Phân lập tuyển chọn vi sinh vật liên kết hải miên có hoạt tính đối kháng với một số vi sinh vật kiểm định

Viện đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cám ơn tới toàn ban giám hiệu Viện Đại học Mở Hà Nội, đặc biệt thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học dạy dỗ em suốt năm học trường, trang bị cho em tảng kiến thức khoa học tạo điều kiện tốt cho em làm báo cáo tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến, Trung tâm Sinh học phân tử – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam PGS.TS Phạm Việt Cường, Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung– Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam NCS Trần Thị Hồng, người truyền cho em phương pháp học tập nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu vừa qua Đồng thời, em gửi lời cám ơn tới cô chú, anh chị, bạn Trung tâm Sinh học phân tử – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung giúp đỡ em nhiều thời gian thực tập Cuối cùng, em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời cám ơn sâu sắc giúp đỡ, động viên em suốt thời gian học tập Sinh viên Nguyễn Thị Mai Anh Nguyễn Thị Mai Anh Pagei Viện đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC BẢNG vi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hải miên 1.1.1 Khái niệm Hải miên 1.1.2 Đặc tính hóa học hải miên 1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên 1.3 Chất kháng sinh 1.3.1 Khái niệm chất kháng sinh 1.3.2 Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh 1.3.3 Sự hình thành chất kháng sinh vi sinh vật 1.3.4 Các nhóm kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật 10 1.4 Khái quát số vi sinh vật gây bệnh 10 1.4.1 Escherichia Coli 10 1.4.3 Bacillus subtilis 15 1.4.4 Candidaalbicans 18 1.4.5 Aspergillus niger 20 1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết hải miên nước 22 1.6 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết hải miên nước 25 2.1.Đối tượng nghiên cứu, vật liệu nghiên cứu, hóa chất thiết bị 27 Nguyễn Thị Mai Anh Pageii Viện đại học Mở Hà Nội 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.3 Hóa chất, thiết bị môi trường nuôi cấy 27 2.1.3.3 Môi trường nghiên cứu 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật liên kết hải miên 34 2.2.3 Phương pháp nhuộm Gram 35 2.2.4 Phương pháp sinh học phân 36 2.2.4.1 Quy trình tách chiết ADN genom vi khuẩn 36 2.2.4.6 Xác định trình tự nucleotit gen 41 2.2.4.7 Xử lý trình tự ADN phân tích số liệu phần mềm máy tính 42 CHƯƠNG : KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Phân lập tuyển chọn vi sinh vật liên kết hải miên có hoạt tính đối kháng số VSV kiểm định 43 3.1.1 Kết phân lập vi sinh vật liên kết hải miên 43 3.1.2 Kết tuyển chọn vi sinh vật liên kết hải miên có hoạt tính đối kháng với số vi sinh vật kiểm định 46 3.2.1 Tách ADN genome 50 3.2.2 Nhân gen 16S ADN riboxom 51 3.2.3 Giải trình tự gen chủng vi khuẩn nghiên cứu 52 Chương 4: Kết luận khuyến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Tài liệu tiếng Việt 59 Tài liệu tiếng Anh: 59 Nguyễn Thị Mai Anh Pageiii Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VSV Vi sinh vật DNA Axit deoxyribonucleotit ARN Axit ribonucleotit CKS Chất kháng sinh Agar Agarose EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate UV Ultraviolet Gr+ Gram dương Gr_ Gram âm Kb Kilobase Bp Base paire E.coli Escherichia coli VP Vibrio parahemotycus B.sutilis Bacillus sutilis A.niger Aspergillus niger CA Candida albicans Nguyễn Thị