Phân lập và sàng lọc hoạt tính antri protease từ vi sinh vật liên kết hỉa miên tại biển đà nẵng

Hải miên được biết là nguồn phong phú các hợp chất hóa học với các hoạt tính sinh học khác nhau gồm kháng khối u, kháng virus, kháng khuẩn, kháng viêm…Tuy nhiên, có giả thuyết cho rằng,

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -





       -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ANTRI-PROTEASE TỪ VI

SINH VẬT LIÊN KẾT HỈA MIÊN TẠI BIỂN ĐÀ NẴNG

Giáo viên hướng dẫn 1 : PGS.TS Phạm Việt Cường

Giáo viên hướng dẫn 2 : NCS Trần Thị Hồng

Sinh viên thực hiện : Đỗ Đức Thiệm

Lớp : 12-01

Hà Nội – 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên , em xin gửi lời cảm ơn tới tới ban giam hiệu Viện Đại Học Mở Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô trong khoa công Nghệ Sinh Học đã dạy dỗ em tron suốt 4 năm học tại trường, và trang bị cho em nền tảng kiến thức khoa học và tạo điều kiện tốt nhất cho em được làm báo cáo tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Phạm Việt Cường, Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung– Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam và NCS Trần Thị Hồng, người đã trực tiếp hướng dẫn em phương pháp học tập và nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua

Đồng thời, em cũng gửi lời cảm ơn tới các cô chú, các anh chị, cán bộ Trung tâm Sinh học Phân tử Nghĩa Đô – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã giúp đỡ em rất nhiều tron thời gian em thực tập

Cuối cùng, em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời cảm ơn vì đã luôn giúp đỡ, đọng viên en trong suốt thời gian qua

Sinh viên làm báo cáo

Đỗ Đức Thiệm

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.4 Chất ức chế protease (Protease inhibitor-PI) 10

1.5 Tình hình nghiên cứu về chất ức chế protease trong và ngoài nước 22

1.5.1 Tình hình nghiên c ứu trên thế giới[48] 22

1.5.2 Tình hình nghiên c ứu trong nước 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu, vật liệu nghiên cứu, hóa chất và thiết bị 27

2.2.1 Ph ương pháp phân lập vi sinh vật liên kết hải miên 34

2.2.2 Ph ương pháp thử nghiệm ức chế protease 34

2.2.2.1 Ph ương pháp thử nghiệm ức chế protease trên đĩa thạch 34

2.2.2.2 Ph ương pháp phân tích protease sử dụng BAPNA 35

2.2.3.2 Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phổ tử ngoại 36

2.2.3.3 Trình t ự và thông số cặp mồi sử dụng để tiến hành PCR 37

2.2.3.6 Xác định trình tự nucleotit của gen 40

2.2.3.7 X ử lý trình tự ADN và phân tích số liệu bằng phần mềm máy tính 40

3.1 Phân lập và sàng lọc hoạt tính anti-protease từ vi sinh vật hải miên 41

3.1.1 K ết quả phân lập vi sinh vật liên kết hải miên 41

3.1.2 K ết quả sàng lọc bước đầu trên đĩa thạch 44

3.1.2 K ết quả sàng lọc thứ cấp hoạt tính anti-protease bằng BAPNA 453.2 Tách dòng gen và giải trình tự gen mã hóa 16S rARN của chủng V5D3 SCA 46

4.2 Kiến nghị 52TÀI KIỆU THAM KHẢO

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA Axit deoxyribonucleotit

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

SMPI Streptomyces metalloproteinase inhibitor HIV Virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch

(Human Immunodeficiency Virus)

(Acquired Immuno Defciency Syndrom) SLPI Secretory leukocyte protease inhibitor

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Hải Miên 4

Hình 1.2: Mô hình protease 7

Hình 1.3: Cấu trúc không gian protease 7

Hình 1.4: Sơ đồ phân loại protease 8

Hình 3.1: một số hình ảnh phân lập trên đĩa thạch……….43

Hình 3.2: Một số hình ảnh thử nghiệm hoạt tính antri-protease 46

Hình 3.3: Kết quả điện di chủng V5D3 SCA 47

Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S DNA riboxom của chủng V5D3 SCA 48

Hình 3.5: Kết quả so sánh trên Blast của chủng V5D3 SCA 50

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số chất ức chế protease 14 Bảng 2.1: Tên hóa chất và hãng sản xuất sử dụng trong thí nghiệm……… 28 Bảng 2.2: Tên thiết bị máy móc và hãng sản xuất trong thí nghiệm……… 29 Bảng 2.3: Trình tự và thông số cặp mồi khuyếch đại gen 16S rRNA cho vi khuẩn……… 38 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR cho vi khuẩn……… 39

Bảng 3.1: kết quả phân lập vi sinh vật liên kiết hải miên 41

Bảng 3.2: Kết quả sàng lọc bước đầu hoạt tính antri-protease trên đĩa thạch 45 Bảng 3.3: Kết quả sàng lọc thứ cấp hoạt tính antri-protease bằng BAPNA……… 46 Bảng 3.4: Kết quả xác định tỉ lệ A260/A280 và nồng độ DNA (µg/ml) của chủng nghiên cứu………48 Bảng 3.5: Kết quả nhận dạng chủng V5D3 SCA sau so sánh BLAST…… 51

Hải miên được biết là nguồn phong phú các hợp chất hóa học với các hoạt tính sinh học khác nhau gồm kháng khối u, kháng virus, kháng khuẩn, kháng viêm…Tuy nhiên, có giả thuyết cho rằng, rất nhiều sản phẩm của hải miên thực chất là do vi khuẩn liên đới tổng hợp, và rất nhiều báo cáo đã chứng minh giả thuyết này Vì vậy, gần đây người ta chú ý nhiều hơn đến vi sinh vật liên đới hải miên để tìm nguồn gốc đích thực của các hợp chất hoạt tính sinh học và sự liên kết hải miên-vi sinh vật (Li et al., 2007) Trong khi nuôi động vật không xương sống để tổng hợp các sản phẩm tự nhiên nói chung cực kỳ đắt đỏ hoặc không thực hiện được, nuôi cấy vi sinh vật có thể cung cấp hợp chất quan trọng rẻ và số lượng lớn

Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ hải miên biển và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng, nhưng những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên mới chỉ được bắt đầu

Protease còn được gọi là các proteolytic enzyme, là các enzyme có khả năng thủy phân các liên kết peptid của chuỗi peptid, protein thành các đoạn peptid ngắn hơn và các acid amin Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm

Page 2

nhiều chức năng sinh lý như: hoạt hóa zymogene, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng…

Mặc dù nhóm enzyme này có vai trò sống còn đối với các tế bào vật chủ, chúng cũng có thể gây hại khi biểu hiện thừa hoặc nồng độ cao; thí dụ chúng hoạt hóa ung thư, rối loạn thoái hóa thân kinh, viêm và các bệnh tim mạch Vì vậy chức năng của nhóm enzyme này cần được giám sát và điều khiển chặt chẽ Hệ kiểm soát quan trọng nhất là các chất ức chế protease (PIs), những phân tử ngăn chặn hoạt tính của proteases Một số Pis, ngoài chức năng ngăn cản proteases, các chức năng khác cũng được tìm thấy như hoạt tính các nhân tố sinh trưởng, loại bỏ thụ thể hoặc sự thúc đẩy ung thư Các chất ức chế protease trong tự nhiên được báo cáo lần đầu tiên năm

1894 bởi Fermi và Pernossi khi hai nhà khoa học này phát hiện hoạt tính chống trypsin trong huyết thanh người Đến nay, các chất ức chế protease đã được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên từ nguồn thực vật, động vật, vi khuẩn

Có thể nói không ở tổ chức sống nào là không tồn tại các chất ức chế protease

và nhiều chất ức chế protease đã được tổng hợp nhân tạo

Tuy nhiên, những thành tựu trong nghiên cứu các chất ức chế chỉ thực

sự được bắt đầu với những công trình nghiên cứu của Kunitz và Nothrop về chất ức chế trypsin tụy bò Cùng với trypsin, sau này nhiều protease khác đã được sử dụng để phát hiện các chất ức chế protease như: chymotrypsin, elastase, subtilisin và các protease tinh chế từ nấm Khoảng 32 chất ức chế protease hiện đang sử dụng trong lâm sàng và ít nhất 9 chất nữa đang được triển khai Phần lớn các chất ức chế protease báo cáo cho đến nay là tổng hợp hóa học được thiết kế dựa trên cấu trúc Các chất ức chế protease cũng được tìm thấy trong các nguồn tự nhiên, ví dụ Miraziridine A, chất ức chế

cathepsins B và L được phân lập từ hải miên biển Theonella mirabilis

Page 3

Các chất ức chế protease là công cụ mạnh để bất hoạt các proteases đích trong qúa trình gây bệnh các bệnh của người như khí thũng (emphysema), viêm khớp (arthritis), pancreatitis, nghẽn mạch (throbosis), huyết áp cao, loạn dưỡng cơ, ung thư và AIDS Mặc dù ngày càng nhiều chất

ức chế protease gây bệnh được sản xuất và thương mại hóa nhưng việc tìm các chất ức chế mới của protease vẫn luôn được quan tâm Xuất phát từ các

sơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi đề xuất đề tài “Phân lập và sàng lọc hoạt tính anti-protease từ vi sinh vật liên kết hải miên tại biển Đà Nẵng Việt Nam”

Mục tiêu của đề tài:

- Sàng lọc được một số vi sinh vật liên kết Hải miên có hoạt tính protease cao

anti Định danh được 1anti 2 chủng vi sinh vật có hoạt tính antianti protease cao nhất

Nội dung của đề tài:

- Phân lập vi sinh vật liên kết hải miên

- Sàng lọc hoạt tính anti-protease từ vi sinh vật

- Định danh 1-2 chủng vi sinh vật có hoạt tính cao nhất

Page 4

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về hải miên

Hải miên (Phylum Porifera) là những động vật sống lâu và rất ổn định, chúng tồn tại 700-800 triệu năm với tốc đọ sinh trưởng khác nhau ở các nhóm khác nhau Chúng là động vật không xương sống đa bào, sống bám ở đáy biển, nhưng cũng có loài nước ngọt Trong số khoảng 15.000 loài hải miên, chỉ có khoảng 1% sống trong môi trường nước ngọt Hải miên không có mô thực sự, nhưng có các loại tế bào khác nhau với các chức năng khác nhau và cùng nhau thực hiện các chức năng bình thường của cơ thể

Hải miên là “mỏ vàng” về khía cạnh về đa dạng các chất trao đổi thứ cấp để xua đuổi và ngăn cản các loài ăn thịt, cạnh tranh không gian với các loài không có cuống khác và chống lại sự nhiễm bệnh Hải miên có thể cung cấp những thuốc tiềm năng chống lại rất nhiều bệnh Trong 18.000 sản phẩm

tự nhiên từ biển, trong đó có hơn 30% là từ hải Nhưng nồng độ các chất hoạt tính có trong mô của hải miên lại rất thấp Nhữn nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm 50% thể tích của hải miên, và con số này cao hơn 2-3 lần vi sinh vật có trong nước biển

Hình 1.1: Hải miên biển

Page 5

Ở Việt Nam, hải miên đã biết 160 loài, gặp nhiều ở vùng biển phía nam, nhất là Nam Trung Bộ, đảo Phú Quốc, Côn Đảo

