Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase170008

Chúng ta đã biết đến phytase từ Aspergillus niger với rất nhiều ưu điểm như: bền nhiệt, khả năng hoạt động ở pH axit; hoạt tính cao; chống chịu được tác động của các proteinase trong hệ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH

ENZYME PHYTASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH

TS ĐÀO THỊ LƯƠNG

Hà Nội – Năm 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 14

1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE 14

1.1.1 Cấu trúc của axit phytic 14

1.1.2 Sự phân bố phytate trong tự nhiên và chức năng của phytate 15

1.1.3 Đặc tính kháng dinh dưỡng của axit phytic 17

1.1.4 Ảnh hưởng của phytic tới môi trường 21

1.2 PHYTASE 21

1.2.1 Chức năng của phytase 21

1.2.2 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của phytase 22

1.2.3 Nguồn phytase trong tự nhiên 23

1.2.4 Phân loại phytase 24

1.2.4.1 Histidine axit phosphatase (HAP) 25

1.2.4.2 ß-propeller phytase (BPPhys) 26

1.2.4.3 Purple axit phosphatase (PAP) phytases 27

1.2.5 Gen mã hóa phytase 27

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất phytase từ vi sinh vật 29

1.2.6.1 Các yêu tố vật lý 29

1.2.6.2 Các yếu tố dinh dưỡng 30

1.2.7 Điều khiển sinh tổng hợp phytase 31

1.2.8 Các ứng dụng của phytase 33

1.2.8.1 Ứng dụng của phytase là phụ gia thức ăn chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản… 33

1.2.8.2 Ứng dụng của phytase trong công nghiệp thực phẩm 35

1.2.8.3 Ứng dụng của phytase trong cải tạo đất 36

1.2.8.4 Ứng dụng của phytase trong dược phẩm 36

1.2.8.5 Bán tổng hợp peroxydase 37

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHYTASE 37

1.3.1 Nghiên cứu làm tăng tính bền nhiệt của phytase 37

1.3.2 Nghiên cứu về thay đổi pH hoạt động tối ưu của phytase 38

1.3.3 Nghiên cứu về khả năng bền axit và enzyme protease của phytase 39

1.3.4 Nghiên cứu về tăng hiệu suất của quá trình sản xuất phytase 40

1.3.5 Nghiên cứu về động vật và thực vật chuyển gen phytase 41

1.3.6 Những nghiên cứu về phytase ở Việt Nam 41

1.4 LÊN MEN XỐP 43

1.4.1 Khái niệm về lên men xốp 43

1.4.2 Những ưu điểm và nhược điểm của lên men xốp 44

1.4.3 Các ứng dụng của lên men xốp 46

1.4.3.1 Sản xuất các axit hữu cơ 47

1.4.3.2 Sản xuất các hợp chất tạo hương và tạo vị 47

1.4.3.3 Sản xuất enzyme 47

1.4.3.4 Sản xuất Fructooligosaccharides 47

1.4.3.5 Sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học 48

1.4.3.6 Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 48

1.4.3.7 Sản xuất cồn sinh học 48

1.5 CHI BACILLUS VÀ PHÂN LOẠI TRONG CHI BACILLUS 48

1.6 THU HỒI ENZYME 53

1.6.1 Chiết rút enzyme 53

1.6.2 Cô đặc enzyme – tủa enzyme 53

1.6.2.1 Tủa enzyme bằng muối ammonium sulfate 53

1.6.2.2 Tủa bằng dung môi hữu cơ 54

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 56

2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƯỜNG, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 56

2.1.1 Chủng vi sinh vật 56

2.1.2 Môi trường nghiên cứu 56

2.1.2.1 Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt và môi trường nhân giống 56

2.1.2.2 Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM – phytase screening media)……… 56

2.1.2.3 Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase 56

2.1.2.4 Môi trường nuôi xốp 57

2.1.3 Thiết bị 58

2.1.4 Hóa chất 58

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 59

2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase 59

2.2.2 Tuyển chọn chủng 61

2.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng 61

2.2.4 Phương pháp phân loại 61

2.2.4.1 Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN 61

2.2.4.2 Quan sát hình thái 65

2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh phytase của chủng vi sinh vật nghiên cứu 66

2.2.5.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng sinh trưởng ở chủng nghiên cứu 66

2.2.5.2 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp phytase ở chủng nghiên cứu 67

2.2.6 Thu hồi enzyme 68

2.2.6.1 Chiết xuất enzyme 68

2.2.6.2 Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ 68

2.2.7 Nghiên cứu enzyme phytase 69

2.2.7.1 Gen mã hóa phytase 69

2.2.7.2 Các đặc tính của enzyme 70

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 72

3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 72

3.1.1 Lựa chọn chủng ưa nhiệt 72

3.1.2 Lựa chọn chủng có hoạt độ phytase cao 72

3.1.3 Lựa chọn chủng sinh tổng hợp phytase bền nhiệt 73

3.2 PHÂN LOẠI 74

3.2.1 Xác định trình tự ADNr 16S 74

3.2.2 Đặc điểm hình thái 77

3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 78

3.3.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống 78

3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp 81

3.4 THU HỒI ENZYME 88

3.4.1 Thu hồi enzyme bằng các dung dịch chiết khác nhau 88

3.4.2 Tủa enzyme bằng các dung môi khác nhau 89

3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901 903.5.1 Phân tích trình tự gen phytase và so sánh với các loài có quan hệ gần gũi……… 903.5.2 Đặc tính enzyme phytase thô……… 90DANH MỤC TÀI LIÊU THAM KHẢO 93

DANH MỤC BẢNG, HÌNH

Bảng 1 Hàm lượng phosphor và phytate ở một số loại thức ăn gia cầm phổ biến 6

Bảng 2 Các loại môi trường dùng cho lên men xốp……… 47

Bảng 3 Trình tự mồi dùng cho phản ứng khuếch đại 5 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL……… 53

Bảng 4 Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S……… 54

Bảng 5 Hoạt tính phytase của 2 chủng SP1901 và D15 trong lên men xốp và lên men dịch thể 63

Bảng 6 Độ bền nhiệt của 2 chủng SP1901 và D15 ở 60oC……… 64

Tên hình Trang Hình 1 Cấu trúc của axit phytic được đề xuất bởi Neuberg, 1908 (A) và Anderson, 1914 (B)……… 5

Hình 2 Sự tương tác của các ion kim loại với IP6……… 8

Hình 3 Sự liên kết của IP6 với protein và tinh bột trực tiếp (A) hoặc gián tiếp (B)…… 10

Hình 4 Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân phytate……… 12

Hình 5 Cấu trúc không gian của phyA từ A niger NRRL 3135……… 16

Hình 6 Mô hình cấu trúc phytase β-propeller……… 17

Hình 7 Lên men xốp trong các túi nilon……… 34

Hình 8 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng Pvc……… 50

Hình 9 Sinh trưởng và vòng phân giải phytase của chủng SP1901 (trái) và D15 (phải) trên PSM……… ……… 62

Hình 10 Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài Bacillus có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự AND r16S……… 65

Hình 11 Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài thuộc nhóm Bacillus subtilis dựa vào trình tự kết nối 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA……… 66

Hình 12 Hình thái tế bào (trái) và khuẩn lạc (phải) của chủng SP1901……… 67

Hình 13 Môi trường nhân giống thích hợp chủng SP1901……… 68

Hình 14 pH thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901……… 69

Hình 15 Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901……… 69

Hình 16 Thời gian thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901……… 70

Hình 17 Chế độ thông khí thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901……… 70

Hình 18 Cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901……… 71

Hình 19 Độ ẩm thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901……… 72

Hình 20 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống cho lên men xốp của chủng SP1901………… 72

Hình 21 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của chủng SP1901……… 74

Hình 22 Nguồn các bon thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901 (Đối chứng âm: không bổ sung nguồn các bon)……… 75

Hình 23 Nguồn nitơ thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901 (Đối chứng âm: không bổ sung nguồn nitơ)……… 75

Hình 24 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901……… 76

Hình 25 Ảnh hưởng của hàm lượng Ca2+ đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901……… 77

Hình 26 Chiết xuất enzyme bằng các dung môi khác nhau……… 78

Hình 27 Tủa enzyme bằng cồn và aceton……… 80

Hình 28 Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài Bacillus có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen phytase………

81 Hình 29 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của phytase chủng SP1901……… 82

Hình 30 pH hoạt động thích hợp của phytase chủng SP1901……… 84

Hình 31 Nhiệt độ hoạt động thích hợp của phytase chủng SP1901……… 84

Hình 32 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của phytase chủng SP1901…

85 Hình 33 Ảnh hưởng của Ca2+ đến độ bền nhiệt của phytase chủng SP1901 xử lý ở 60oC (trái), xử lý ở 70oC (phải)……… 86

Hình 34 Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất được sấy khô ở 50oC trong 24h 87 Hình 35 Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt động của phytase chủng SP1901… 88

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT ANFs Anti-nutritional factors

BPP ß-propeller phytase

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylene diamine tetracetic acid

GRAS Generally regarded as safe

GIT Gastro intestinal tract- ống dạ dày ruột

HAP Histidine acid phosphatase phytase

IP1, IP2, IP3,IP4,IP5 Inositol mono-, bis-, tris-, tetrakis-, pentakis-phosphate

IP6 Phytic acid/ myo-inositol hexakisphosphate

IUB International Union of Biochemistry IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

NCBI National Center for Biomedical Informatics

PAP Purple acid phosphatase phytase

PDB Protein database bank

Pi Phosphate vô cơ

Tm Nhiệt độ biến tính

ppm Một phần triệu

MỞ ĐẦU Phospho (P) là một nguyên tố thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật, phospho chủ yếu được tìm thấy trong các loại đá phốtphat vô cơ và trong các cơ thể sống Ở các cơ thể sống, phospho vô cơ dưới dạng phốtphat PO43-

tham gia vào cấu trúc các đại phân tử sinh học như ADN và ARN (hình thành liên kết phosphoeste giữa gốc 3’OH và 5’phosphate của 2 nu kế tiếp, tham gia cấu thành

