F Fish ish,, 47, 621–625 28 Mülheim an der Ruhr (2009), “Isolation, Characterisation, Modification an Application of Fucoidan from Fucu from Fucuss vesi vesiculo culosu” su”   55 29. Nelso  Nelsonn TE (1944),“A (1944),“A photo photometri metricc adaptatio adaptationn of the Somogy Somogy method method for the determination of glucose”, J glucose”, J Biol Biol Chem Chem 153: 375–381 30 Nomenclature of Cabonhydrates Cabonhydrates ( Recommendations 1996) 31.Pai 31 Painte nter, r, T.A T.Alga lga Polysa Polysacc cchari harides des In The polysa polysacch cchrid rides, es, Aspina Aspinall, ll, G.O.Ed G.O.Ed Academic Press, Orlando, II, 196-285, 1983 32.Per 32 Perciv cival al E.Alga E.Algall polysa polysacch cchari arides des.// //In: In: The Carboh Carbohydr ydrate ates s (Chemi (Chemist stry ry and Bioc Bioche hemi mist stry ry) ) (W.P (W.Pig igma man, n, D D.Ho Hort rton on eds eds.)) – 1970 1970 -N N.Y Y.:: Acad Acad Pr Pres ess s.-V.IIB-.P.541-544) 33 Ponce, N.M.A.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B (2003), “Fucoidans from the brown seaweed  Aden  Adenocys ocystis tis utricula utricularis ris:: ext extract raction ion method methods, s, antivi antiviral ral activi activity ty and structural studies” Carbohydr Res., 338, 153-165 34 R Saravanan et al, “Isolation and Partial purification of extracellular enzyme (1,3)-β-D-gl -D-glucana ucanase se from Trich Trichoder oderma ma reesei reesei (3239 (3239)”, )”, Biot Biotechno echnology logy 6(3) (2007), pp 440 – 443) 35 Rita Elkins M.H (2001), “Limu Moui-prize sea plant of tonga and the south  pacific”,  pacif ic”, Woodland Publishing-Utah-USA 32 pagine 36 Sakai T, Ishizuka K, Kato I (2003b), “Isolation “Isolation and characterization of a Fucoidan-degrading Fucoidan-degrad ing marine bacterium”, M Mar ar Biotechnol 5, 409–416 37.Sak 37 Sakai, ai, T.; KaSWa KaSWai,i, T.; Kato, Kato, I (20 (2004) 04),, Isolat Isolatio ionn and character characteriza izatio tionn of a Fuco Fu coid idan an-d -deg egra radi ding ng mari marine ne ba bact cter eria iall st strai rainn and it itss Fuco Fucoid idan anas ase, e, Mar Mar Biotechnol, 6, 335-346 38 Tanaka K., Sorai S (1970), “Hydrolysis of Fucoidan by abalone liver α-L- fucoisidase”, FEB fucoisidase”,  FEBSS Lett., Lett., 9, 45-48 39 Thanassi, N.M.; Nakada, H.I (1967), “Enzymic degradation of Fucoidan by enzyms from the hepathopancreas of  Abalone  Abalone,, Hal  Haliotu iotuss Species”, Species”, Arch  Arch  Biochem Bio  Biochem Biophys phys.,., 118, 172-177 40 Vedrenge M Erlandsson – Harris H Tarkowski A (2000), “Role of selectins in experimental Staphylococcus aureus – induced arthritis’’ Euro arthritis’’  European pean Journal Journal of   Immunol  Imm unology ogy – 30, pppp 1606 1606 – 1613 1613 41 W.A.P.Black (1952), “Laboratory - Scale Isolation of Fucoidin from Brown Marine Algae”, J.Sci Algae”, J.Sci.Fd.A Fd.Agric gric,, pp3-122   56 42 Wei D, Zhang L, Williams DL, Browder IW (2002) (2002) glucansti glucanstimulat mulates es human dermal fibroblast collagen biosynthesis through a nuclear factor-1 dependent mechanism Wound repair regen 10:161 – 168 43 William DL (1997), Overview of ( fi 3)- β-D-Glucan immunobiology, Mediat, Inflamm, 6:247 – 250 44 Will 44 Willia iams ms DL, DL, Muel Muelle lerr A, Brow Browde derr Ư (199 (1996) 6),, Gluc Glucan an-b -bas ased ed macr macrop opha hage ge stimulators: a review of their anti-infectivepotential, Clin, Immunother 5: 392 –  399 45 Yaphe W., and Morgan K (1959), “Hydrolysis of fucoidin by  Pseu  Pseudom domona onass atlantica and and Pseu  Pseudom domonas onas carragee carrageenova nova” ”,  Natu  Nature re,, 463, 761-762 46 Zhongcun Pang, Kodo Otaka, Yasunori suzuki, Kyoji Goto, Masatake Ohnishi, “Pur “P urif ific icat atio ionn and ch char arac acte teri rizat zatio ionn of an end endoo-(1 (1,3 ,3))-β-D-D-glu glucan canase ase from from Arthrobacter sp.”, Journal of Biology Macromol, (2) (2004), pp 57 – 66.) 47 Zhuang, Cun; Itoh, Hiroko, Mizono, Takashi Ito, Hitoshi (1995), “Antimor  active Fucoidan from the brown b rown seaweed, Umitoranoo ( Aargass  Aargassum um thun thunbergi bergiii)”,  Biosci  Bio sci Biotec Biotechh Bi Bi,, , 9, 563-567 48 Zvyagintseva T.N, T.N, Shevchenko N.M, Nazarenko E.L, et al.,(2005), Swatersoluble polysaccharides polysaccharides of some broSWn algae of he Russian Far-East Structure and biological action of low-molecular mass polyuronans Journal of  Experiment Marine Biology and Ecology 320 123-131 49 http://www http://www.hoalinhpharma.co hoalinhpharma.com.vn/Desktop m.vn/Desktop.aspx/ND.aspx/ND-Cam-nang-SK/D Cam-nang-SK/Dinhinh- duong-an-toan-hop-ly/Thuc_ duong-an-toa n-hop-ly/Thuc_pham_chong_ pham_chong_viem_nhiem_ viem_nhiem_trong_co_t trong_co_the/ he/ 50 http://www.wattpad.com/8 http://www.wattpad.com/858818-hoa58818-hoa-hoc hoc ... diện của chất nnơi có khả tồn vi sinh vật tiêu thụ Xuất phát từ lý nêu định chọn đề tài : ? ?Phân lập sàng? ? lọc vi sinh vật sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharide từ bùn thải pilot sản ? ?xuất Fucoidan. .. chủng vi sinh vật từ bùn thải trình sản xuất fucoidan Để tiến hành tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh enzyme cắt mạch polysaccharide, tiến hành phân lập vi sinh vật từ bùn thải thu từ cống thải. .. t fucoidan 3.2 Sàng lọc cchủng 3.2 hủng vi sinh sinh vật vật theo theo định định hướng hướng sinh sinh enzyme enzyme cắt mạch polysaccharide Sau phân lập 30 chủng vi khuẩn, tiến hành sàng lọc