Mai Anh Pageiv Viện đại học Mở Hà Nội VK Vi khuẩn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Hình ảnh Hải Miên Hình1.2.AlexanderFleming .7 Hình1.3.E.coli 11 Hình1.4.Vibrioparahaemolyticus 13 Hình1.5.Bacillussubtilis .6 Hình1.6.Candidaalbicans 18 Hình1.7.Aspergillusniger 21 Hình2.1.Sơ đồ phảnứngPCR 39 Hình3.1 Hình ảnh phân lập vsv số môi trường nuôi cấy 46 Hình 3.2 Hình ảnh đối kháng số chủng vsv .49 Hình 3.3.Hình thái tế bào chủng đối kháng V4HM11 Ma V5HM9 Ma 49 Hình3.4.ADN tổng số V4HM11 Ma vàV5HM9Ma 51 Hình3.5.Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S-rRNA chủng nghiên cứu 52 Hình3.6 Kết so sánh Blast chủngV4HM1Ma 53 Hình 3.7 Kết so sánh Blast chủng V5HM9 Ma 54 Nguyễn Thị Mai Anh Pagev Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1.: Tên hóa chất hãng sản xuất sử dụng thí nghiệm 27 Bảng 2.2.Tên thiết bị máy móc hãng sản xuất sử dụng 28 Bảng 2.3: Trình tự thông số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR cho vi khuẩn 38 Bảng 2.4.: Thành phần phản ứng PCR cho vi khuẩn 40 Bảng 3.1 Hình ảnh phân lập vsv số môi trường nuôi cấy 43 Bảng 3.2.Khả đối kháng số nguồn bệnh nấm chủng vk 46 Bảng 3.3.Hình thái tế bào chủng đối kháng V4HM11 Ma V5HM9 Ma 49 Bảng 3.4.Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN (µg/ml) chủng nghiên cứu 50 Bảng 3.5 Kết nhận dạng chủng vi sinh vật nghiên cứu sau so sánh BLAST 53 Nguyễn Thị Mai Anh Pagevi Viện đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Mai Anh Pagevii LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam ta nằm khu vực nhiệt đới cận xích đạo, có khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, độ ẩm cao (khoảng 80%), nên nước ta thiên nhiên ban tặng hệ động thực vật đa dạng phong phú với hàng ngàn loài khác Nước ta có bờ biển trải dài, có khí hậu thuận lợi tạo điều kiện phát triển cho nhiều loài hải miên Các loài hải miên có vai trò quan trọng ngành nghiên cứu khoa học Nhiều loài có chất có hoạt tính sinh học giá trị làm thuốc chữa bệnh ung thư, kháng khuẩn, khử độc Gần loài sinh vật biển đặc biệt trọng ngành khoa học vật liệu công nghệ sinh học Trên giới, nhà khoa học ý đến hải miên coi đối tượng nghiên cứu thú vị với nhiều hoạt chất sinh học phát Hải miên biết vật chủ cộng đồng vi sinh vật lớn vai trò vi sinh vật thay đổi theo nguồn dinh dưỡng cộng sinh, hỗ sinh với hải miên Chức liên đới vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý (processing) chất thải trao đổi chất sản sinh chất trao đổi thứ cấp Có giả thuyết vi sinh vật biển liên đới với hải miên nhà sản xuất gốc hợp chất hoạt tính sinh học Bằng chứng thí nghiệm ủng hộ giả thuyết Faulkner cs, xác định vị trí sản phẩm tự nhiên vi sinh vật liên kết hải miênTheonella swinho,ei Với mục đích này, quần thể tế bào tách ly tâm nghiên cứu hóa học Bằng cách định vị cytotoxic macrolide swinholide A peptide theopalauamide vi khuẩn đơn bào dị dưỡng vi khuẩn sợi dị dưỡng, tương ứng (Thomas et al., 2010; Penesian et al., 2011) Nguyễn Thị Mai Anh Page Việc sử dụng kháng sinh không cách thiếu kiểm soát làm xuất kháng thuốc nguồn bệnh, trở thành vấn đề sức khỏe toàn giới Cùng với phát triển xã hội thay đổi sinh thái, bệnh truyền nhiễm xảy tái xảy ảnh hưởng cực mạnh lên toàn xã hội Với khả tiến hóa nguồn bệnh, bệnh truyền nhiễm chủng kháng thuốc làm cho vấn đề trở nên trầm trọng Sự phát tán rộng rãi vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc cần thiết ngày tăng phân tử có hoạt tính sinh học với đặc tính dược học cải thiện thúc đẩy quan