“đồng tiền năng lượng” trong các cơ thể sống ATP (adenosin triphosphate), là thành phần chủ yếu trong màng tế bào (phospholipid), muối canxi phốtphat làm cứng xương động vật… Do độ hoạt động hóa học cao, không bao giờ người ta tìm thấy

nó ở dạng đơn chất trong tự nhiên và vì thế các cơ thể sống không thể hấp thụ P ở

dạng các hợp chất này

Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng dự trữ chủ yếu của

phospho trong tự nhiên, có mặt nhiều trong các loại ngũ cốc, hạt của các cây họ đậu

và hạt lấy dầu (Axit phytic chiếm hơn 80% lượng P trong các thực vật này) và đây

là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho người và động vật Axit phytic có khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại tạo nên các muối (phytate: muối của axit phytic với Na+, phytin: muối của axit phytic với Ca2+, Mg2+) và các hợp chất khác như axit amin, protein, làm ức chế các enzyme tiêu hóa, ngăn cản sự hấp thu các chất này của các cơ thể sống Vì thế axit phytic được coi là một yếu tố kháng dinh dưỡng (an anti-nutrient compound) trong thức ăn và thực phẩm

Phytase là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân các muối của axit phytic (phytate, phytin) giải phóng ra orthophosphate và myo-inositol-6-phosphate và các cấp độ thấp hơn của phản ứng phosphoyl hóa Việc sử dụng phytase không chỉ làm tăng khả năng hấp thu phospho vô cơ mà còn tăng khả năng hấp thu các nguyên tố khoáng và khả năng tiêu hóa các hợp chất khác Do đó dùng phytase để thủy phân, loại bỏ axit phytic trong thành phần thức ăn là rất cần thiết

Ở các động vật nhai lại, axit phytic được phân giải bởi các phytase do khu hệ

vi sinh vật kị khí như nấm và vi khuẩn sống trong dạ cỏ sinh ra Nhưng những động vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không thể sử dụng muối phytate vì trong đường tiêu hóa của chúng thiếu hụt enzyme quan trọng này Bởi vậy, người ta thường bổ sung phốt pho vô cơ (Pi) vào trong thức ăn để đáp ứng nhu cầu P cho cơ thể, nhằm đảm bảo cho động vật sinh trưởng, phát triển bình thường Tuy nhiên, bổ sung Pi không làm giảm được hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic mà còn gây ô nhiễm môi trường do P dư thừa thải qua phân động vật Đồng thời làm tăng chi phí khẩu phần thức ăn Vì vậy, giải pháp tốt nhất thay thế cho việc bổ sung Pi là thêm phytase vào thức ăn của vật nuôi, nhằm phân giải phytate thực vật sẵn có trong thức ăn, giải phóng Pi dễ hấp thụ cho vật nuôi cũng như các yếu tố dinh dưỡng và khoáng khác Ngoài ứng dụng vào trong thức ăn chăn nuôi, phytase còn được sử dụng cho thực phẩm ở người, trong điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm, ứng dụng trong công nghiệp giấy và cải tạo đất trồng Bởi thế, việc nghiên cứu sản xuất phytase đã và hiện đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học

Với tầm quan trọng trong ứng dụng cho ngành chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã đưa phytase vào danh mục thức ăn chăn nuôi được nhập khẩu theo Quyết định số 88/2008/QĐ-BNN ngày 22/8/2008 Chính vì vậy, những nghiên cứu về sản xuất phytase giá thành thấp thay thế phytase nhập khẩu đang được nhiều nhà khoa học trong nước quan tâm Chúng ta đã biết đến phytase từ

Aspergillus niger với rất nhiều ưu điểm như: bền nhiệt, khả năng hoạt động ở pH

axit; hoạt tính cao; chống chịu được tác động của các proteinase trong hệ tiêu hóa của vật nuôi Tuy nhiên việc tìm kiếm các loài vi sinh vật khác có khả năng sinh enzyme phytase cũng là một việc rất cần thiết

Với đặc điểm là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có sự đa dạng lớn

về địa hình và hệ sinh thái tạo nên sự đa dạng phong phú của các loài vi sinh vật, cũng như do nhu cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại,

chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh

enzyme phytase” nhằm tìm kiếm các loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme

phytase cao và là các chủng an toàn, đáp ứng nhu cầu trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi và thực phẩm

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE

Các thuật ngữ axit phytic, phytate và phytin lần lượt để chỉ axit phytic tự do, muối của axit phytic với Na+ và muối của axit phytic với Ca2+, Mg2+ Trong nhiều tài liệu, thuật ngữ axit phytic và phytate, phytin được sử dụng lẫn nhau và phần lớn phospho tổng số trong các loại hạt tồn tại dưới dạng phytate, đây là dạng dự trữ

chính của phospho trong ngũ cốc, hạt đậu và các mô thực vật khác [111]

1.1.1 Cấu trúc của axit phytic

Axit phytic lần đầu tiên được Hartig tìm thấy năm 1855-1856 ở dạng hạt nhỏ, không phải là tinh bột trong các hạt của một số loài thực vật [43, 44] Sau Hartig, cũng đã có nhiều nhà nghiên cứu tìm thấy phytate dưới dạng “globoid” (dạng cầu)

và khẳng định thành phần hóa học chính của nó là C, P và các ion kim loại Năm

1897 Winterstein đưa ra tên là axit inositol-phosphoic và sau đó năm 1968 được duyệt lại là ‘myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis (dihydrogen) phosphate (IP6) bởi IUPAC-IUB [44, 110]

Cấu trúc của phytic axit là đối tượng tranh cãi của ngành hóa học trong nhiều năm ở thế kỷ 20 và cuối cùng 2 cấu trúc do Neuberg và Anderson đề xuất được chấp thuận nhiều nhất [87, 88] Nhiều ý kiến khác nhau cho rằng chúng là dạng đồng hình và có hay không 3 phân tử nước gắn kết trong cấu trúc này, thì sau đó với những phân tích về nguyên tử, chuẩn độ natri phytate với các ion kim loại, tinh thể học tia X và cộng hưởng từ hạt nhân đã dẫn đến kết luận rằng cấu trúc do Anderson

đề xuất là dạng chiếm ưu thế hơn được tìm thấy trong các loài thực vật [43]

(A) (B) Hình 1 Cấu trúc của axit phytic được đề xuất bởi Neuberg, 1908 (A) và

Anderson, 1914 (B) [4, 87, 88]

1.1.2 Sự phân bố phytate trong tự nhiên và chức năng của phytate

Phytate là một hợp chất có mặt ở nhiều loại thực vật khác nhau, chúng chiếm đến 1-5% khối lượng các cây họ đậu, ngũ cốc, các hạt chứa dầu và hạnh nhân Hầu hết các loại thức ăn có nguồn gốc thực vật chứa 50-80% hàm lượng phospho tổng

số dưới dạng phytate Ở thực vật, phytate được tìm thấy đầu tiên ở các loại hạt tuy nhiên vị trí của chúng trong hạt lại khác nhau ở các loài thực vật khác nhau, ở ngô tới 90% phytate tập trung ở phần mầm của hạt, trong khi đó ở lúa mỳ và gạo, phytate tập trung chủ yếu ở lớp vỏ aleurone của hạt và cám bên ngoài [43, 44, 91,

92, 109] Phytate trong các hạt chứa dầu và hạt các cây họ đậu thường liên kết với các protein và tập trung chủ yếu trong các thể cầu (globoid), các thể vùi phân bố trong toàn bộ hạt, ngược lại phytate ở hạt đậu nành lại có mặt ở những vị trí không

đặc trưng [109] Ngoài ra phytate có thể được tìm thấy ở rễ, thân, quả, lá…và hạt

phấn của một số loài thực vật [10, 42, 51, 108, 122] Trong số các loài thực vật được sử dụng làm thức ăn gia súc, cây vừng, bí ngô, lanh có hàm lượng IP6 cao nhất tính theo khối lượng khô, có thể lên đến 3,7-4,7% [66] Các loại thức ăn gia súc khác IP6 chiếm 1-3% trọng lượng khô [18]

Bảng 1 Hàm lượng phospho và phytate ở 1 số loại thức ăn gia cầm phổ biến

(Tyagi và cộng sự, 1998) Thành phần P tổng số (%) P dạng phytate (%)

axit phytic còn đóng vai trò là chất kháng nấm trên các cánh đồng, ngăn ngừa sự sản sinh aflatoxyn ở các hạt đậu nành nhờ sự gắn kết với Zn2+ [39]

IP6 có thể được tìm thấy trong nhân hồng cầu ở các loài chim, cá nước ngọt và rùa, cũng như được tìm thấy trong các loại đất hữu cơ [17, 27] Ngoài ra, các phân

tử dưới IP6 trong quá trình phosphoyl hóa như IP5, IP4, IP3, IP2 và cả IP6 cũng tham gia vào quá trình truyền tín hiệu tế bào và hệ thống vận chuyển phosphate có mặt ở hầu hết các mô động và thực vật [79] Ở thực vật quá trình tổng hợp IP6 diễn ra thường xuyên tuy nhiên đã có những bằng chứng chứng minh rằng ở người đôi khi

có sự tổng hợp IP6 từ D-glucose nhờ hoạt động của enzyme phosphoylase đối với inositol-phosphate từ sự đóng vòng của glucose-6- phosphate Một số loại mô của động vật có vú như tinh hoàn, tuyến vú, não, gan, thận có thể tổng hợp 4g IP6 mỗi

ngày [41, 112]

1.1.3 Đặc tính kháng dinh dưỡng của axit phytic

IP6 là một cấu trúc tích điện âm ở dải pH rộng nên dễ dàng kết hợp với các ion tích điện dương như các ion kim loại, các hợp chất tích điện âm hình thành các phức khó tan làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thụ các chất này trong ruột non Do đó phytate được coi là một hợp chất kháng dinh dưỡng (an anti-nutritional compound)

