a/ Lựa chọn cơ chất xốp thích hợp
Chủng vi khuẩn nghiên cứu sau 3 ngày nuôi trên 8 loại cơ chất khác nhau tại 40oC, dịch chiết enzyme thô được xác định hoạt tính phytase. Kết quả được thể hiện trong hình 18:
Hình 18. Cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Một trong những ưu điểm của lên men xốp là môi trường nuôi cấy khá giống với môi trường tự nhiên của vi sinh vật, cơ chất có ảnh hưởng đáng kể lên quá trình lên men xốp. Cơ chất đóng vai trò kép vừa là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật, vừa là giá thể để các tế bào vi sinh vật bám vào [132]. Các loại cơ chất dùng trong lên men xốp có thể mua được dễ dàng ngoài chợ hay là các sản phẩm phụ của quá trình
chế biến công nông nghiệp như ngô, gạo lức, cám, bột đỗ tương. Trong nghiên cứu này, hoạt tính enzyme đạt được cao nhất của B. amyloliquefaciens subsp. plantarum
SP1901 khi lên men xốp với cơ chất là ngô vỡ (4,68 U/g). Vì thế cơ chất ngô vỡ được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
b/ Lựa chọn độ ẩm thích hợp
Chủng vi khuẩn nghiên cứu sau 3 ngày nuôi xốp trên cơ chất thích hợp tại 40oC với các độ ẩm 20-90%. Dịch chiết enzyme thô được xác định hoạt tính phytase. Kết quả được thể hiện trong hình 19.
Hình 19. Độ ẩm thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Hình 20. Tỷ lệ cấy giống thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Độ ẩm có tác động trực tiếp đến quá trình sinh trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp enzyme trong lên men xốp bởi vì quá trình lên men xốp rất khác với lên men chìm, trong lên men xốp vi sinh vật sinh trưởng và sinh tổng hợp các sản phẩm bên trên hoặc gần bề mặt cơ chất có độ ẩm thấp do đó mà lên men xốp chỉ thích ứng với một số giới hạn các loại vi sinh vật [132]. Trong nghiên cứu này, độ ẩm thích hợp nhất cho hoạt tính phytase cao nhất ở chủng B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum SP1901 là 50%. Ở độ ẩm 20-30%, chủng vi khuẩn nghiên cứu gần như không sinh trưởng; ở độ ẩm 90% vi khuẩn mọc thành lớp trên bề mặt cơ chất xốp mà sinh trưởng kém bên trong khối cơ chất. Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men xốp còn phụ thuộc vào độ ẩm sẵn có của loại cơ chất sử dụng. Độ ẩm thích hợp
nhất của 3 chủng nấm A. ficuum NRRL 3135, M. racemosus NRRL 1994, R. oligosporus NRRL 5905 khi lên men xốp sử dụng cơ chất là bột ngô, cám lúa mỳ, bột đỗ tương là 60%, tuy nhiên khi lên men xốp trên bột canola thì độ ẩm thích hợp nhất là 70% [12].
c/ Lựa chọn tỷ lệ cấy giống thích hợp
Chủng nghiên cứu được nuôi lắc khởi động trong môi trường dịch thể NA và giống cấy vào môi trường lên men xốp với các tỷ lệ khác nhau và đảm bảo độ ẩm 50%, hoạt tính phytase của dịch enzyme được xác định. Kết quả thu được trong hình 20. Tỷ lệ cấy giống đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp phyatase ở lên men pha rắn. Tỷ lệ cấy giống quá lớn làm giảm sản lượng phytase sinh ra là do các yếu tố dinh dưỡng tập trung tăng cường cho quá trình sản xuất sinh khối. Do đó tỷ lệ cấy giống cần thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp phytase. Theo kết quả thu được ở hình 20, tỷ lệ cấy giống thích hợp nhất cho chủng chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP1901 sinh tổng hợp phytase trong lên men xốp là trong khoảng 10-20% (dựa trên khối lượng ngô vỡ). Ở tỷ lệ cấy giống từ 25%, hoạt tính phytase thu được giảm dần.
d/ Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp
Chủng nghiên cứu được nuôi trên môi trường ngô vỡ ở 37oC, sau các khoảng thời gian thích hợp lấy mẫu, xác định số lượng và chiết enzyme để xác định hoạt tính phytase. Kết quả thu được như hình 21.
Hình 21. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của chủng SP1901
Với kết quả thu được, số lượng tế bào/g cơ chất của chủng vi khuẩn đạt được cao nhất sau khoảng 48-72 h, tuy nhiên hoạt tính phytase đạt được cao nhất trong khoảng thời gian 84 h nuôi cấy. Quá trình lên men xốp thường diễn ra trong thời gian dài hơn so với lên men chìm, kết quả thu được cũng phù hợp với nghiên cứu của Gulati và cộng sự (2007) khi tiến hành lên men dịch thể để sinh tổng hợp phytase ở chủng Bacillus laevolacticus, hoạt tính phytase đạt được cao nhất chỉ sau 60h nuôi cấy [37].
e/ Lựa chọn nguồn cacbon và nguồn nitơ bổ sung thích hợp
Chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường lên men xốp được bổ sung các nguồn các bon khác nhau vào dung dịch làm ẩm như: galactose, sucrose, lactose, xylose, manitol, glycerol, CMC và tinh bột tan (tỷ lệ 1%) và các nguồn nitơ khác nhau như: (NH4)2SO4, NaNO2, NaNO3, ure, cao thịt, cao men, peptone (tỷ lệ 0,5%) và mẫu đối chứng âm là mẫu không bổ sung nguồn các bon/nguồn nitơ, mẫu đối chứng dương là môi trường ngô vỡ làm ẩm bằng dịch khoáng. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 40oC dịch enzyme thô được xác định hoạt tính phytase. Kết quả thu được như trong hình 22 và 23.