tâm tới việc phát chất kháng sinh Hiện nay, phương pháp truyền thống để tìm loại thuốc gồm nuôi cấy vi sinh vật đất không triển vọng, tỉ lệ tái phát kháng sinh biết cao, chiếm tới 99,9% Đã có báo cáo cho thấy tỉ lệ vi sinh vật liên kết với động vật không xương sống biển có hoạt tính đối kháng vi sinh vật cao từ nguồn khác Ở Việt Nam, số nghiên cứu thành phần hải miên vịnh Hạ Long, Nha Trang cho thấy thành phần loài chúng đa dạng , số công bố tách chiết chất có hoạt tính sinh học từ hải miên biển Việt Nam Những nghiên cứu vi sinh vật liên kết động vật biển nói chung hải miên nói riêng chưa ý Đến có số công trình phân lập xác định hoạt tính sinh học vi sinh vật biển nhà khoa học nước Xuất phát từ ý nghĩa tiễn đó, thực đề tài “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật liên kết hải miên có hoạt tính đối kháng với số vi sinh vật kiểm định” Mục tiêu đề tài: - Tuyển chọn số chủng vi sinh vật liên kết với hải miên có hoạt tính kháng với số vi sinh vật kiểm định(E.coli, V.parahemolyticus, B.subtillis, C.albicans, A.niger) Nguyễn Thị Mai Anh Page - Định danh 1-2 chủng vi sinh vật liên kết với hải miên có hoạt tính đối kháng mạnh Nội dung nghiên cứu: - Phân lập vi sinh vật liên kết hải miên - Sàng lọc hoạt tính đối kháng với số vi sinh vật kiểm định(E.coli, V.parahemolyticus, B.subtillis, C.albicans, A.niger) - Định danh 1-2 chủng vi sinh vật có hoạt tính cao Nguyễn Thị Mai Anh Page Bảng 3.2.Khả đối kháng số nguồn bệnh nấm chủng vsv STT Escherichia coli ATCC25922 Tên chủng VĐK đối kháng (mm) (đã trừ d) V.parahemolyticcus C.albicans ATCC 7754 Bacillus subtilis ATCC 27212 Tên chủng VĐK đối kháng (m) (đã trừ d) V3HM16 25 AIA Aspergillus niger 439 Tên chủng đối kháng VĐK (mm) (đã trừ d) 34 Tên chủng đối kháng Tên chủng đối kháng VĐK (mm) (đã trừ d) V1HM6 SCA 20 V4HM11 Ma 33 V1HM6 M1 V7HM3 Ma 20 V5HM9 Ma 34 V22M3 R2A 25 HM11 HV1 20 V3HM16 AIA 20 V12D2 Ma 24 V1HM10 R2A 25 V3HM3 R2A 20 HM7 HV1 20 HM18HV 24 V2HM18 SCA 22 HM7 HV1 20 HM8HV1 20 V3HM6 24 V4HM11 Ma 20 V11D2 Ma 17 V13HM15 M1 20 HM16HV 23 V1HM16 R2A 20 V2HM11 Ma 17 V2HM18 OLI 17 V13 HM11R2 A 22 V5HM9Ma 20 V3D3 Ma 15 V1 HM15 OLI 15 V7HM3 Ma 20 V1HM1 Ma 15 V9D1 R2A 15 V8HM5 Ma 15 HM9HV2 20 V1HM3Ma 15 V4HM9 R2A 15 10 V5HM18 R2A 15 V4HM11 Ma 20 HM8 HV1 15 V12D2 Ma 15 11 V7HM14 15 20 V5HM9 Ma 15 QT5 M1V4 15 12 V5HM1 Ma 15 V1HM5 Ma V7HM5 Ma 20 V7HM3 Ma 15 QT2M1V3 15 13 V10HM16 R2A 10 V14HM5 Ma 20 V16HM6 Ma 15 V2HM3 Ma 10 14 V9D1 R2A V3HM16 AIA 20 V10HM1 15 V1D3 SCA 15 V1HM5 SCA VĐK (mm) (đã trừ d) 14 R2A V1HM18 M1 Nguyễn Thị Mai Anh 19 V8HM16 15 Page 47 SCA 16 V9D1 R2A 19 V5HM18 R2A 15 17 V10HM3 M1 V2HM18 M1 18 V9D1 R2A 15 V2HM11 Ma 10 19 V3HM6 OLI 14 V3HM3 OLI 10 20 HM16HV 13 18 Từ bảng 3.2 thấy chủng vi sinh vật liên kết với hải miên có khả ức chế sinh trưởng chủng vi sinh vật kiểm định mức độ khác nhau: có 14 chủng có hoạt tính đối kháng với E.coli, 20 chủng đốikháng với V.parahemolyticus, 19 chủng đốikháng với B.subtillis, chủng đốikháng với C.albicansvà 14 chủng đối kháng vớiA.niger.Trong đa số vi sinh vật đối kháng với V.parahemolyticus B.subtulis số chủng có hoạt tính cao V1HM6 M1 kháng VP với đường kính VĐK 34mm, V12D2 Ma kháng VP-đường kính VĐK 24mm, V22HM3 R2A V1HM10 R2A kháng B.subtulis với đường kính VĐK 25mm Hoạt tính đối kháng vi khuẩn với C.albicanslà thấp Một số chủng vi sinh vật có khả kháng với vài vi sinh vật kiểm định như: V1HM5 SCA Có thể thấy số chủng vsv có nhiều hoạt tính đối kháng, chủngV4HM11 Ma V5HM9 Malà có hoạt tính cao (vòng