[138] Trong các điều kiện trung tính hoặc kiềm nhẹ, các ion kim loại thiết yếu như

Ca2+, Zn2+, Fe2+ có mặt trong thức ăn có thể liên kết với axit phytic và hình thành nên các phức IP6-kim loại kết tủa xuống Độ bền vững của các kết tủa này theo thứ tự: Zn2+> Cu2+>Co2+> Mn2+> Ca2+, trong khi đó ở pH 7,4 thứ tự này có thể là là:

Cu2+> Zn2+> Ni2+> Co2+> Mn2+> Fe2+> Ca2+ [69, 150] Các ion kim loại có thể tương tác với các nhóm OH- của cùng một nhóm phosphate hoặc các nhóm phosphate khác nhau trong phân tử IP6, thậm chí ion kim loại có thể liên kết với các nhóm phosphate của các phân tử IP6 khác nhau Sự không hòa tan của các phức này cũng là nguyên nhân chính gây ra giảm khả năng hấp thu các ion kim loại trong các khẩu phần ăn có chứa hàm lượng axit phytic cao Ngoài ra, sự có mặt đồng thời của

2 ion kim loại khác nhau làm tăng quá trình kết tủa của các phức IP6-kim loại [126]

Sự ảnh hưởng của IP6 tới khả năng hấp thụ các ion kim loại này còn phụ thuộc vào

các yếu tố khác như cách thức chế biến thức ăn, các loại IP6 khác nhau, sự có mặt của các yếu tố khác cũng có tương tác với ion kim loại (yếu tố cạnh tranh với IP6) như cellulose, axit oxalic, tannin, sự có mặt của phytase trong ruột hoặc phytase vi khuẩn hay quá trình thích nghi trao đổi chất của cá thể với khẩu phần ăn giàu phytate [138]

Hình 2 Sự tương tác của các ion kim loại với IP 6

Sự hình thành phức giữa IP6 và canxi gây ra hiện tượng kháng vôi hóa (anticalcifying) dẫn đến loãng xương (hình thành các vách trống trong xương) ở chó

và người [78, 151] Tuy nhiên theo các nghiên cứu năm 1951 của Walker và cộng

sự, dưới cùng một điều kiện, hàm lượng axit phytic trong khẩu phần ăn có ảnh hưởng đến sự hấp thụ Ca2+

nhưng sự ảnh hưởng này không phải là mãi mãi, con người có thể thích nghi với các khẩu phần ăn có hàm lượng phytate cao và tự điều chỉnh sau một thời gian ngắn nên hàm lượng canxi hấp thụ được không có sự khác

biệt giữa chế độ ăn thông thường và chế độ ăn khi thí nghiệm [151]

Một báo cáo cũng đã nêu ra tình trạng suy dinh dưỡng ở quần thể dân cư ở vùng bắc Ấn Độ, Pakistan, Iran và trong số những người Ả-rập du cư có liên quan đến loại thức ăn chính làm từ ngũ cốc không lên men là chapatis (1 loại bánh mỳ không có men) có chứa 1 lượng lớn phytate [113, 154]

Sự thiếu hụt magie liên quan tới khẩu phần ăn có hàm lượng phytate cao cũng

đã được đề cập tới ở gà và chuột [77, 117] Bên cạnh đó các triệu chứng sự thiếu hụt kẽm do khẩu phần ăn có hàm lượng phytate cao cũng đã được nghiên cứu ở người,

gà, lợn và chuột [23, 30, 68, 69, 89, 90] Do các phức IP6-Ca-Zn ít hòa tan hơn so với các phức IP6-Zn tương ứng nên sự hình thành của phức IP6-Ca-Zn thậm chí còn kích thích các triệu chứng của sự thiếu hụt kẽm [15,138] Ngoài ra khi bổ sung natri phytate vào bánh mỳ trắng hoặc sữa cũng làm giảm sự hấp thụ sắt ở người xuống 15 lần [127] Đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng phytate không có ảnh hưởng tới sự hấp thu sắt ở động vật mặc dù protein đậu nành (có chứa hàm lượng lớn phytate) được cho là nguồn thức ăn giàu sắt [131] Sau này những nghiên cứu của các nhà khoa học đã tìm ra rằng dạng tồn tại chính của sắt ở trong cám lúa mỳ và đậu nành

là dạng mono, có khả năng sử dụng được trực tiếp cao, tương tự như khẩu phần ăn

có bổ sung sắt vô cơ hoặc ammoni sulfate sắt [82] Sự bổ sung 1% phytate vào chế

độ ăn có albumin trứng làm giảm đáng kể khả năng hấp thụ đồng và mangan ở

chuột [24]

IP6 là một cấu trúc tích điện âm nên IP6 còn có khả năng tương tác trực tiếp với các nhóm tích điện dương hoặc gián tiếp với các nhóm tích điện âm của các protein tích điện dương có mặt trong thức ăn thông qua các ion kim loại tích điện dương như Ca2+

để hình thành nên các phức IP6- protein tích tụ lại và kết tủa xuống,

do đó làm giảm khả năng tiếp xúc với protease, dẫn đến giảm hiệu quả tiêu hóa protein [14, 18, 58, 111, 130, 138, 146] Bên cạnh đó, tính tan kém của protein còn

do bị axit phytic bao phủ điện tích dương làm thay đổi điểm đẳng điện của protein [59, 111] IP6 có thể tạo phức với một số protein trong lúa mỳ, cám yến mạch, đậu, mầm ngô, vỏ đậu nành, bột vừng, đậu nành, lạc cũng như hạt bong [31, 92] Sự hình thành phức giữa IP6-ion kim loại- protein dưới điều kiện trung tính hoặc kiềm khá kém bền nhưng có thể dẫn tác động đồng thời gây thiếu hụt khoáng và giảm hiệu quả tiêu hóa protein Tuy nhiên cũng đã có những nghiên cứu in vivo và nghiên cứu

in vitro ở động vật và người cho kết quả âm tính về tác động của IP6 với khả năng tiêu hóa protein, do đó ảnh hưởng của IP6 đối với khả năng tiêu hóa protein vẫn còn nhiều tranh cãi

Ngoài khả năng tương tác với các ion kim loại, protein, IP6 còn có khả năng tạo phức trực tiếp (nhờ sự hình thành liên kết hydro) hoặc gián tiếp với tinh bột (thông qua các phân tử protein) để hình thành nên các phức IP6- tinh bột làm giảm

hiệu quả tiêu hóa tinh bột, gây ra sự giảm đường huyết [137] Ngoài ra sự tạo phức đồng thời giữa IP6 và protein, tinh bột có thể làm giảm sự tiêu hóa những chất này

từ khẩu phần ăn [5] Tuy nhiên, sự tương tác giữa IP6 và tinh bột vẫn chưa chi tiết

và vẫn cần rất nhiều các nghiên cứu invivo

(A) (B)

Hình 3 Liên kết của IP 6 với protein và tinh bột trực tiếp (A) hoặc gián tiếp (B)

Bằng cách liên kết với các ion kim loại, protein IP6 gián tiếp làm suy giảm hoạt tính của một số các enzyme như protease, các enzyme tiêu hóa khác mà cần các ion kim loại cho sự hoạt động cũng như tính bền vững của chúng Một số các metalloenzyme như cacboxypeptidase, leucine aminopeptidase, amylase, phosphates kiềm và aminopeptidase chứa kẽm hoặc canxi có mặt một lượng nhỏ trong ruột và cần thiết cho quá trình phân giải thức ăn Phức IP6-Cu có thể làm giảm tới 95% hoạt tính của cacboxypeptidase A do thay thể Cu2+ bằng Zn2+ trong phân tử

enzyme ở pH 7,5 [75, 124, 147] IP6 và EDTA có khả năng làm giảm hoạt tính của

α-amylase ở mức độ tương đương nhau [52] Canxi là yếu tố tham gia vào quá trình

tự xúc tác của trypsinogen thành trypsin và sự bền vững của trypsin Do đó, khi IP6liên kết với Ca2+ thì sự sản sinh và tính bền vững của trypsin bị ảnh hưởng Sự suy giảm của enzyme phosphatase kiềm trong ruột và phytase trong ống dạ dày-ruột của các động vật dạ dày đơn là do chế độ ăn nhiều canxi trong đó có sự hình thành phức

IP6-Ca [71] Ngoài ra, các enzyme thymidinine kinase cũng bị ức chế mạnh mẽ bởi

sự liên kết IP6-Zn trong chế độ ăn chứa hàm lượng phytate cao [102]

1.1.4 Ảnh hưởng của phytic tới môi trường

Thực vật cần phospho vô cơ (Pi) cho sự sinh trưởng của chúng và thực vật tích trữ phytate trong hạt, rễ và các mô trong suốt thời gian chín IP6 cần được phân giải trở lại thành dạng Pi cung cấp cho đất và do đó khép kín chu trình phospho Tuy nhiên, sự có mặt quá nhiều của Pi, đặc biệt là khu vực nước bề mặt có thể gây ra hiện tượng phú dưỡng (eurotrophication), đây là một dạng mất cân bằng sinh trưởng của tảo và các thực vật thủy sinh khác dẫn tới sự thất thoát oxy, gây ảnh hưởng đến các môi trường nước hiếu khí khác Vì vậy, sự mất cân bằng hệ sinh thái nước là tác động chính về mặt môi trường khi hàm lượng phospho được giải phóng vào nước quá giới hạn [149]