1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên

Rất nhiều hải miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô của chúng Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa Vi sinh vật liên đới với hải miên có cả nội bào và ngoại bào Những nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật liên đới với hải miên sử dụng các kỹ thuật

vi sinh nuôi cấy truyền thống, hoặc kiểm tra mô hải miên dưới kính hiển vi Những nghiên cứu này cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 50% thể tích hải miên, và cộng đồng này đặc hiệu cho hải miên

Trong những năm gần đây, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy rất nhiều nghiên cứu đã khảo sát tính đa dạng của vi sinh vật cộng sinh hải miên ở các hệ sinh thái biển khác nhau và một số tác giả thấy rằng vi khuẩn liên đới hải miên bền vững theo không gian và thời gian Nhưng một số tác giả khác lại thay đổi giả tthuyết này Ví dụ, mặc dù

cách địa lý nhỏ, nhưng cộng đồng vi sinh vật của Cymbastela concentrica vùng ôn đới khác với cộng đồng vi sinh vật trong Cymbastela concentrica ttừ

nước vùng nhiệt đới của Australia

Hải miên được biết là vật chủ của cộng đồng vi sinh vật lớn và vai trò của những vi sinh vật này thay đổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh, hỗ sinh với hải miên Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phương pháp như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), 16S

rRNA gene sequencing and Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), người

Page 6

ta nhận thấy cộng đồng vi khuẩn liên kết với hải miên có tới hơn 25 phyla,

trong đó có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes,

sinh vật khác sống trong hải miên là fungi và microalgae Rất ít biết về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống như virus được phát hiện trong nhân tế

bào của Aplysina (Verongia) cavernicola Có 2 con đường để hải miên tạo

nên vi khuẩn liên kết, một là hấp thu vi khuẩn đặc hiệu từ nước xung quanh khi nước đi qua hải miên trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi khuẩn liên đới thông qua giao tử (gametes) của hải miên bằng cách đưa cả vi khuẩn vào noãn bào (oocytes) hoặc ấu trùng (larvae)

Chức năng liên đới của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý (processing) chất thải trao đổi chất và sản sinh các chất trao đổi thứ cấp Có giả thuyết là các vi sinh vật biển liên đới với hải miên là các nhà sản xuất gốc các hợp chất hoạt tính sinh học Bằng chứng thí nghiệm đầu tiên ủng hộ giả thuyết này là của Faulkner và cs, xác định vị trí của các sản phẩm tự nhiên trong vi sinh vật liên kết hải miên

và nghiên cứu bằng hóa học Bằng cách đó đã có thể định vị được cytotoxic macrolide swinholide A và peptide theopalauamide trong vi khuẩn đơn bào dị dưỡng và vi khuẩn sợi dị dưỡng, tương ứng

1.3 Tổng quan về protease

1.3.1 Khái niệm về protease

Protease hay peptidase là nhóm Enayme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO- NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và ,một số

Page 7

cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các pepetide phân tử

thấp [51]

Protease là nhóm phổ biến và đa dạng tron các enzym và có trong tất cả

sinh vật sống, nấm, vi khuẩn, virus, vi khuẩn, cổ khuẩn, sinh vật nguyên sinh,

thực vật và động vật protease là nhóm lớn nhất với hơn 560 chủng đã được

biết đến [4]

1.3.2 Phân loại protease

Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên pepetide trong phân tử protein,

người ta chia protease làm 2 nhóm chính:

- Endopeptidase ( proteinase): chủ yếu phân giải các liên kết pepetide

nằm trong phân tử protein tạo thành những đoạn pepetide có trọng lượng phân

tử nhỏ

- Exopepetidase ( polypeptidase): chủ yếu cắt pepetide ở hai đầu mạch

Protease (pepetidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (EC.3.4)

Hình 1.3: Cấu trúc không gian của

protease

Hình 1.2: Mô hình protease [55]

Page 8

Hình 1.4: Sơ đồ phân loại protease

Dựa vào thành phần amino acid và vung pH tối ưu của protease, người

ta chia làm các nhóm:

1.3.3 Vai trò của protease trong ung thư

Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng… Ngoài ra, các protease có thể hoạt động như các yếu tố

Protease (pepetidase) E.C.3.4

Exopeptidase

(E.C.3.4.11-17)

Endopepetidase (E.C.3.4.21-99) Serine proteinase Cystein proteinase Aspartic proteinase Metallo proteinase Aminopeptidase

Carboxypeptidase

Phân đoạn màng tế bào tách chiết từ tế bào sợi (fibroblast) bào thai gà chuyển dạng bởi virut Rouss Sarcoma có hoạt tính protease cao hơn 40 lần so với phân đoạn màng tế bào bình thường Sự tăng hoạt tính của enzym này có liên quan rõ rệt với sự di căn của tế bào ác tính Một số tác giả khác cũng tìm thấy mối liên quan giữa sự tăng hoạt của collagenase và sự di căn của tế bào carcinoma VX-2 ở thỏ

Hoạt tính cathepsin B-1 huyết thanh cũng tăng cao hơn 45 lần ở phụ nữ

bị ung thư phần phụ Kết quả điều trị tốt các loại ung thư này (bằng ngoại khoa hoặc hóa chất) đã giảm hoạt tính của cathepsin B-1 về mức bình thường Một dạng cathepsin B khác ở dịch màng phổi cũng có hoạt tính tăng cao ở những phụ nữ bị ung thư vú

Đã có báo cáo về sự tăng hoạt tính của một protease phụ thuộc calci ở

tổ chức gan chuột bị ung thư và tiền ung thư so với tổ chức gan chuột bình thường

Sự tăng hoạt tính các loại protease ở khối u được giải thích trên cơ sở tác dụng sinh học của chúng Các protease được bài tiết bởi các tế bào khối u

Page 10

có khả năng phá hủy sự gắn của tế bào vào những bề mặt rắn Các protease như collagenase, cathepsin B, chất hoạt hóa plasminogen có vai trò phá hủy rào chắn là màng tế bào bao quanh các tế bào khối u