kháng khuẩn từ 15-34mm) Cụ thể: V4HM11 Ma khángvới E.coli, V.parahemolyticus B.subtlisvớivòng kháng khuẩn 33, 20 20mm tương ứng.V5HM9 Ma kháng vớiV.parahemolyticus B.subtlistrong vòng kháng khuẩn 34mm 15mm tương ứng.Từ thông số chọn hai chủng V4HM11 Ma V5HM9 Ma để xác định hình thái định danh xác định tên loài Nguyễn Thị Mai Anh Page 48 Hình 3.2 Hình ảnh đối kháng số chủng vsv Bảng 3.3.Hình thái tế bào chủng đối kháng V4HM11 Ma V5HM9 Ma STT Ký hiệu chủng Gram Hình thái tế bào V4HM11 Ma + Que dài, đôi, chuỗi, lớn V5HM9 Ma + Que ngắn, đơn, đôi, bé Nguyễn Thị Mai Anh Page 49 3.2 Tách dòng giải trình tự gen mã hoá 16s rARN chủng vi sinh vật nghiên cứu 3.2.1 Tách ADN genome Từ 1,5ml dịch nuôi cấy chủng vi sinh vậtqua nhiều bước xử lý (theo phương pháp tách chiết ADN genome nêu) thu ADN genome Độ tinh sản phẩm kiểm tra phổ hấp thụ tử ngoại điện di gel agarose 1% Kết kiểm tra quang phổ kế đồng thời dùng để xác định nồng độ ADN mẫu tách chiết Bảng 3.4 kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN theo công thức nêu Với giá trị A260/A280 dao động từ 1.82 đến 1.9 cho thấy mẫu ADN tách chiết có độ tinh cao Sau nồng độ ADN xác định, tiến hành pha loãng đến nồng độ 50ng/µl, lấy µl để kiểm tra điện di Hình ảnh điện di (Hình 3.3) cho thấy mẫu ADN sạch, bị đứt gãy, sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Bảng 3.4.Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN (µg/ml) chủng nghiên cứu Tên chủng A260 A280 A260/A280 Nồng độ ADN (µg/ml) V4HM11 Ma 0.241 0.130 1.85 602.5 V5HM9 Ma 0.248 0.135 1.84 620 Nguyễn Thị Mai Anh Page 50 Hình 3.4.ADN tổng số V4HM11 Ma V5HM9 Ma 3.2.2 Nhân gen 16S ADN riboxom Từ ADN genom chủng nghiên cứu V4HM11 Ma V5HM9 Ma, sử dụng cặp mồi 16SF, 16SR, tiến hành PCR nhân đoạn gen 16S ADN riboxom, với chu trình nhiệt nêu Với cặp mồi thiết kế dựa trình tự bảo thủ gen 16S ARN riboxom vi khuẩn khuôn ADN genom theo lý thuyết sản phẩm PCR có độ dài xấp xỉ 1500bp Kết điện di đồ sản phẩm PCR (hình 3.5) cho thấy sản phẩm PCR chủng xuất băng có kích thước khoảng 1500bp Như chu trình phản ứng PCR thiết lập hoàn toàn phù hợp với mục đích nhân dòng đoạn gen 16S ADN riboxom chủng Nguyễn Thị Mai Anh Page 51 Hình3.5.Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S-rRNA hai chủng nghiêncứu Giếng 1: sản phẩm PCR chủngV4HM11 Ma Giếng 2: sản phẩm PCR chủngV5HM9 Ma Giếng 3: Thang DNA marker(của hãng Fermentas, Đức) 3.2.3 Giải trình tự gen chủng vi khuẩn nghiên cứu Trình tự gen xác định theo phương pháp Sanger & đtg, máy xác định trình tự ADN tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) với kít xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit hãng Applied Biosystems Sau xử lý liệu thu qua phần mềm Bioedit, nhận trình tự gen 16S rRNA chủng V4HM11 Ma V5HM9 Ma Chương trình BLAST sử dụng để so sánh trình tự đoạn gen nhận với trình tự gen 16S rRNA vi khuẩn khác Ngân hàng gen quốc tế Kết định danh chủng V4HM11 Ma V5HM9 Ma phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA trình bày Bảng 3.5 Nguyễn Thị Mai Anh Page 52 Bảng 3.5: Kết nhận dạng chủng vi sinh vật nghiên cứu sau so sánh BLAST Ký hiệu chủng Tên chủng ngân hàng Độ gen V4HM11 Ma tương đồng (%) Paenibacillus barengoltzii 100 (GQ284351) V5HM9 Ma 100 Pseudoalteromonas porphyrae (AY771715) V4HM11 Ma Max Total score score Query cover E Ident Accession value Paenibacillus barengoltzii strain THWCS1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2498 2498 100% 0.0 100%GQ284351.1 Planococcus sp IC024 