Phytate có mặt trong khẩu phần ăn của người, lợn, gia cầm và các động vật dạ dày đơn khác, thường được thải ra ngoài qua phân Ngày nay cùng với sự phát triển rộng của các nông trại nuôi gia cầm, gia súc, vấn đề phân thải ngày càng được quan

tâm Con người và các động vật dạ dày đơn không có enzyme phytase trong ruột và

do đó sự thủy phân phytate trong ống ruột-dạ dày là nhờ hoạt động không đặc hiệu của enzyme phosphatase ở ruột hoặc vi khuẩn ở ruột [24, 41, 70] Vì thế mà việc cung cấp Pi vào trong khẩu phần ăn nhằm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng là một việc phổ biến, tuy nhiên việc làm này lại làm tăng giá thành thức ăn và tăng lượng IP6, Pi giải phóng ra môi trường Các vi sinh vật có mặt trong đất, nước có các loại enzyme thủy phân phytate khác nhau góp phần vào sự thủy phân phytate trong rác thải chăn nuôi [128, 148, 149] Khi IP6 và Pi trở lại các thủy vực sẽ gây ra hiện tượng tảo nở hoa, sự giảm oxy và sự chết của các thủy sinh vật, bên cạnh đó là vấn đề ô nhiễm về mùi cũng khá phổ biến [72]

1.2 PHYTASE

1.2.1 Chức năng của phytase

Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme đặc

biệt trong số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân từng bước axit phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (Pi) và các myo-inositol phosphate trung gian (IP5, IP4, IP3, IP2, IP1) [149]

Hình 4 Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân phytate

1.2.2 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của phytase

Khối lượng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa trừ phytase

từ Klebsiella aerogenes có 2 dạng phân tử cảm ứng [134] Phytase từ eukaryote như

nấm men, nấm sợi, thực vật và động vật thường được glycosyl hóa và có khối lượng phân tử cao hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm, khoảng 500 kDa đối với phytase của nấm men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và

phytase ít có liên quan tới nhiệt độ tối ưu của phytase, hầu hết các loại phytase đều

bị bất hoạt ở nhiệt độ 40-65oC như phytase của S castellii [96] Phytase của A fumingatus chỉ giảm 10% hoạt tính sau 10 phút xử lý ở 100oC nhưng bắt đầu bất hoạt ở 60oC [143] Do các thức ăn thương mại thường được đóng viên ở nhiệt độ cao 60-80oC, các loại phytase bền nhiệt như ß-propeller phytase từ Bacillus amyloliquefaciens DS11 (với nhiệt độ nóng chảy là khoảng 80oC), phytase của

Bacillus sp MD2 và phytase của A fumingatus thực sự có ý nghĩa thực tiễn [139,

140]

Hầu hết các HAP phytase có khoảng pH hoạt động tối ưu từ 4-6 ngoại trừ pH

tối ưu của phyB từ Aspegillus niger là 2,5 [64, 96, 148] PhyA của Aspegillus niger

có 2 điểm pH tối ưu là 2,5 và 5,5; phytase ß-propeller có pH tối ưu trong khoảng 7,5 [20, 54, 57, 139] Vì thế HAP có thể hoạt động trong đoạn trên ống ruột của động vật – nơi mà pH axit chiếm ưu thế còn phytase ß-propeller có thể hoạt động tốt trong đoạn sau của ống ruột – nơi có pH kiềm và trung tính chiếm ưu thế Khả năng chống chịu pH thấp trong dạ dày động vật là một điều rất quan trọng, các phytase HAP khá bền trong điều kiện pH axít trong khi đó phytase ß-propeller

6-không thể hoạt động ở pH thấp nhưng lại khá bền ở pH thấp [57, 139, 141]

Khả năng bền với các protease là một điều rất quan trọng của các phytase khi chúng được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm hoặc thức ăn Tính bền

protease của phytase từ E.coli cao hơn so với tính bền protease của phytase từ A niger [49, 118, 125] Phytase của các loài thuộc chi Bacillus biểu hiện tính bền

mạnh với papain, pancreatin và trypsin nhưng lại khá mẫn cảm với pepsin [55, 141]

Hoạt tính và độ bền của phytase ß-propeller khá phụ thuộc vào nồng độ Ca2+

và EDTA là chất ức chế tới hoạt tính của enzyme [40, 55 95, 129] Mặt khác, hoạt tính của phytase HAP thường tăng nhẹ khi có mặt của EDTA NaCl với nồng độ 500mM có thể giảm bớt sự chênh lệch giữa 2 pH hoạt động tối ưu (2,5 và 5,5) của

phytase từ Aspergillus niger cũng như làm thay đổi pH tối ưu của phytase E coli từ 5,5 đến 2 [143]

1.2.3 Nguồn phytase trong tự nhiên

Enzyme phytase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật,

năm đó Kim và cộng sự đã tách chiết được phytase từ vi khuẩn Citrobacter braaki

Ngoài ra, phytase còn được tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn khác như:

Obesumbacterium proteus, vi khuẩn đất Klebsiella sp ASR1 và một số loài của chi Bifidobacterium [65]

Có khoảng trên 200 loại nấm thuộc các chi như Aspergillus, Penicillium, Mucor và Rhizopus có khả năng sinh tổng hợp phytase và hầu hết các loài này đều sản sinh phytase ngoại bào trong đó Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp phytase cao nhất Aspergillus niger NRRL 3135 có khả năng sinh tổng hợp hai loại

phytase thích hợp ở 2 pH khác nhau là pH 5,5 và pH 2, nhiệt độ tối ưu là 55oC,

Aspergillus ficuum NRRL 3135 có thể sinh tổng hợp phytase trong lên men xốp sử

dụng cơ chất là bột canola Ngoài ra các loại phytase chịu nhiệt còn được tìm thấy ở

một số loài nấm chịu nhiệt như Thermomyces lanuginosus, Sporotrichum thermophile Ở nấm men, phytase ngoại bào được tìm thấy ở các loài như Schwanniomyces castellii, Arxula adeninivorans, Pichia spartinae và P rhodanensis, Saccharomyces cerevisia, phytase nội bào được tìm thấy ở P anomala, trong đó Arxula adeninivorans là một trong hiếm các loài nấm men có

khả năng đồng hóa phytate như là một nguồn cacbon và phosphate duy nhất [149] Năm 1992, Freund và cộng sự đã phát hiện ra sự có mặt của phytase ở động

vật nguyên sinh Paramecium tetraurelia với kích thước 240 kDa, hoạt động tối ưu

ở pH 7 và không cần các ion kim loại hóa trị II trong quá trình hoạt động và thứ tự phân cắt nhóm phosphate là vị trí số 6, 5, 4, và 1 trên vòng inositol [65]

1.2.4 Phân loại phytase

Năm 1907, Suzuki và cộng sự lần đầu tiên tách chiết được enzyme phytase và

kể từ đó tới nay đã có rất nhiều loại enzyme phytase được phát hiện ra và mô tả Theo hiệp hội hóa sinh quốc tế (The International Union of Biochemists) hiện nay phytase được chia ra làm 2 loại chính là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC

3.1.3.26), dựa trên vị trí cắt nhóm phosphate ở vị trí số 3 hoặc 6 của vòng inositol

khi phản ứng khử nhóm phosphate được bắt đầu [50] Như vậy, sản phẩm của phytase trong lần cắt đầu tiên là Pi + myo-inositol 1,2,4,5,6-pentakisphosphate, sản

3-phẩm của 6-phytase trong lần cắt đầu tiên là Pi + myo-inositol pentakisphosphate sau đó các myo-inositol pentakisphosphate gắn trở lại phytase và giải phóng ra các Pi tiếp theo, ngoài ra 6-phytase có thể cắt hoàn toàn 6 Pi của phytate còn 3-phytase thì không cắt được hoàn toàn [149, 155] Enzyme 3- phytase thường được sản sinh bởi các vi sinh vật còn enzyme 6-phytase có mặt nhiều trong thực vật, tuy nhiên cũng có một số ngoại lệ phytase của đậu nành là 3- phytase,

1,2,3,4,5-phytase của Escherichia coli là 6-1,2,3,4,5-phytase [34, 86, 110]

Phytase còn được phân loại dựa trên pH hoạt động tối ưu, theo căn cứ này

phytase được chia thành 3 loại: phytase ưa axit, ưa kiềm và trung tính [84]

Ngoài ra, dựa vào cấu hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase được phân thành 3 loại khác nhau là: histidine axit phosphatase (HAP) phytases, ß-propeller phytase (BPP) và purple axit phosphatase (PAP) phytases [84] Oh và cộng sự căn cứ trên trình tự aminoaxit và các thuộc tính hóa sinh lại phân loại phytase thành 2 loại chính là: HAPs và phytase kiềm với 4 nhóm phụ là PhyA, B,

C, D tuy nhiên phytase thực vật không có trong cách phân loại này [96]

Hầu hết các loại phytase được tìm thấy là các monomer, trừ trường hợp ngoại

lệ phyB của Aspergillus niger và phytase PL của Penophora lycii là các protenin

tetrameric và dimeric [60, 96, 145]

1.2.4.1 Histidine axit phosphatase (HAP)

Histidine axit phosphatase (HAP) là nhóm phytase được nghiên cứu rộng rãi

nhất, bao gồm phytase ở prokaryote như appA phytase của Escherichia coli và eukaryote như phyA và B của các loài thuộc chi Aspergillus sp., phytase HAP của

nấm men và thực vật Tất cả các HAP phytase đều có chung một cơ chế xúc tác và vùng hoạt động Kiểu trình tự vùng hoạt động gồm trình tự bảo thủ RHGXRXP ở phần đuôi N và kiểu HD ở đuôi C trong trình tự amino axit HAP được phân thành 2 loại khác nhau dựa trên tính đặc hiệu cơ chất của chúng: nhóm thứ 1 gồm các HAP

có tính đặc hiệu cơ chất rộng tương đương với hoạt động đặc hiệu thấp đối với phytate, nhóm thứ 2 gồm các HAP có tính đặc hiệu cơ chất hẹp và do đó hoạt động đặc hiệu cao đối với phytate Tính đặc hiệu cơ chất này được quyết định bởi cấu trúc vùng đặc hiệu cơ chất của mỗi enzyme

HAP có thể bắt đầu phản ứng thủy phân IP6 ở vị trí nhóm P thứ 3 đối với phyA

và phyB hoặc ở vị trí nhóm P thứ 6 đối với phytase appA của E coli và phytase PL

từ Penophora lycii Sản phẩm cuối cùng của phytase HAP là các gốc Pi và inositol

monophosphate [84, 140]