Khả năng của tế bào khối u phá hủy màng nền và khuôn ngoại bào đã được chứng minh là có liên quan rõ rệt với khả năng di căn của các khối u Rochefort đã tách chiết thành công một protease được bài tiết bởi dòng tế bào ung thư vú di căn ở người (MCF 7,ZR 75-1) và xác định đó là aspartyl protease giống procathepsin D Hàm lượng của enzym này ở bào tương liên quan rõ rệt với sự xâm lấn của tế bào khối u và oestrogen kích thích sự tăng cường tổng hợp enzym này ở tế bào u

Những kết quả trên cho thấy sự liên quan rõ rệt giữa khối u di căn và các loại protease khác nhau Khi khối u mới phát sinh không phát hiện thấy tăng các protease, điều này cho thấy protease có vai trò chủ yếu ở giai đoạn di căn Các protease này từ bề mặt màng tế bào u sẽ phá hủy màng tế bào bình thường cũng như khuôn ngoại bào tạo ra sự xâm lấn của tổ chức u vào tổ chức lành, và đó là bước đầu tiên của quá trình di căn

1.4 Chất ức chế protease (Protease inhibitor-PI)

1.4.1.Khái niệm chất ức chế protease

Chất ức chế protesase là những chất có tác dụng ức chế hoạt động của protease ở những mức độ khác nhau

Chất ức chế tự nhiên được báo cáo lần đàu tiên vào năm 1894 bởi Femi

và pernossi khi hai nhà khoa học này phát hiện họat tính chống trysin trong huyết thanh người Đến nay, các PI đã được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên

từ nguồn gốc động vật, thực vật, vi khuẩn Có thể nói không ở tổ chức sống nào không tồn tại PI cà nhiều PI đã được tổng hợp nhân tạo Tuy nhiên những thành tựu tron nghiên cứu chất ức chế chỉ bắt đầu với những công trình

Page 11

nghiên cứu của Kuitz và Nothrop về chất ức chế trysin tụy bò Cùng với trysin, sau này nhiều protease khác được sử dụng để phát hiện PI như chymotrysin, elastase, subtilisin và các protease tinh chế nên rất nhiều cấu trúc ưc chế protease ứng dụng trong thực tế phác đồ điều trị [3]

1.4.2 Nguồn chất ức chế protease

Các chất ức chế protease, đặc biệt là serine protease inhibitors là một trong những nhóm phong phú nhất của các protein trong tế bào nhân chuẩn, phân bố rộng rãi trong thực vật, động vật và vi sinh vật cũng như vi khuẩn cổ [9][10]

Các chất ức chế protease có nguồn gốc vi khuẩn đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực[18][14] Số lượng và tính đa dạng của các chat ức chế protease được thể hiện trong các vi sinh vật và nấm bậc cao làm cho chúng trở thành một nguồn quan trọng của chất ức chế protease mới với các tính năng độc đáo Một đánh giá đã xác định protease vi khuẩn được coi như mục tiêu phát triển thuốc kháng sinh "thế hệ thứ hai" [12] Các vi sinh vật prokaryote thuộc nghành vi khuẩn cổ, vi khuẩn và của nấm là nguồn quan trọng của chất ức chế protease.Enzyme phân giải protein ngoại bào thủy phân các hợp chất nitơ hữu cơ trong môi trường và có thể gây hại cho tế bào Việc sản xuất các thuốc ức chế các enzym phân giải protein của vi sinh vật đã phát triển như một cơ chế để bảo vệ tế bào Các chất ức chế cụ thể có nguồn gốc của vi sinh vật đã được sử dụng như một công cụ hữu ích trong phân tích sinh hóa của các chức năng sinh học và bệnh tật Các chất ức chế protease vi sinh vật rất đa dạng về cấu trúc và cơ chế của sự ức chế cũng khác với những nguồn khác Do đó, họ đã tìm thấy nhiều ứng dụng trong lĩnh vực y tế, nông nghiệp và công nghệ sinh học[14]

Page 12

Vi sinh vật là nguồn cung cấp nguyên liệu hiệu quả và rẻ tiền cho việc thu nhận chất ức chế protease do sinh sản nhanh, không mất nhiều diện tích

để nuôi cấy và dễ dàng thực hiện các phương pháp di truyền [15] Các báo

cáo cho rằng vi khuẩn cộng sinh với giun tròn Entomopathogenic là một

nguồn nguyên liệu có giá trị cho viêc tạo ra chất chế protease có thể ngăn ngừa côn trùng [16] Ưu điểm của việc sử dụng vi sinh vật và các chất ức chế protease từ nấm thể hiện sự độc đáo trong ức chế, kháng lại sự phân hủy protein và có khả năng thích ứng cao đối với các tác nhân biến đổi môi trường [17][11][14]

Vi sinh vật biển, với các đặc tính khác so với chủng của chúng trên mặt đất, các chủng được ứng dụng để tạo ra các chất mới hữu ích như chất ức chế protease[11] Vi sinh vật biển tiềm năng trở thành nguồn cung cấp có giá trị các chất ức chế protease serine và các enzym khác [19][20].Trong các nghiên cứu cho thấy trong số các sinh vật biển, bọt biển là sinh vật có nhiều tiềm năng sản sinh các chất có tính sinh học bao gồm các hoạt chất ức chế

enzyme[21].Vi khuẩn cyanobacterium chiếm lượng lớn trong hải miên đặc biệt là trong hải miên Aplysina aerophobia có thể lên tới 40% tổng số vi sinh

vật hải miên [6]

Các chất ức chế protease thực vật là protein nhỏ hoặc peptide trong các

mô, như củ và hạt và một số mô khác của cây [22][23] Các chất ức chế protease thực vật ngăn chặn sự phân giải protein trong ruột côn trùng làm cho chúng hấp thu dinh dưỡng kém, hấp thụ kém và cuối cùng chết[24] Các chất