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 1584 1584 98% 0.0 86% U85899.1 Description Hình 3.6: Kết so sánh Blast chủng V4HM11 Ma Trình tự gen : gcccgagagg tttgttctgg ctcaggacga acgctggcgg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcggag tttatcggga gcttgctcct gataaactta gcggcggacg ggtgagtaac acgtaggcaa cctgcccgta agactgggat aactaccgga aacggtagct aataccggat acgcaagtct ctcgcatgag ggacttggga aaggcggagc aatctgtcac ttacggatgg gcctgcggcg cattagctag ttggtggggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgaacggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ccagggaaca accccccgtt agagtaactg ctaacggagt gacggtacct gagaagaaag ccccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggggcgagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggct gtttaagtct ggtgtttaat cctggggctc aaccccgggt cgcactggaa actgggcagc ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg Nguyễn Thị Mai Anh Page 53 aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg ggctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagtac ggcccgcaaa ggctgaaact caaagggaat tgacggggac ccgcacaagc agtggagtat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc cctgaccggt acagagatgt acctttcctt cgggacaggg gagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgact ttagttgcca gcaggtaagg ttgggcactc tagagtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtactacaa tggccggtac aacgggaagc gaaggagcga tctggagcga atcctttaaa gccggtctca gttcggattg caggctgcaa ctcgcctgca tgaagtcgga attgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttacaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc gcaaggagcc agccgccgaa agattgggtc cggtg V5HM9 Ma Description Max score Total score Query E Ident Accession cover value Pseudoalteromonas porphyrae 16S ribosomal RNA 2787 gene, partial sequence 2787 100% 0.0 100%AY771715.1 Pseudoalteromonas sp NO4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2739 2739 98% 0.0 99% JQ406678.1 Pseudoalteromonas sp BSs20128 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2734 2734 98% 0.0 99% EU365539.1 Hình 3.7 Kết so sánh Blast chủng V5HM9 Ma Trình tự gene: ccccccgtcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggtaacaga gagtagcttgctactttgctgacgagcggcggacgggtgagtaatgcttgggaatatgcc ttttggtgggggacaacagttggaaacgactgctaataccgcatgatgtctacggaccaa agtgggggaccttcgggcctcacgccaaaagattagcccaagtgggattagctagttggt aaggtaatggcttaccaaggcaacgatccctagctggtttgagaggatgatcagccacac tgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatg ggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcac Nguyễn Thị Mai Anh Page 54 tttcagtcaggaggaaagggtgtgttttaatagagcatatctgtgacgttactgacagaa gaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatc ggaattactgggcgtaaagcgtacgcaggcggtttgttaagcgagatgtgaaagccccgg gctcaacctgggaactgcatttcgaactggcaaactagagtgtgatagagggtggtagaa tttcaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctgaaggaataccgatggcgaaggcagcc acctgggtcaacactgacgctcatgtacgaaagcgtggggagcaaacaggattagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtctac tagaagctcg gagcctcggt tctgt ttttcaaagctaacgcattaagtagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactc aaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgc gaagaaccttacctacacttgacatacagagaacttaccagagatggtttggtgccttcg ggaactctgatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgagatgttgggtta agtcccgcaacgagc gcaaccccta tccttagttg ctagcaggta atgctgagaac tctaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgg cccttacgtgtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacagagtgctgcgaactcgc gagagtaagcgaatcactt aagtgcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcga Kết so sánh trình tự gen cho thấy đoạn gen V4HM11 Ma V5HM9 Ma có độ tương đồng cao (100%) so với gen chủng Paenibacillus barengoltzii (GQ284351) Pseudoalteromonas porphyrae (AY771715) Từ kết luận V4HM11 Ma thuộc loài Paenibacillus barengoltzii V5HM9 Ma thuộc loàiPseudoalteromonas porphyrae Paenibacillus barengoltziib ban đâù thuộc Bacillussau tách riêng vào chi Paenibacillus Đây vi khuẩn Gr + có khả sinh bào tử elip túi bào tử sưng Theo nghiên cứu cho thấy chúng có khả sản xuất axit từ L-arabinose, D- glucose, glyxerol, amylose Nó sử dụng cho nghiên Nguyễn Thị Mai Anh Page 55 cứu chuyển chitin để N-acetyl glucosamine áp dụng cho dược liệu thực phẩm chức Pseudoalteromonas porphyraelà nhân tố kiểm soát sinh học chúng sản sinh kháng sinh chất trao đổi chống nấm hydrogen cyanide, siderophore gắn sắt, enzymes gluconase, enzymes phân hủy cellulose chitin.Nó khai thác để ức chế nguồn bệnh Các chủng vi khuẩn tuyển chọn từ hải miên Quảng Trị thuộc chi nghiên cứu kỹ có tiềm ứng dụng thực tế Nguyễn Thị Mai Anh Page 56 Nguyễn Thị Mai Anh Page 57 Chương 4: Kết luận khuyến nghị 4.1 Kết luận Từ 20 mẫu hải miên phân lập 529 chủng Trong có 170 chủng phân lập môi trường M1, 19 chủng môi trường AIA, 48 chủng môi trường Oligo, 150 chủng môi trường Ma, 56 chủng môi trường SCA 86 chủng môi trường R2A Từ chủng phân lập tuyển chọn 14 chủng có hoạt tính đối kháng với E.coli, 20 chủng kháng với V.parahemolyticus , 19 chủng kháng với B.subtillis, chủng kháng với C.albicans, 14 chủng đối kháng vớiA.niger Đã chọn chủng V4HM11 Ma V5HM9 Ma có khả đối kháng với nhiều vi sinh vật kiểm định hoạt tính đối kháng từ 15-34mm Đã xác định đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu quan sát chúng môi trường thạch nuôi cấy kính hiển vi, kết hợp với giải trình tự gen 16S ARN riboxom chủng, kết cho thấy trình tự đoạn gen 16S rARN chủng V4HM11 Ma V5HM9 Ma có độ tương đồng cao (100%) so với gen tương ứng chủng Paenibacillus barengoltzii (GQ284351) Pseudoalteromonas porphyrae (AY771715) 4.2 Khuyến nghị Nghiên cứu khả ứng dụng hai chủng vi sinh vật V4HM11 Ma V5HM9 Ma Tiếp tục nghiên cứu loài hải miên biển vi sinh vật liên kết với chúng để tìm thêm loài vsv có ích cho y học đời sống Nguyễn Thị Mai Anh Page 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học –NXB khoa học kỹ thuật , Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Thực tập vi sinh vật học NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học Kĩ thuật, tr.17, 2004.Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, Thực phẩm Mỹ phẩm, NXB Giáo dục Phạm Việt Cường, Nguyễn Mai Anh, Vũ Thị Quyên, Nguyễn Thị Kim Cúc (2014) Phân lập, tuyển chọn định danh số chủng vi khuẩn liên kết sáu loài hải miên vùng biển Sơn Chà Tuyển tập Hội nghị Khoa học toàn quốc Sinh học biển Phát triển bền vững lần thứ II, trang 569-574 Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ Đào Thị Thiêm (2014), Nghiên cứu đặc tính sinh học số chủng vi khuẩn liên kết hải miên, Luận văn thạc sĩ, Đại học Nông nghiệp Hà Nội Đỗ Mạnh Hào, Phạm Thế Thư, 2010 Một số kết nghiên cứu vi sinh vật vùng ven biển Hải Phòng Tạp chí Khoa học Công nghệ biển, 10(1): 5165 Nguyễn Hữu Tùng, Châu Văn Minh, TrầnThu Hà, Phan Văn Kiệm, Hoàng ThanhHương, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Xuân Nhiệm, Bùi Hữu Tài, Jae-Hee Hyun, HeeKyoung Kang Young Ho Kim, 2009 C29-Sterol với vòng