Hình 5 Cấu trúc không gian của phyA từ Apergillus niger NRRL 3135

(Kostrewa và cộng sự, 1997) 1.2.4.2 ß-propeller phytase (BPPhys)

Các phytase thuộc nhóm này bao gồm các phytase của các loài thuộc Bacillus spp, hạt phấn của Thypha lattifolia và Lilium longiflorum Các trình tự gen mã hóa cho enzyme phytase của chi Bacillus đã được công bố nhiều tuy nhiên chỉ cấu trúc protein của phytase của Bacillus amyloliquefaciens DS11 đã được công bố Khác

với HAP, ß-propeller phytase không sở hữu trình tự amino axit đặc trưng là RHGXRXP và HD, mà có 2 vị trí riêng biệt gắn Ca2+ trong đó 3 ion Ca2+ gắn vào vùng có ái lực với canxi cao và 3 ion Ca2+ gắn vào vùng có ái lực với canxi thấp, do

đó phytase loại này được gọi là các metallo-enzyme Điều này khiến cho ß-propeller phytase được gọi là một metallo- enzyme và có thể dẫn đến các cơ chế thủy phân phytate khác nhau Mặc dù trình tự phytase β-propeller rất đa dạng (độ tương đồng 65-99%) nhưng chúng vẫn bảo thủ ở 2 vị trí gắn canxi Không giống như cấu trúc của HAP, phytase ß-propeller chứa 6 tấm dạng β được sắp xếp thành 6 hướng giống như chân vịt (hình 6) tạo nên các khe hoạt tính hẹp tích điện âm cao Mỗi tấm trong phân tử enzyme phytase β-propeller chứa 4 tới 5 chuỗi β không cùng chiều, và

chuỗi thứ tư của mỗi tấm có liên kết với chuỗi đầu tiên của tấm tiếp theo, tấm thứ 6 được đặt dọc theo trục trung tâm của chân vịt Tấm thứ 6 có chứa 1 chuỗi β từ đuôi

N và 3 chuỗi β từ đuôi C của phân tử protein, tham gia vào cả 2 phần đuôi của phân

tử protein và góp phần vào sự bền vững của enzyme Ngoài ra một chuỗi β bổ sung

từ đuôi N kết nối tấm thứ 5 và tấm thứ 6, được cho là có vai trò góp phần vào sự bền vững của enzyme, cùng với 3 ion Ca2+ ở vị trí có ái lực cao với Ca2+ làm tăng

độ bền nhiệt của phytase β-propeller từ Bacillus amyloliquefaciens DS11 [40, 95,

Klebsiella terrigena và K aerogenes, chưa được mô tả chi tiết, tuy nhiên đã có

những nghiên cứu cho rằng chúng là các monomer 3 phyatse có 2 dạng cảm ứng Dạng lớn hơn với kích thước 700 kDa và dạng nhỏ hơn 10-13 kDa, với 2 pH tối ưu khác nhau (5,2 và 4,5), đây là phân đoạn protein nhỏ nhất được biết đến có biểu hiện hoạt tính phytase [97, 140]

1.2.5 Gen mã hóa phytase

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã giải mã trình tự gen phytase

của một số chủng vi sinh vật Gen mã hóa phytase từ Apergillus niger var awamori

có tới hơn 97% tương đồng với gen phytase từ A niger NRRL 3135 (phyA) Trình

tự phyA này có độ tương đồng 65% với gen phytase của A fumigatus, 62% của A terrus, 62% của Emericella nidulans, 61% của Thermus thermophilus và 46% của Methanosaeta thermophila Protein PhyB của A niger NRRL 3135 có 99% trình tự axit amin tương đồng với protein tương ứng của A niger var awamori Tuy nhiên hai loại phytase của A niger NRRL 3135 (PhyA và PhyB) lại chỉ có 25% độ tương

mã hóa phytase của ngô là PHYTI và PHYTII có trình tự gần giống nhau nhưng lại

rất khác biệt với các gen phytase khác Tuy nhiên, khi phân tích vùng gen mã hóa

33 axit amin của PHYTI và PHYTII, Maugenest và cộng sự (1997) cũng tìm được

sự tương đồng với phytase của A niger Vùng gen này có lẽ là điểm nhận biết vị trí

cắt nhóm phosphate trong axit phytic [76]

David và cộng sự (1997) đã xác định hai đoạn gen mã hóa phytase từ hai loại

nấm khác nhau là A terreus và Myceliophthora thermophila Khi so sánh với gen phyA của A niger cho thấy: phyA tương đồng tới 60% đối với gen mã hóa phytase của A terreus và 48% với gen mã hóa phytase của M thermophila [25] Gen mã hoá phytase của B amyloliquefaciens tương đồng 72% với gen ở B subtilis Gen phytase của Enterobacter sp có độ tương đồng 30-38% với Chryseobacterium meningosepticum và Streptococcus equisimilis, đặc biệt ở vị trí mã hóa lysine và tryptophan [98] Phytase từ B subtilis VTT E-68013 (phyC) không có điểm tương

đồng với các phytase khác, nó cũng không chứa trình tự axit amin bảo thủ RHGXRXP, mã hóa trung tâm hoạt động của các phytase đã được công bố Tuy nhiên, enzyme này thể hiện hoạt tính phân cắt liên kết phosphodiester trong axit phytic Có thể đây là một loại enzyme mới [55]

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất phytase từ vi sinh vật

1.2.6.1 Các yêu tố vật lý

Các yếu tố vật lý ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng của vi sinh vật cũng như sự sản xuất các sản phẩm trao đổi chất như nhiệt độ, pH, áp suất, chế độ khuấy, hàm lượng oxy hòa tan và thời gian nuôi cấy Các vi sinh vật sản xuất phytase hầu hết đều là các loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 25-37oC, ngoại trừ loài nấm chịu nhiệt Thermomyces lanuginosus, Talaromyces thermophilus và Sporotrichum thermophile [149]

Cùng với nhiệt độ pH cũng là yếu tố có ảnh hưởng rõ nét đến quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật, đối với vi khuẩn và nấm dải pH tối ưu này là 5-7, tính đến thời điểm hiện nay chưa có báo cáo nào về quá trình sinh tổng hợp phytase

ở điều kiện pH kiềm [149]

Chế độ thông khí, khuấy của môi trường đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo các thành phần môi trường, tế bào vi sinh vật và oxy được phối trộn đều Ở

loài Schwanniomyces castellii, quá trình sản xuất phytase diễn ra liên tục trong các

thiết bị lên men được thông khí ở tỷ lệ 1 v/v/m (thể tích khí/thể tích môi

trường/phút) và tốc độ khuấy 600 vòng/phút, quá trình sản xuất phytase của A niger, A ficuum NRRL 3135 và A terreus diễn ra trong điều kiện lắc 270 vòng/phút, Bacillus sp DS11 sản sinh phytase nhiều nhất ở chế độ lắc 230

vòng/phút [149]

Mittal và cộng sự (2012) đã nghiên cứu thời gian nuôi cấy của Klebsiella sp

DB-3 FJ711774.1 và nhận thấy: quá trình sinh tổng hợp phytase trên các loại cơ chất khác nhau của chủng này bắt đầu sau 30h nuôi cấy và đạt sản lượng phytase cao nhất sau 72 h nuôi cấy, sau khoảng thời gian này quá trình sinh tổng hợp phytase giảm, đây cũng là một ưu điểm của chủng này khi có thể sinh tổng hợp nhiều phytase sau một khoảng thời gian ngắn Thời gian sinh tổng hợp phytase cao

nhất cũng được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác như E coli là 14 h, Lactobacillus amylovorus B4552 là 32 h Đây là một đặc điểm quan trọng khiến các

chủng này được ưu tiên sử dụng trong việc sản xuất phytase quy mô thương mại

Nguyên nhân của sự giảm sinh tổng hợp phyatse sau 72 h có thể là do sự tăng sinh trưởng sinh khối tế bào làm giảm hàm lượng các yếu tố dinh dưỡng trong môi trường, cũng có thể là do sự ức chế tế bào hoặc biến tính protein do sự tương tác với các thành phần khác trong môi trường Ngoài ra thời gian nuôi cấy cho sản lượng phytase cao nhất này còn phụ thuộc vào tốc độ sinh trưởng và cơ chế điều khiển sinh tổng hợp riêng với từng loại enzyme [81, 149]

1.2.6.2 Các yếu tố dinh dưỡng

a/ Nguồn cacbon

Nguồn cacbon và nồng độ tối ưu của nguồn cacbon là một yếu tố quan trọng trong quá trình sản xuất phytase, glucose được coi là nguồn cacbon được sử dụng rộng rãi bởi nhiều vi sinh vật, nồng độ glucose 1% là nồng độ tối ưu cho quá trình

sản xuất phytase ở Lactobacillus amylovorus và Enterobacter sp 4, trong khi đó Bacillus subtilis thích hợp với nồng độ glucose 2% Cám lúa mỳ (6%) là nguồn cac bon tốt cho quá trình sản sinh phytase của Bacillus sp DS11 trong khi đó các loài Pseudomonas sp sử dụng myo-inositol (0,2%) như là một nguồn các bon duy nhất trong quá trình sinh trưởng và sản xuất phytase Klebsiella aerogenes sản sinh

phytase nhiều nhất trên môi trường chứa 2% natri phytate là nguồn các bon duy nhất Khi 2% glucose được thay thế bằng galactose trong môi trường peptone-

glucose- nấm men thì quá trình sinh tổng hợp phytase của Arxula adeninivorans tăng gấp mấy lần Schwanniomyces castellii ưa thích sử dụng galactose là nguồn

cacbon trong quá trình sinh tổng hợp phytase [149]