ức chế protease của thực vật tự nhiên là chất phòng thủ tự nhiên của cây chống lại động vật ăn cỏ hoặc côn trùng sống bằng cây cỏ, chất ức chế

Page 13

protease gây khó khăn trong quá trình phân giải protein trong một số trường hợp ảnh hưởng đến quá trình lột xác và enzym không tiêu hóa [25]

Các chất ức chế protease thực vật đã nhận được quan tâm đặc biệt bởi

vì các ứng dụng tiềm năng của chúng trong nông nghiệp như sử dụng thiên địch, kháng nấm và tác nhân kháng khuẩn Trong các sinh vật trên mặt đất chúng là ứng cử viên đáng chú ý trong việc sản xuất các tác chất chống protease Các chất ức chế protease thực vật thường là nằm trong các protease nội sinh và cũng có chức năng quan trọng trong bảo vệ cây trồng khỏi côn trùng và protease của vi sinh vật [26] Các khả năng ức chế protease thực vật dựa trên sự ức chế protease có trong ruột côn trùng hay vi sinh vật, làm thiếu hụt các axit amin cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của côn trùng và

vi sinh vật [27]

1.4.3 phân loại chất ức chế protease

a D ựa vào nguồn gốc của chất ưc chế protease

− Chất ức chế tổng hợp như FOY-305[5], các chất tương tự pepstatin[56],…

− Chất ức chế protease có nguồn gốc động vật như aprotinin, hirustasin,…

− Chất ức chế có nguồn gốc từ thực vật như amastatin, E-64, bestatin,[7]…

b D ựa vào các nhóm protease bị ức chế [1][7][56]

− Serin protease inhitor như leupeptin, antipain, chymostatin, elastatina,…

− Cystein protease inhitor như E-64, …

− Aspartic protease inhitor như pepstatin, hydropeptatin, …

Page 14

− Metallo protease inhitor như bestatin, amastatin, actinonin, histagin, … Trong đó các chất ức chế loại serin protease được chú ý nghiên cứu nhiều nhất

Bảng 1.1: Một số chất ức chế protease [1][2][3][4][5]

Tên chấtức chế Nguồn gốc Nhóm enzym bị ức chế

A PI động vật Aprotinin Tụy, mang tai, phổi,

gan của động vật

Chymostrysin, trysin …

antitrysin

B PI thực vật Kunitz trysin

inhitor

C PI vi sinh vật

E-64 Aspergillus japonicus Cystein protease

D PI tổng hợp Saquinavir Nhân cấu trúc:

NHCH(R)CH(OH)CH2NR’

2

HIV protease ( Serin protease)

1.4.4 Cơ chế tác dụng của chất ức chế protease

PI là chất ức chế đặc hiệu có nhiều bản chất khác nhau nhưng các PI có bản chất là protein được nghiên cứu nhiều hơn cả Trong phân tử của chất ức chế protease có một phần tương tác đặc hiệu, kết hợp trực tiếp với trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease nó ức chế, gọi là trung tâm phản ứng (TTPƯ) Gốc acid amin của TTPƯ, ký hiệu là acid amin P1, liên kết peptid với enzym gọi là acid amin của TTPƯ được ký hiệu là acid amin P1, liên kết peptid tương ứng -P1-P’1- gọi là liên kết TTPƯ thường nằm trên bề mặt phân tử PI trong vùng có cầu disulfua Bản chất gốc P1 phản ánh tính đặc hiệu của P1 Acid amin P1 của chất ưc chế trysin thường là lysin hoặc arginin, của chymotrysin hoặc leucin Ngoài acid amin P1, các acid amin lân cận cũng có ảnh hưởng quan trọng đến tính đặc hiệu của chất ức chế

Phân tử PI có thể có 1, 2, 3 hay nhiều trung tâm phản ứng Nếu chỉ có một TTPƯ gọi là chất ức chế một đầu hay đầu đơn; nếu có hai TTPƯ – chất

ức chế hai đầu hay đầu kép, và nếu có nhiều TTPƯ – chất ức chế nhiều đầu Các PI hai đầu hay nhiều đầu có thể kết hợp đồng thời hai hay nhiều phân tử protease, các enzym này có thể có đặc tính đặc hiệu giống hoặc khác nhau[8]

Một chất ức chế protease thường có tác dụng ức chế đặc hiệu một hoặc một số protease Tất cả các chất ức chế protease đều hoạt động theo cơ chế gần giống nhau Chúng ngăn cản hoạt động của enzym protease trong phạm vi

tế bào người hay những vi sinh vật Protease vi sinh vật cần thiết cho quá trình trưởng thành và sinh sản Khi các PI gắn kết vào enzym này, những vi

Page 16

sinh vật mới vẫn có thể rời tế bào nhưng chúng không thể lây nhiễm sang tế bào khác được Vì vậy sẽ ngăn cản lây lan vi sinh vật trong cơ thể[10]

Chất ức chế protease tác dụng theo hai cách sau[7]:

− Ức chế (khóa) hoạt động của các protease bởi các phản ứng tương tác protein-protein

− Hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh với cơ chất vào trung tâm hoạt động của các protease

Quá trình ức chế protease của các chất ức chế cũng chính là sự tương tác giữa các enzym và chất ức chế theo một cơ chế phổ biến – cơ chế chuẩn giống cơ chất Chất ức chế (I) kết hợp với enzym (E) theo cách tương tự như

cơ chất kết hợp với enzym, nghĩa là có sự tương ứng về cấu trúc không gian của TTPƯ chất ức chế và TTHĐ enzym theo kiểu ‘ổ khóa’ và ‘chìa khóa’ Có thể biểu diễn tương tác theo sơ đồ sau:

E +I ↔ E-I ↔ E +I Phức hợp E-I được hình thành rất nhanh và thường phân ly rất chậm thành enzym tự do cùng chất ức chế dạng ban đầu hoặc dạng hiệu chỉnh I Trong dạng hiệu chỉnh , liên kết –P1-P’1- bị thủy phân, phức E-I khá bền ở

pH trung tính nhưng dễ bị phân ly ở pH acid Ở pH thích hợp cho hoạt động của protease trong phức E-I, nó lại có thể xúc tác cho sự tái tổng hợp liên kết –P1-P’1- Dùng phương pháp đặc hiệu có thể xác định bản chất acid amin đầu N vào đầu C, từ đó biết được bản chất acid amin P1 [9] Việc nghiên cứu

về chất ức chế protease rất cần thiết cho việc tìm ra những thuốc mới ứng dụng trong điều trị Tác động của PI từng bệnh sẽ theo những cơ chế khác nhau Việc nghiên cứu và xác định rõ vai trò của PI trong việc phát triển của bệnh là rất cần thiết Nhìn chung, PI ứng dụng trong điều trị hoạt động của protease theo ba cơ chính là:

Page 17

− Ức chế thủy phân protein thành các acid amin, ngăn cản sự tổng hợp nên protein mới, cơ chế này được thấy rõ nhất trong điều trị virus và bảo quản thực phẩm

− Ức chế hoạt động của protease mà có vai trò trong phát triển bệnh hay nguyên nhân gây di căn tế bào ung thư và bảo quản thực phẩm

− Chất ức chế protease có vai trò quan trọng trong cơ thể (các PI sinh lý) như trong quá trình đông máu, cầm máu … từ đó đưa ra thuốc aprotinin điều trị xuất huyết

PI có mặt trong hầu hết các tổ chức tự nhiên và ở bất kì tổ chức nào cũng đóng vai trò quan trọng nhất định Tìm hiểu rõ vai trò đó của PI sẽ rất quan trọng trong ứng dụng của chúng sau này

1.4.5 Yếu tố ảnh hưởng đến chất ức chế protease

Chất ức chế protease là một nhóm protease và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Tính ổn định nhiệt cao là đặc tính quan trong ứng dụng vào công nghệ sinh học Nhiêt độ và PH kiểm soát chất ức chế protease, ổn định nhiệt ảnh để xem xét như bước đầu của các ứng dụng như ứng dụng trong

các quá trình sinh học của gen [15] Serratia marcescens tạo ra một lượng nhỏ

chất ức chế chịu nhiệt ( SmaPI) ức chế hoạt động hầu hết các protein ngoại bào 50kDa[36] pH và tính ổn định nhiệt của chất ức chế có thể có liên kết với disulfide[37].Liên kết disunfude chịu trách nhiệm ổn định chức năng của nhóm chất ức chế Kunitz đối với các tác nhân biến tính như vật lý,hóa học như nhiệt độ, PH và chất khử[38].Có một sự liên qua giữa tính ổn đinh cấu trúc và chịu nhiệt của chất ức chế serine protease[39].Nhiệt độ và PH có thể làm biến dạng cấu trúc của các chất ức chế làm cho các chất ức chế không thể

Page 18

liên kết với các enzym và cơ chất Nhiệt độ, độ ion, PH và các yếu tố hóa lý khác có thể ảnh hưởng đến tương tác protein –proten[40]

Sự có mặt của các ion kim loại cần thiết cho sự hoạt động của một số chất ức chế protease như chúng có một vai trò quan trọng trong việc duy trì

sự toàn vẹn cấu trúc của chất ức chế protease Sự ổn định cấu trúc của một protein được tăng cường bởi các ion kim loại hóa trị II Điều này là do các ion kim loại có vai trò quan trọng trong cấu tạo và cần thiết cho hoạt động sinh

học của protein Cysteine protease inhibitor (CPI) từ hạt kê cần Zn2+ cho ức chế protease và hoạt tính kháng nấm của các protein, điều này cho thấy vai trò quan trọng của ion kim loại đến hoạt tính ức chế protease[41]

Các chuỗi cacboxylat của glutamate và aspartate có thể tham gia trong liên kết của các cation hóa trị hai taọ ra metalloproteins Các nghiên cứu về

tác động của các ion kim loại vào các hoạt động của Moringa oleifera

1 mM tăng cường các hoạt động ức chế protease lên đến 31% và Hg2 + ở nồng

độ 10 mM nâng cao lên đến 64% hoạt động ức chế protease Ca2 + và Mg2 + ở nồng độ cao hơn (10 mM) tăng cường các hoạt động ức chế protease chỉ đến một mức nhất định

Thông thường sự suy giảm trong hoạt động sinh học của protein được quan sát bởi quá trình oxy hóa của methionine Hiệu quả của quá trình oxy hóa methionine của chất ức chế α1-protease (α1-PI) đã được nghiên cứu kỹ lưỡng Khi bị oxi hóa bởi methionine sẽ làm mất hoàn toàn hoạt động ức chế của α1-PI [12] Các cấu trúc đặc trưng của chymotrypsin đã biến đổi đáng kể khi bị oxy hóa bởi methionine để sulfoxide Nghiên cứu trên α2-

1.4.7 Các nghiên cứu ứng dụng chất ức chế protease

Các phương pháp hiện nay để bảo vệ cây trồng phụ thuộc chủ yếu vào việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Việc sử dụng duy nhất thuốc trừ sâu hóa học không chỉ dẫn đến nhanh chóng tích tụ kháng với các hợp chất hóa học, tác động lên tất cả sinh vật do đó ảnh hưởng đến sự cân bằng giữa côn trùng

và động vật săn mồi tự nhiên, làm cây cỏ hại phát triển[30] Để hạn chế tác hại của chất bảo vệ thực vật bằng chất hóa học đến môi trường và sức khỏe con người, kỹ thuật di truyền thực vật đã được đề xuất là biện pháp thay thế