cyclopropane C-25và từ 26 bọt biển biển Việt Nam tvà đặc tính chống ung thư chúng Tài liệu tiếng Anh: Azzini F., Calcinai B., Cerrano C., Bavestrello G., Pansini M., 2007 Sponges of the marine karst lakes and of the coast of the islands of Ha Long Bay (North Nguyễn Thị Mai Anh Page 59 Vietnam) Porifera Research: Biodiversity, Innovation and Sustainability: 157164 Calcinai B., Azzini F., Bavestrello G., Cerrano C., Pansini M., Do Cong Thung, 2006 Boring sponges from Ha Long Bay, Tonkin Gulf, Vietnam Zoological studies, 45(2): 201-212 Brammavidhya S., Usharani G., 2013 Bioactive potential of sponge associated Bacillus cereus SBS02 isolated from Hyattela cribriformis Inter J Res in Environ Sci Technol., 3(2): 61-64 Krishna E R., Kumar P S., Sekhar M D A G C., Kumar B V., 2011 Study on marine sponge isolated bacteria Bacillus subtilis (MTCC No 10619) producing amylase and protease enzymes J Pharmacy Res., 4(11): 3925-3927 Kumar C P., John B A., Khan S A., Lyla P S., Kamaruzzaman B Y., Jalal K C A., 2013 Cultivable marine bacterial isolates from a sponge Hyattella cribriformis J Biol Sci., 13(1): 26-32 Lee O O., Wong Y H., Qian P Y., 2009 Inter- and intraspecific variations of bacterial communities associated with marine sponges from San Juan island, Washington Appl Environ Microbiol., 75(11): 3513-3521 Penesyan A., Tebben J., Lee M., Thomas T., Kjelleberg S., Harder T., Egan S., 2011 Identification of the antibacterial compound produced by the marine epiphytic bacterium Pseudovibrio sp D323 and related spongeassociated bacteria Mar Drugs Radjasa O K., 2007 Antibacterial activity of sponge associated bacteria isolated from north java sea J Coastal Development, 10(3): 143-150 Radjasa O K., Sabdono A., Junaidi and Zocchi E., 2007 Richness of secondary metabolites-producing marine bacteria associated with sponge Haliclona sp Inter J Pharmacology, 3(3): 275-279 Nguyễn Thị Mai Anh Page 60 10 Sambrook J., Russell D W., 2001 Molecular cloning: A laboratory manual Third edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York, 2344 pp 15 Schmitt S., Peter Tsai, James Bell, Jane Fromont, Micha Ilan, Niels Lindquist 11 Jasmin C, Anas A, Nair S (2015) vi khuẩn đa dạng Associated vớiCinachyra hang Haliclona pigmentifera , sống thử Bọt biển Coral Reef hệ sinh thái Vịnh Mannar, Đông Nam bờ biển Ấn Độ PLoS ONE 10 (5): e0123222 doi: 10,1371 / journal.pone.0123222 12 Michael W Taylor,Regina Radax, Doris Steger and Michael Wagner and Author Affiliations (2007) in Sponge-Associated Microorganisms: Evolution, Ecology, and Biotechnological Potential https://vi.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_parahaemolyticus https://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis https://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans https://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_niger Nguyễn Thị Mai Anh Page 61 [...]... đặc tính quý báu như : kháng vi sinh vật, gây độc tế bào, một số còn ức chế enzyme HIV protease 1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên Rất nhiều hải miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô của chúng Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa Vi sinh vật liên đới với hải miên có. .. kháng sinh và phát hiện các kháng sinh mới có cơ chế hoạt động khác nhau 1.3.