Đối với nấm, cao men và cao malt được sử dụng là nguồn cac bon, ở A niger

NRRL 3135, khi các nguồn cacbon đơn giản như glucose và sucrose được sử dụng thì các sự sinh trưởng hệ sợi mạnh mẽ và sản lượng phytase thấp, tuy nhiên đối với một số loại bột ngô nhất định, sự sinh trưởng hệ sợi giảm và hàm lượng phytase cao

hơn Aspergillus ficuum sản sinh phytase trong quá trình lên men pha rắn sử dụng

bột canola là cơ chất và khi bổ sung glucose 2% làm tăng quá trình sản xuất phytase [149]

và (NH4)2SO4 0,1% là nguồn nitơ trong quá trình sản xuất phytase Đối với A adeninivorans cao men 1% và peptone 1% là nguồn nitơ quan trọng [81, 149]

c/ Các nguyên tố vi lượng và vitamine

Ngoài nguồn cacbon và nitơ, quá trình sinh trưởng của một số vi sinh vật cần

bổ sung các nguyên tố vi lượng (các ion kim loại Mg2+, Zn2+,Mn2+, Cu2+, Fe2+ dưới dạng muối sulfate và Ca2+, Na+ dưới dạng muối chloride có nồng độ dưới 100 ppm)

và các vitamine, ví dụ như ở nấm men, trong quá trình sàng lọc chủng sinh phytase cần có các nguyên tố vi lượng và các vitamine, tuy nhiên việc bổ sung các nguyên

tố vi lượng và vitamine cho quá trình sinh tổng hợp phytase lại không cần thiết ở

các loài Bacillus subtilis, Bacillus sp DS11, E coli và các loài nấm như A niger ATCC 9142 và A ficuum NRRL 3135, thậm chí quá trình sinh tổng hợp phytase ở Saccharomyces castellii bị ức chế nhẹ bởi sự có mặt của 5 mM Ca2+, Mg2+,Mn2+ và

Fe2+ Tuy nhiên, phytase Bacillus subtilis cần Ca2+ để duy trì cấu trúc hoạt tính của chúng [81, 149]

1.2.7 Điều khiển sinh tổng hợp phytase

a/ Ảnh hưởng của nồng độ phospho

Hàm lượng phospho vô cơ trong môi trường cũng tham gia vào điều khiển quá trình sinh tổng hợp phytase Nguồn phospho được sử dụng phổ biến nhất cho quá trình sinh tổng hợp phytase là KH2PO4 và K2HPO4 Ở một số loài Bacilus, môi

trường nuôi cấy chứa KH2PO4 (0,05%) và K2HPO4 (0,04%), đối với Bacillus subtilis natri phytate (0,06%) được sử dụng cùng với KH2PO4 (0,1%) trong môi

trường nuôi cấy, còn ở S castellii natri phytate 0,06% được sử dụng như một nguồn

phospho Tuy nhiên ở một số loài nấm men và nấm mốc, sự có mặt của phytate ức chế quá trình sinh tổng hợp phytase Sản lượng phyatase ở nấm mốc khi sinh trưởng trên môi trường bột ngô phụ thuộc vào hàm lượng phospho có trong bột ngô, hàm lượng phospho cao trong bột ngô làm giảm quá trình sinh tổng hợp phytase ở nấm mốc Theo Zyta và Gogol (2002) sau khi loại bỏ photphate khỏi môi trường mật

đường thì hoạt động đặc hiệu của phytase cao gấp 7,3 lần ở chủng A niger AbZ4 Ở Lactobacillus amylovorus quá trình sinh tổng hợp phytase cao nhất ở môi trường bổ sung 240 mg/l photphate, ở Candida krusei quá trình sinh tổng hợp phytase cao

nhất khi môi trường nuôi cấy bổ sung 5 mg/100ml photphor và khi tăng cứ 5 mg trên 100 ml lại ức chế quá trình sinh tổng hợp này [149]

b/ Ảnh hưởng của hàm lượng phytate

Ảnh hưởng của phytate lên quá trình sinh tổng hợp phytase được nghiên cứu bằng cách thêm 0,2-1% phytate vào môi trường lên men Theo nghiên cứu của

Mittal và cộng sự (2012) đối với chủng Klebsiella sp DB-3 FJ711774.1 trên môi

trường sử dụng cám lúa mỳ và bột vỏ mỳ là cơ chất hoạt độ phytase lần lượt là 1,9 U/ml và 2,48 U/ml, trong khi đó khi môi trường sử dung phytate tinh khiết là cơ chất thì hoạt độ phytase 1,5 U/ml, điều này cho thấy rằng, cám bột mỳ và bột vỏ mỳ

là một trong các nguồn cơ chất tốt, rẻ tiền được sử dụng thay thế phytate đắt tiền để sản xuất phytase trong quy mô công nghiệp [81]

c/ Ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt

Ở chủng A niger NRRL 3135, khi glucose hay fructose được sử dụng là nguồn

cacbon duy nhất thì các cục hệ sợi được hình thành và quá trình sinh tổng hợp phytase thấp Ở môi trường có chứa chất hoạt động bề mặt như sodium oleate 0,5% (v/v) quá trình sinh trưởng giảm và sản lượng phytase cao gấp 4-7 lần so với đối

chứng Trong suốt quá trình sinh trưởng của A carbonarius trên môi trường lên

men pha rắn với cơ chất là bột canola, tốc độ sinh trưởng, sự sinh tổng hợp phytase

và quá trình phân giải phytic axit cao hơn so với mẫu đối chứng khi bổ sung các chất hoạt động bề mặt như Na-oleate và Tween-80, tuy nhiên Triton X-100 không

có ảnh hưởng gì tới quá trình sinh tổng hợp phytase [149]

d/ Ảnh hưởng của thành phần môi trường và tỷ lệ và tuổi giống cấy

Tỷ lệ cấy giống đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp phytase ở lên mên chìm và lên men pha rắn Tỷ lệ cấy giống quá nhỏ và độ nhớt của môi trường tương đối thấp, chúng có xu hướng hình thành các khối (cục) và quá trình sinh tổng hợp phytase thấp, đây cũng là một đặc điểm thường thấy ở các loài

vi sinh vật Ở các loài Klebsiella sp khi lên men chìm, tỷ lệ cấy giống 1,5% cho

sản lượng phytase cao nhất đối với mọi loại cơ chất [81] Tỷ lệ cấy giống trên 1,5% làm giảm sản lượng phytase sinh ra là do các yếu tố dinh dưỡng tập trung tăng cường cho quá trình sản xuất sinh khối Ngoài tỷ lệ cấy giống thì tuổi của giống có liên quan chặt chẽ với quá trình sản xuất phytase và sinh khối Do đó tỷ lệ cấy giống

và tuổi giống cần thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp phytase

1.2.8 Các ứng dụng của phytase

Dựa trên những đặc tính hóa lý và chức năng, phytase có rất nhiều ứng dụng khác nhau tập trung chính vào 2 lĩnh vực sau: sản xuất thực phẩm và thức ăn động vật trên quy mô công nghiệp, là công cụ trong các nghiên cứu hóa sinh Ngoài ra phytase còn được sử dụng nhiều trong việc phục hồi đất và bán tổng hợp peroxydase

1.2.8.1 Ứng dụng của phytase là phụ gia thức ăn chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản

Thực vật là thành phần chính trong thức ăn của các loại gia cầm, cá khoảng 2/3 hàm lượng phospho trong loại thức ăn có nguồn gốc thực vật này là phytic axit tồn tại dưới dạng muối phytate và gia cầm không thể hấp thụ được phospho ở dạng này Thêm vào đó sự có mặt của phytate trong thức ăn làm giảm sự hấp thu các ion khoáng cũng như một số hợp chất khác

Đối với các động vật nhai lại, do có hệ vi sinh vật khu trú trong ruột sinh tổng hợp phytase phân giải phytate giải phóng ra phospho vô cơ Tuy nhiên ở các động vật dạ dày đơn như người, gà, lợn chỉ sản xuất một lượng rất ít hoặc không sản xuất phytase trong ruột, do đó trong khẩu phần ăn cần được bổ sung phospho dưới dạng

đỗ tương và các loại bột khác cùng với phosphate tinh thể khá đắt tiền Bên cạnh đó, hàm lượng phytate dư thừa sẽ được thải ra ngoài qua phân động vật Phytate này sẽ

được enzyme phytase của các vi sinh vật khu trú trong đất, nước phân giải thành phospho vô cơ giải phóng vào các thủy vực, gây ra hiện tượng phú dưỡng và sự thiếu hụt oxy do sự phát triển mạnh mẽ của tảo [149]

Để khắc phục điều này trong thức ăn chăn nuôi người ta thường bổ sung enzyme phytase hoặc sử dụng các loại ngũ cốc giàu phytase Enzyme phytase làm giảm sự nhu cầu bổ sung phospho vô cơ, cải thiện việc sử dụng nguồn phospho hữu

cơ ở gia cầm và làm giảm đáng kể sự bài tiết phospho theo phân động vật ra ngoài môi trường Với sự bổ sung phytase khoảng 250 - 1000 U/kg có thể thay thế hoàn

toàn việc bổ sung phospho vô cơ [149] Vats và Banerjee đã ước tính rằng 250 g

phytase có thể thay thế 10 kg dicalcium phosphate bổ sung vào thức ăn động vật và

do đó nhu cầu phytase dùng cho chăn nuôi khoảng 200 tấn mỗi năm [148] Theo những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và thử nghiệm quy mô nhỏ, phytase 500-

1000 đơn vị có thể thay thế 1 g phospho vô cơ bổ sung và làm giảm sự bài tiết

phospho ra môi trường 30-50% [63, 158]

Tuy nhiên việc sử dụng phytase như là một phụ gia thực phẩm cũng gặp phải một số hạn chế như về mặt giá thành đắt hay bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao trong quá trình đóng viên thức ăn (80oC) hay sự mất dần hoạt tính trong quá trình bảo quản Những hạn chế này có thể được cải tiến nếu như phytase được sinh tổng hợp chính bởi lợn và gia cầm (nhờ các kỹ thuật di truyền) hoặc tìm kiếm/sản xuất các chủng

vi sinh vật có khả năng sản sinh phytase bền nhiệt, hoặc các kỹ thuật gây đột biến cấu trúc protein tạo ra phytase bền nhiệt hoặc bổ sung các hợp chất làm tăng tính bền nhiệt của phytase (như các loại muối, polyols, Ca2+) [149]