để tạo ra cây trồng kháng côn trùng Trong số các protein được biết có thể diệt côn trùng có nguồn gốc từ thực vật, các chất ức chế protease nổi lên như là

và phát triển của chúng [32] Các chất ức chế protease (PI) là một trong những ứng cử viên chính có hoạt tính ức chế đã được chứng minh rất cao đối với côn trùng gây hại và cũng là cách cải thiện chất lượng dinh dưỡng của thực phẩm [29]

Cây chuyển gen biểu hiện một chất ức chế proteinase đã tăng cường mức độ kháng sâu bệnh Các gen ức chế protease đã được sử dụng để tạo ra cây trồng biến đổi gen có trong các chương trình quản lý tổng hợp dịch hại [29] Một số chất ức chế serine protease và cysteine protease đã được thể hiện trong cây chuyển gen để tăng sức đề kháng chống lại bộ cánh vẩy(Lepidoptera) và bọ cánh cứng (Coleoptera) Nhiều cây chuyển gen biểu hiện protein gây độc thần kinh có nguồn gốc khác nhau đã được nghiên cứu Trong thí nghiệm cho thấy khả năng kháng nấm, chất ức chế protease từ lúa

mạch chống lại ba loại nấm phytopathogenic, Magnaporthe grisea,

thực vật, dadantii Dickeya và Pseudomonas syringae

Trong công nghệ thực phẩm, protease có rất nhiều trong thực phẩm và rất khó loại bỏ, do đó chúng là chất gây hỏng protein chính vì vậy chất ức chế chất ức chế protease là chất cần thiết cần được bổ sung Trong sản xuất thịt xay, chất chế proteinase được thêm vào như là một chất để giảm khả năng tạo

Page 21

gel do hoạt động của protein myosin Vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm là một lĩnh vực quan tâm toàn cầu vì ước tính rằng có tới 25% của tất cả các thực phẩm sản xuất bị hỏng sau thu hoạch do hoạt động của vi sinh vật [33] Khi cá, động vật thân mềm và động vật giáp xác chết, thịt của chúng bị mềm và xuất hiện các chấm đen Đây là vấn đề nghiêm trọng trong lưu trữ và chế biến hải sản, nguyên nhân là do proteinases, chủ yếu là cathepsins làm phân hủy cơ thịt của chúng[34].Việc sử dụng một số lượng vừa đủ các chất ức chế protease tự nhiên là một cách hiệu quả để kéo dài thời hạn sử dụng của nhiều loại hải sản như các sản phẩm cá muối Điều này là do các chất ức chế

có thể làm chậm sự lão hóa và các quá trình có hại khác như thoái hóa protein bởi hoạt động của protease nội sinh và ngoại sinh, trong chế biến thực phẩm

và bảo quản

Các chất ức chế protease có tầm quan trọng rất lớn trong y học như sự phân giải protein có vai trò quan trọng trong hầu hết các quá trình sinh học quá trình phân giải protein không được kiểm soát ảnh hưởng đến quá trình sinh lý như chu kỳ phát triển tế bào, tăng sinh tế bào và tế bào chết, sao chép DNA, cầm máu (đông), chữa lành vết thương và phản ứng miễn dịch Mất kiểm soát phân giải protein là nguyên nhân gây bệnh ung thư và tim mạch, viêm, thoái hóa thần kinh, bệnh do vi khuẩn, virus và ký sinh trùng [35] Do

đó, các ức chế protease thường là mục tiêu của các can thiệp điều trị Chất ức chế protease là những yếu tố độc lực quan trọng của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh Trong “thời đại” của kháng sinh, chất ức chế protease vi khuẩn là những mục tiêu đầy hứa hẹn cho việc tạo ra các loại thuốc kháng sinh mới Protease trong một số vi khuẩn Gram âm, bị ức chế bởi chất ức chế protease serine

Page 22

1.5 Tình hình nghiên cứu về chất ức chế protease trong và ngoài nước

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới[48]

 Tình hình nghiên cứu về chất ức chế protease

Các chất ức chế protease trong tự nhiên được báo cáo lần đầu tiên năm

1894 bởiFermi và Pernossi khi hai nhà khoa học này phát hiện hoạt tính chống trypsine trong huyết thanh người Tuy nhiên, những thành tựu trong nghiên cứu các chất ức chế chỉ thực sự được bắt đầu với những công trình nghiên cứu của Kunitz và Nothrop về chất ức chế trypsin tụy bò Cùng với trypsin, sau này nhiều protease khác đã được sử dụng để phát hiện các chất ức chế protease như: chymotrypsin, elastase, subtilisin và các protease tinh chế

từ nấm

Gần 40 năm, chất ức chế protease được xem như chất không tốt về dinh dưỡng Mãi đến năm 1980, Dr Walter Troll thuộc trường đại học y khoa (New York University Medical Center) đã khám phá rằng đậu nành nguyên sơ có khả năng ngăn cản không cho bệnh ung thư phát triển ở các loài động vật do tác dụng của chất ức chế protease Tiếp sau đó nhiều nhà khoa học đã khảo sát và thử nghiệm chất ức chế protease từ đậu nành trong phòng thí nghiệm và thấy rằng nó có tác dụng chống lại sự phát triển mầm ung thư kết tràng (colon), ung thư phổi, ung thư tuyến tụy và ung thư miệng

Năm 1987, Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute) đã nhận thấy vai trò quan trọng của chất ức chế protease như một loại thuốc chữa bệnh ung thư Chúng ngăn cản sự tác động của một số genes

di truyền gây nên chứng ung thư Ngoài ra chúng còn có tác dụng bảo vệ các

tế bào cơ thể không cho hư hại, gây nên bởi môi trường xung quanh như tia nắng phóng xạ, các gốc tự do, chất có thể tấn công ADN