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở vi sinh vật Một trong những tính chất của các chất kháng sinh (CKS) có nguồn gốc từ vi sinh vật (VSV) nói chung là có tác dụng chọn lọc Mỗi CKS chỉ có tác dụng vớimột nhóm VSV nhất định Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc... những phân tử nhỏ, ví dụ như palmitoylputrescine, violacein, turbomycin A và B, và indirubin và indigo Kết quả nhận được cho rằng có thể các hydrolases như là những nguồn thay thế có hoạt tính kháng khuẩn từ vi sinh vật liên kết hải miên Đến năm 2013, Grasa và cộng sự đã có một số nghiên cứu về vsv liên kết với hải miên Kết quả nghiên cứu cho thấy vsv liên kết hải miên đóng vai trò chủ yếu trong vi c... hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ các đối tượng san hô mềm và hải miên thu thập tại Quảng Ninh và Hạ Long, Vi t Nam” với KORDI Hàn Quốc Nghiên cứu thành phần hóa học một số loài hải miên và vi sinh vật cộng sinh thuộc biển Vi t Nam với đối tác phía Pháp là Bảo Tàng lịch sử thiên nhiên quốc gia Pháp, Paris Các nghiên cứu về vi sinh vật liên đới hải miên tại Vi t Nam còn hạn chế và chưa có nghiên... về vi sinh vật liên đới với hải miên sử dụng các kỹ thuật vi sinh nuôi cấy truyền thống, hoặc kiểm tra mô hải miên dưới kính hiển vi Những nghiên cứu này cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 50% thể tích hải miên, và cộng đồng này đặc hiệu cho hải miên Trong những năm gần đây, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy rất nhiều nghiên cứu đã khảo sát tính đa dạng của vi sinh vật. .. về tính đối kháng của hệ vi sinh vật này với các chủng vi sinh vật gây bệnh, cũng như phát hiện các chất có hoạt tính sinh học khác từ hệ vi sinh vật này Nguyễn Thị Mai Anh Page 26 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 .Đối tượng nghiên cứu, vật liệu nghiên cứu, hóa chất và thiết bị 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20 mẫu hải miên được lấy từ biển Đà Nẵng – Vi t Nam 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu Vi sinh. .. độ C, pH 5,6 Ngoài ra, Aspergillus niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzym khác như: lipase, mananase 1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết hải miên ngoài nước Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật liên kết với hải miên như: Nhiều tác giả đã phát hiện các nhóm gen polyketid synthase trong vi sinh vật liên đới hải miênbằng những phân tích metagenomics (Piel et al., 2004;... rằng hải miên là một trong những nhà sản xuất các chất chuyển hóa hoạt tính sinh học nhiều nhất thế giới và trong một số trường hợp, các hợp chất này là do các vi khuẩn tạo ra chứ không phải là từ hải miên Nhóm nghiên cứu đã xem xét và sử dụng một số phương pháp tiếp cận như nuôi cấy, phân tách tế bào và phương pháp metagenomics để nghiên cứu về vi sinh vật liên kết với hải miên Từ 2 loài hải miên. .. cứu về sự liên kết của vi sinh vật với hải miên biển Nghiên cứu của nhóm tác giả cho thấy hải miên biển thường chứa các cộng đồng vi khuẩn đa dạng và phong phú, bao gồm cả vi khuẩn, vi khuẩn cổ, vi tảo và nấm Trong một số trường hợp, vi sinh vật chiếm 40% khối lượng của hải miên và có đóng góp quan trọng vào quá trình trao đổi chất thứ cấp của hải miên (ví dụ, thông qua quang hợp hay cố định đạm) Nghiên... al., 2007) Chức năng liên đới của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý (processing) chất thải trao đổi chất và sản sinh các chất trao đổi thứ cấp Có giả thuyết là các vi sinh vật biển liên đới với hải miên là các nhà sản xuất gốc các hợp chất hoạt tính sinh học Bằng chứng thí nghiệm đầu tiên ủng hộ giả thuyết này là của Faulkner và cs, xác định vị trí của các