Bên cạnh khả năng bền nhiệt, khi sử dụng phytase là một phụ gia thức ăn động vật thì pH hoạt động tối ưu của phytase cũng là một vấn đề đáng quan tâm do phytase phải hoạt động được ở điều kiện pH trong ống tiêu hóa của động vật Những đột biến điểm được nghiên cứu đã khẳng định rằng sự thay thế Gly-277 và

Tyr-282 trong chuỗi polypeptide của phytase ở chủng dại A fumigates bằng Lys và His làm tăng pH hoạt động tối ưu từ 2.8 đến 3.4 [149]

1.2.8.2 Ứng dụng của phytase trong công nghiệp thực phẩm

Bên cạnh ứng dụng chính của phytase trong thức ăn chăn nuôi, phytase cũng

có nhiều ứng dụng trong quá trình chế biến và sản xuất thực phẩm cho con người [32] Trung bình người trưởng thành sử dụng khoảng 1 g inositol mỗi ngày từ thực vật và động vật [136] Lượng phytate lấy vào phụ thuộc vào lượng thức ăn có nguồn gốc thức vật, trung bình khoảng 2-2,6 g/ngày đối với những người ăn chay và những người sống ở các vùng ngoại ô của các nước phát triển, ngoài ra chế độ ăn giàu ngũ cốc, hạt đậu và đỗ tương cũng làm tăng hàm lượng phytate lấy vào [26, 35] Những người ăn chay hầu hết ăn các sản phẩm nguyên hạt và các loại ngũ cốc đóng hộp, những người già thường có chế độ ăn không cân bằng với một lượng lớn các loại ngũ cốc, những người sống ở các nước phát triển thường ăn những loại bánh mỳ không lên men, các trẻ em thường ăn thức ăn nhiều đậu nành cũng làm tăng lượng phytate vào cơ thể Như vậy với những tập tính ẩm thực khác nhau cũng

có chi phối rất lớn đến hàm lượng phytate vào cơ thể

Mặc dù đã có những nghiên cứu cho rằng phytate là một chất chống oxy hóa với hoạt tính kháng ung thư nhưng nó lại có những ảnh hưởng xấu liên quan tới sự thiếu hụt các nguyên tố khoáng mà ngày càng phổ biến ở một số nước phát triển và đang phát triển [113, 154] Chỉ có một lượng rất thấp hoạt tính phytase hoạt động trong ruột của người do đó cần bổ sung phytase trong quá trình chế biến thức ăn cũng như trong ống ruột dạ dày [48] Phytase được bổ sung vào thực phẩm phải có khả năng bền nhiệt để không bị biến tính trong quá trình chế biến và chịu được axit trong dạ dày cũng như với các enzyme tiêu hóa khác, mặt khác chúng có thể hoạt động trước khi chế biến và trong suốt thời gian bảo quản Sandberg và cộng sự đã

bổ sung phytase từ A niger vào bột mỳ chứa cám mỳ có thể làm tăng sự hấp thụ sắt

ở người [120] Một số nghiên cứu cho rằng, có thể tạo ra các loại thực vật có hàm lượng thấp phytate bằng cách gây đột biến ở ngô, lúa mạch, gạo, đỗ tương, tăng hàm lượng phytase ở hạt nhờ chuyển gen, ăn nhiều hơn các loại hạt đang nảy mầm,

sử dụng nấm men, các vi khuẩn lactic và các vi sinh vật khác có sản sinh phytase trong quá trình làm bánh mỳ, các thực phẩm lên men, sử dụng quá trình thủy phân phytate hiệu quả không cần enzyme trong suốt quá trình chế biến như ngâm nước,

loại bỏ nước nấu Sự bổ sung phytase vào quá trình sản xuất bánh mỳ không chỉ làm giảm hàm lượng phytate mà còn làm tăng hàm lượng Ca2+ giải phóng từ phức

IP6-Ca cho sự hoạt động của α- amylase, do đó gián tiếp làm tăng chất lượng bánh

mỳ Phytase từ thực vật và một số loại vi sinh vật an toàn như nấm men bánh mỳ, lactobacilli và bifidobacteria được ưa chuộng hơn cả do không gây các phản ứng đáp ứng miễn dịch ở người [35] Để cải thiện khả năng hấp thụ các nguyên tố khoáng, sự phân giải inositol hexakis- và pentakisphosphates là rất cần thiết Tuy nhiên, phytate và những dẫn xuất thấp hơn của chúng cũng có những ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe con người như phytate ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do (•OH), ức chế các phản ứng oxy hóa xúc tác bởi sắt do đó phytate được coi là một chất chống oxy hóa và chống ung thư ruột kết và ung thư vú [33, 48, 80] Một số lợi ích khác của phytate như cải thiện các đáp ứng glucose, giảm cholesterol và triglycerides màng, khử tính độc của các kim loại nặng như cadmium và chì cũng như là một liệu pháp tốt điều trị sỏi canxi và chống lại bệnh sâu răng [53, 116, 159]

Đã có nghiên cứu chỉ ra rằng cứ thêm 2% phytate vào nước uống có thể làm giảm tỷ

lệ mắc khối u ở chuột

1.2.8.3 Ứng dụng của phytase trong cải tạo đất

Ở một số vùng, hàm lượng phytic axit và các dẫn xuất của chúng chiếm tới 50% tổng số phospho hữu cơ trong đất Năm 1993 Findenegg và Nelemans đã nghiên cứu tác động của phytase lên khả năng hấp thu phospho từ phytic axit trong đất đối với ngô, tốc độ sinh trưởng của ngô tăng rõ rệt khi phytase được bổ sung vào trong đất Nghiên cứu này cũng gợi ý rằng sự biểu hiện của phytase trong rễ của thực vật chuyển gen làm tăng lượng phospho hấp thụ được đối với rễ [149]

1.2.8.4 Ứng dụng của phytase trong dược phẩm

Một số các dẫn xuất thấp hơn của myo-inositol phosphate được ứng dụng nhiều trong quá trình sản xuất dược phẩm Các dẫn xuất myo-inositol 1,2,3 tris phosphate và myo-inositol 1,2,3,6 tetrakis phosphate có đặc tính chống oxy hóa [45, 99] Rất nhiều các myo-inositol tris phosphate khác có liên quan đến sự truyền tín

hiệu qua màng tế bào và sự di chuyển Ca2+ từ nội bào [11] Các dẫn xuất của

myo-inositol phosphate có thể được tổng hợp bởi phytase của Saccharomyces cerevisiae

như D-myo-inositol 1,2,6-triphosphate, D-myo-inositol 1,2,5-triphosphate, inositol 1,3,4-triphosphate và myoinositol 1,2,3-triphosphate (Siren, 1986) hay bởi

L-myo-phytase E.coli như inositol 1,pentakisphosphate, inositol

2,3,4,5-tetrakisphosphate, inositol 2,4,5-trisphosphate và inositol 2,5-bisphosphate [36] Các dẫn xuất inositol phosphate được sử dụng như là chất làm bền enzyme, cơ chất của enzyme khi nghiên cứu trao đổi chất và là chất ức chế enzyme do đó có tiềm

năng ứng dụng trong sản xuất thuốc [149]

1.2.8.5 Bán tổng hợp peroxydase

Phản ứng bán tổng hợp peroxydase được thiết kế dựa trên sự tương đồng về cấu trúc vùng hoạt hóa của haloperoxydases phụ thuộc vanadium, phytase của nấm

và phosphatase axit Nhóm Delft kết hợp chặt chẽ ion vanadate vào trung tâm hoạt

động của phytase chủng A niger (ficuum) NRRL 3135, dẫn đến sự chuyển hoạt tính

thủy phân phospho tự nhiên của phytase sang peroxydase bán tổng hợp- xúc tác cho phản ứng oxy hóa chọn lọc ngược các prochiral sulfides Chỉ có phytase HAP với trình tự vùng hoạt hóa RHGXRXP có thể hoạt động như peroxydase khi ion vanadate được gắn vào vùng hoạt động Vanadium chloroperoxydase có cùng sự tương đồng về cấu trúc với các axit phosphate màng ngoài [149]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHYTASE

Nhờ những ứng dụng quan trọng của phytase trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn súc, gia cầm, hiện nay có rất nhiều những nghiên cứu về phytase tập trung nhiều vào các hướng như tăng sự bền nhiệt của phytase, thay đổi pH hoạt động tối

ưu của phytase, tăng cường khả năng kháng axit và protease của phytase, những nghiên cứu làm tăng hiệu suất của quá trình sản xuất phytase, phát triển động vật và thực vật có chuyển gen phytase…