Page 23

7/11/2002, tại New York, Theo một nghiên cứu gần đây thì chất ức chế protease tiết ra từ bạch cầu (Secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI) được tìm thấy trong nước bọt đóng một vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa sự lây truyền HIV/AIDS qua sữa mẹ [11] Các báo cáo trước đây cho thấy SLPI có khả năng bảo vệ tế bào không bị nhiễm HIV trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, nồng độ SLPI trong nước bọt ở trẻ sơ sinh có ảnh hưởng đến nguy cơ lây truyền HIV-1 từ mẹ sang con hay không thì chưa được nghiên cứu Tiến sĩ Carey Farquhar, thuộc Trường Đại học Washington ở Seattle và cộng sự đang tiến hành nghiên cứu đo nồng độ của SLPI trong các mẫu nước bọt từ 188 trẻ sơ sinh của các bà mẹ bị nhiễm HIV Các mẫu nước bọt này được lấy lúc mới sinh và lúc 1, 3, 6 tháng tuổi

Năm 2006, Coralie E và cộng sự (Viện Hóa Sinh học, Đại học Washington, Mỹ) đã công bố đề tài nghiên cứu về Kunitz – một chất ức chế cysteine protease tinh chế từ Cauli và Arabidopsis Đề tài này đã nghiên cứu

về trình tự gen tổng hợp chất ức chế Kunitz và kiểm tra hoạt động của chúng trong một số môi trường khác nhau

Năm 2009, Simone Susser và cộng sự tại viện nghiên cứu plough, Đức đã công bố kết quả nghiên cứu chất ức chế protease đối với bệnh nhân bị viêm ganC

Schering-Năm 2015, các nhà khoa học của trường Đại Học Heidelberg, Đức đã công bố nghiên cứu về các chất ức chế serprin A3N có thể làm giảm đau thần kinh bằng cách ức chế tế bào T có nguồn gốc từ bạch cầu elastase

Đến nay, các chất ức chế protease đã được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên từ nguồn thực vật, động vật, vi khuẩn Có thể nói không ở tổ chức sống nào là không tồn tại các chất ức chế protease và nhiều chất ức chế protease đã được tổng hợp nhân tạo Một số công trình nghiên cứu ứng dụng của chất ức chế protease vào các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như:

Page 24

“Sử dụng các chất ức chế protease trong xét nghiệm hiện kháng nguyên” của Thurgau, Viện Công nghệ sinh học tại Đại học Constance, Kreuzlingen, Thụy Sĩ

“Hoạt động kháng virus của các chất ức chế protease chống lại Toxoplasma gondii” Bộ môn Ký sinh trùng, Viện Y học Nhiệt đới, Pedro Kouri, Havana, Cuba

“Phân lập chất ức chế Pepsin từ rễ của cây Anchusa strigosa” của Sở Khoa học sinh học, Khoa Khoa học, Đại học Jordan, Amman, Jordan

“Nghiên cứu về một số chất ức chế protease aspartic: quy định tổng hợp protease nội sinh trong giai đoạn vận động nảy mầm trong hạt giống Vigna radiate” của Phòng khoa học Sinh hóa, phòng thí nghiệm và hóa chất quốc gia, Ấn Độ do Aarohi Kulkarni, Mala Rao thực hiện

 Tình hình nghiên cứu chất ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên

Hiện nay, khoảng 32 chất ức chế protease hiện đang sử dụng trong lâm sàng và ít nhất 9 chất nữa đang được triển khai Phần lớn các chất ức chế protease báo cáo cho đến nay là tổng hợp hóa học được thiết kế dựa trên cấu trúc Các chất ức chế protease cũng được tìm thấy trong các nguồn tự nhiên,

ví dụ Miraziridine A, chất ức chế cathepsins B và L được phân lập từ hải

miên biển Theonella mirabilis

Gen mã hóa chất ức chế serine protease mới (serpin) gọi là Spi1C được tách dòng thông qua sàng lọc dựa trên trình tự của thư viện metagenomic từ vi sinh vật biển không nuôi cấy Gen có ORF 642 bp, mã hóa cho polypeptide

214 amino acid với khối lượng phân tử dự đoán 28,7 kDa Protein Spi1C có hoạt tính ức chế một loạt các serine proteases như α-chymotrypsin và trypsin (Jiang et al., 2011) Ngoài ra, đã phân lập được từ chủng vi khuẩn

Page 25

chống oxy hóa và hoạt tính ức chế protease (Abdelmohshen et al., 2012)

Ba chủng vi khuẩn được phân lập từ hải miên Jaspis sp có hoạt tính ức

chế protease Ba chủng này ức chế serine protease (subtilisin), metalloprotease (thermolysin) và dịch chiết thô của vi khuẩn gây bệnh

trên trình tự 16S SAB 17 - Paracoccus và SAB S-21 - Bacillus sp Vi khuẩn biển Alteromonas sp sinh chất ức chế protease marinostatin Pseudomonas

Diazepinomicin từ chủng Micromonospora sp RV115 liên kết hải miên

rộng, mà còn có khả năng chống ô xy hóa và ức chế protease Một sản phẩm

tự nhiên khác có hoạt tính ức chế protease là các dẫn xuất của tetromycin,

tetromycins 1-4 được tách từ xạ khuẩn Streptomyces axinellae Po1001T liên kết hải miên Axinella polypoides của biển Mediterranean Các sản phẩm tự

nhiên này có hoạt tính ức chế một vài cystein proteases

 Tình hình nghiên cứu về chất ức chế protease

Một số luận văn, đề tài, báo cáo khoa học cũng nghiên cứu về chất ức chế protease trên khía cạnh điều trị căn bệnh ung thư hoặc phương pháp tách chiết và sử dụng các thực phẩm chứa các chất ức chế protease vào đời sống

như:

Luận văn “Polyphenol và hoạt độ ức chế của một số serine proteinase

từ thân, hạt gỗ Vang (Caesalpinia sappan L.) và một số cây thuốc khác” Tác giả Nguyễn Minh Thắng - Trường Đại học Quốc gia Hà Nội Theo tác giả, ở