1.3.1 Nghiên cứu làm tăng tính bền nhiệt của phytase

Hầu hết các phytase thực vật và vi sinh vật bắt đầu mất dần hoạt tính ở nhiệt

độ xung quanh 55-60o

C, ví dụ như Tm của phytase phyA của A niger là khoảng

63,3oC, sự biến tính đi kèm với sự thay đổi cấu trúc không phục hồi và mất 70-80% hoạt tính Như vậy, những hạn chế về khả năng chịu nhiệt một yếu tố quyết định đến việc ứng dụng phytase trong quá trình sản xuất thức ăn chăn nuôi cũng như thực phẩm do hầu hết các thức ăn chăn nuôi đều được đóng viên ở nhiệt độ khoảng 80-90oC (để tránh sự nhiễm khuẩn Salmonella) và các thực phẩm của người cũng

qua các quá trình chế biến như đun sôi hay nướng Chính vì thế mà những nghiên cứu mở rộng và phát triển được hướng trực tiếp đến việc sàng lọc các chủng ưa nhiệt và siêu ưa nhiệt sinh các enzyme chịu nhiệt, gây đột biến các enzyme ưa nhiệt trung bình để làm tăng tính bền nhiệt của chúng và thiết kế các cấu trúc vỏ hóa học bảo vệ enzyme khỏi sự biến tính của nhiệt độ Thành công đầu tiên của Lehmann và cộng sự năm 2000 đã tạo ra một loại phytase với nhiệt độ biến tính Tm=89,3oC từ

một loại phytase gốc của A fumigates là một loại phytase có nhiệt độ Tm chỉ là

62,5oC nhưng không có khả năng gấp nếp trở lại cấu trúc có hoạt tính cao ban đầu sau khi làm lạnh Có khoảng 12 yếu tố bên ngoài có ảnh hưởng đến tính bền nhiệt của phytase trong suốt quá trình đóng viên Tuy nhiên cũng có một số các thành phần bên trong hạt có thể bảo vệ hoạt tính phytase Skoglund và cộng sự (1997) đã chỉ ra rằng phytase có sẵn trong lúa mỳ- đậu Hà Lan- dầu hạt cải trong chế độ ăn của lợn không bị ảnh hưởng sau quá trình đóng viên ở 81oC Ở gạo chuyển gen biểu

hiện phytase của A fumigates được đun sôi trong 20 phút, chỉ 8% hoạt tính enzyme

ban đầu được giữ lại, hoạt tính này thấp hơn hẳn so với hoạt tính còn giữ lại của các chế phẩm enzyme thương mại của phytase từ nấm sợi sau khi được xử lý đun sôi cùng một khoảng thời gian Điều này chứng tỏ rằng ở thực vật, sự biểu hiện ở thực vật có thể ảnh hưởng đến quá trình gấp nếp lại của enzyme hoặc tạo ra một môi trường không thuận lợi cho quá trình gấp nếp lại của enzyme [149]

1.3.2 Nghiên cứu về thay đổi pH hoạt động tối ưu của phytase

Hầu hết các loại phytase được biết đến đều không có pH hoạt động tối ưu nằm trong dải pH trong dạ dày- là vị trí hoạt động chính của phytase, do đó những nghiên cứu về việc cải thiện pH hoạt động tối ưu của phytase là rất cần thiết Những nghiên cứu này bao gồm biến đổi nhóm ion hóa có liên quan trực tiếp đến tính đặc

hiệu cơ chất, thay đổi trình tự aminoaxit ở các vị vùng hoạt động hoặc vùng đặc hiệu cơ chất nhờ các liên kết hydro hoặc liên kết muối hoặc thay đổi các tương tác tích điện nhờ sự biến đổi điện tích bề mặt của enzyme Với những định hướng này, năm 2002 Tomschy và cộng sự đã cải thiện được pH hoạt động tối ưu phytase của

A fumigates và các phytase tương tự ở điều kiện pH thấp [64, 65, 149]

Năm 2000, Lehmann và cộng sự đã tiến hành thay thế toàn bộ các amino axit trong vùng hoạt động của một loại phytase bền nhiệt bằng trình tự aminoaxit tương

tự như trình tự amino axit trong vùng hoạt hóa của phytase từ chủng A niger NRRL

3135 Kết quả là phytase mới có hoạt tính xúc tác tương tự như A niger NRRL

3135 tuy nhiên khi các axit amin ở vùng hoạt động này thay đổi đã làm giảm nhiệt

độ biến tính so với loại phytase ban đầu [64]

1.3.3 Nghiên cứu về khả năng bền axit và enzyme protease của phytase

Với điều kiện pH thấp trong dạ dày lợn và chim từ 2-5, ở hầu hết các gia cầm

từ 4-5 và ở ruột non từ 6,5-7,5 đã tạo ra một thách thức lớn khi sử dụng phytase trong thức ăn chăn nuôi Theo những nghiên cứu của Konietzny năm 2002 cho rằng hầu hết các phytase vi sinh vật bền với pH hơn là các phytase từ thực vật, các phytase ở thực vật giảm đáng kể hoạt tính ở trong khoảng 4-7,5 trong khi đó các phytase vi sinh vật tương đối bền trong khoảng pH từ 3-8 [64, 65, 149]

Ngoài khả năng chịu axit các phytase cần có khả năng kháng các enzyme thủy phân protein trong ống tiêu hóa của động vật Ở các loại phytase khác nhau thì khả năng kháng các enzyme thủy phân protein như pancreatic và pepsin là khác nhau Năm 1999, Phillippy và cộng sự cho rằng các phytase sẵn có trong lúa mỳ dễ bị bất

hoạt bởi pancreatic và pepsin hơn là phytase của A niger Ngược lại phytase của A niger lại có tính kháng với pepsine kém hơn Khi so sánh phytase của Bacillus subtilis và E coli với 4 loại phytase của nấm tái tổ hợp thì hầu hết phytase của nấm

dễ bị bất hoạt bởi pepsine và pancreatine hơn, Bacillus subtilis bền với pancreatin

và phytase của E coli bền với cả pepsine và pancreatine [64, 65, 149]

Các sản phẩm phytase thương mại cần có tính kháng với sự phân hủy trong

suốt quá trình sản xuất cũng như bảo quản Theo Wyss và cộng sự (1999), khi biểu

hiện phyatse của A fumigatus và Emericella nidulans ở A niger chúng bị phân cắt

bởi các protease có mặt trong môi trường nuôi cấy, tuy nhiên sự phân cắt này không

làm ảnh hưởng đến phytase của Emericella nidulans nhưng lại làm giảm đáng kể hoạt tính của A fumigates Các đột biến điểm trực tiếp ở các vị trí mẫn cảm protein của phytase từ A fumigatus và E nidulans làm giảm đáng kể tính mẫn cảm với quá

trình thủy phân của protese với các enzyme này [64, 65, 149, 156]

1.3.4 Nghiên cứu về tăng hiệu suất của quá trình sản xuất phytase

Quá trình sản xuất phytase được tập trung ở một số loài nấm trong quá trình

lên men pha rắn hay lên men chìm, trong đó các loài nấm thuộc chi Aspergillus

được sử dụng rộng rãi hơn cả (Wyss và cộng sự, 1999a, b; Martin và cộng sự,

2003), bên cạnh đó một số loài nấm ưa nhiệt trung bình khác như Mucor racemosus

và Rhizopus oligosporus (Sabu và cộng sự, 2002; Bogar và cộng sự, 2003), hoặc các loài nấm chịu nhiệt như Thermoascus aurantiacus cũng được sử dụng trong quá

Lan và cộng sự (2002) đã nghiên cứu những ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau của môi trường và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến quá trình sản xuất

phytase ở vi khuẩn dạ cỏ Mitsuokella jalaludinii khi lên men theo mẻ Năm 2005, Dharmsthiti và cộng sự đã thành công khi sản xuất phytase E coli appA ở Pseudomonas putida dựa trên hệ thống kích thích bài tiết hiệu quả và khả năng sinh trưởng sử dụng các loại cơ chất khác nhau Sự biểu hiện hiệu quả phytase E coli AppA ngoại bào còn được nghiên cứu ở Streptomyces lividans bởi Stahl và cộng sự

năm 2003 Mới đây năm 2005 Yin và cộng sự đã mô tả hệ thống biểu hiện 1 loại

phytase mới ở ấu trùng tằm với sản lượng 7710 đơn vị trên 1 ml huyết bạch huyết [65]

1.3.5 Nghiên cứu về động vật và thực vật chuyển gen phytase

Các con lợn chuyển gen phytase có tên gọi EnviroPig được tạo ra nhờ chuyển

gen phytase AppA của E coli, đã biểu hiện phytase trong tuyến nước bọt của chúng

và đã làm giảm hàm lượng P trong phân thải của chúng lên đến 75% Chiến lược chuyển gen này cũng đã được thực hiện ở các loài thực vật và các gen phytase được

lựa chọn ở đây để chuyển gen sang thực vật bao gồm gen phytase của A niger, S ruminantium, E coli và A fumigatus và một số loài khác Các hạt có chuyển gen

phytase như hạt đậu tương, hạt cải và thuốc lá đã được thử nghiệm trong chế độ ăn của lợn, chuột và gà thì không thấy có hiệu ứng xấu nào mà còn làm tăng khả năng

sử dụng P và giảm sự bài tiết P qua phân so với khi bổ sung phytase vi sinh vật [65]

1.3.6 Những nghiên cứu về phytase ở Việt Nam

Trần Thị Tuyết và cộng sự (Viện Sinh học Nhiệt đới) đã nghiên cứu lên men

bề mặt cám mỳ để thu phytase sử dụng A niger NRRL 363 (từ Bộ sưu tập giống

của Mỹ) thu được 572,78 U/g cơ chất lên men sau 2 ngày nuôi cấy, độ ẩm ban đầu thích hợp là 60% Phytase thu được có hoạt tính tối ưu tại pH 5,5 và nhiệt độ tối ưu

ở 55oC [142]

Nguyễn Thùy Châu (Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau Thu hoạch)

từ 1/2007 – 12/2009 đã nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ sản xuất phytase bằng

hình thức lên men bề mặt Trong nghiên cứu đã sử dụng các chủng vi sinh vật: A niger ATCC 9142, A ficcum NRRL 3135 từ bộ sưu tập giống của Mỹ; A niger NCIM, Rhizopus microsporus từ Cộng hòa Séc và chủng A niger DL1 phân lập từ

Việt Nam Nhóm tác giả đã nghiên cứu quy trình lên men rắn sản xuất phytase ở qui

mô công nghiệp Theo đó chủng sản xuất được lên men ở nhiệt độ 30oC trong 7 ngày trên môi trường P3 Cơ chất sau lên men được tách chiết enzyme bằng dịch oxy già 5%, enzyme thô được thu bằng ly tâm và tủa bằng cồn 96oC, sấy khô tạo chế phẩm VS1 Khảo nghiệm tác động của chế phẩm trên gà cho thấy 200 g chế