Hình 22. Nguồn các bon thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Hình 23. Nguồn nitơ thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Các kết quả thu được ở hình 22 cho thấy B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum SP1901 có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và nguồn cacbon cũng ảnh hưởng đến quá trình sản sinh phytase ngoại bào của B. amyloliquefaciens
subsp. plantarum SP1901. Trong số các nguồn cacbon được kiểm tra, lactose và glycerol (1%) hỗ trợ tốt nhất cho quá trình sinh tổng phytase. Thêm vào đó, hoạt tính phytase cao cũng được tìm thấy ở môi trường có bổ sung sucro và CMC. Trong mẫu đối chứng không bổ sung nguồn cacbon hoạt tính phytase đạt 4,53 U/g, điều này chứng tỏ rằng SP1901 có thể sử dụng nguồn cacbon sẵn có trong cơ chất.Ngoài nguồn cacbon thì các nguồn nitơ khác nhau có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp phytase. Các kết quả trong hình 23 chỉ ra rằng ure và NH4NO3 có ảnh hưởng tích cực sản xuất phytase; (NH4)2SO4 và peptone ức chế quá trình sản xuất phytase (tương ứng hoạt tính phytase chỉ còn 1,77 và 1,93 U/g). Ngoài ra, chủng SP1901 có khả năng sử dụng được nhiều nguồn nitơ khác nhau, thậm chí có thể không cần bổ sung thêm nguồn nitơ bên ngoài mà có thể sử dụng được nguồn nitơ có mặt ngay trong cơ chất xốp. Gulati và cộng sự (2007) đã cho rằng quá trình sản xuất phytase bởi Bacillus laevolacticus được kích thích nhờ sự có mặt của NH4H2PO4 và sucrose [37]. Những nghiên cứu trước đây cho rằng cám mỳ là nguồn cacbon thích hợp nhất cho sản xuất phytase ở B. amyloliquefaciens DS11, B. subtilis, và B.
amyloliquefaciens FZB45; tuy nhiên lại không có ảnh hưởng tích cực đến quá trình sản xuất phytase ở B. laevolacticus [37, 57]. Tinh bột là nguồn cacbon và (NH4)2SO4 là nguồn nitơ bổ sung thích hợp nhất làm tăng quá trình sản xuất phytase ở A. ficuum NRRL 3135, M. racemosus NRRL 1994, R. oligosporus NRRL 5905; hay manitol 2,05% là nguồn cacbon và amoniumsunlfate 2,84% là nguồn nitơ thích hợp nhất làm tăng 8,41 lần sự sản xuất phytase ở Rhizopus oryzae [12, 107].
f/ Lựa chọn các ion kim loạibổ sung thích hợp
Chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường lên men xốp được bổ sung một trong các ion kim loại như : Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ba2+, K+, Na+, Fe2+ (tỷ lệ 0,2%) vào dung dịch làm ẩm và mẫu đối chứng âm là mẫu không bổ sung ion kim loại, mẫu đối chứng dương là môi trường ngô vỡ được làm ẩm bằng dịch khoáng. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 40oC dịch enzyme được xác định hoạt tính phytase. Kết quả thu được như trong hình 24.
Hình 24. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901
Theo kết quả thu được hoạt tính phytase của chủng nghiên cứu cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung Ca2+ và môi trường đối chứng có mặt của Ca2+ và 1 số ion kim loại như Mg2+, Mn2+, K+, Fe2+. Tuy nhiên trong môi trường đối
chứng không có bổ sung ion kim loại và môi trường chỉ bổ sung 1 trong các loại ion kim loại (Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ba2+, K+, Na+, Fe2+), chủng nghiên cứu gần như không có sự sinh tổng hợp phytase. Điều này cho thấy Ca2+ có ảnh hưởng rất lớn trong quá trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp phyatse của chủng SP1901 và có thể giải thích là do phytases từ B. subtilis và B. amyloliquefaciens là các phytase phụ thuộc Ca2+, chúng có chứa trung tâm hoạt động có ái lực cao với Ca2+ [40]. Choi và cộng sự (1999) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại lên sự sinh tổng hợp phytase của chủng Bacillus sp. KHU-10 trong lên men dịch thể, thấy rằng khi bổ sung 0,01-0,2% Ca2+, Zn2+ 0,1% vào môi trường nuôi cấy làm tăng sự sản xuất phytase lên khoảng 30% so với môi trường không bổ sung Ca2+, sự có mặt của các ion khác như Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Li+, Na+ và Sn2+ làm giảm một phần hoạt tính phytase mà không ức chế hoàn toàn quá trình sinh tổng hợp phytase [20].
h/ Lựa chọn hàm lượng Ca2+ bổ sung thích hợp
Dựa trên kết quả về vai trò quyết định của Ca2+ đối với quá trình sinh tổng hợp phytase, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu nồng độ ion Ca2+
bổ sung thích hợp vào môi trường lên men xốp: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1; 1,2% , mẫu đối chứng âm không bổ sung Ca2+, sau 3 ngày nuôi cấy ở 40oC, dịch enzyme được xác định hoạt tính phytase. Kết quả thu được như sau:
Hình 25. Ảnh hưởng của hàm lượng Ca2+ đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901
Theo kết quả nghiên cứu, hàm lượng Ca2+ thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901 là từ 0,1-1%; từ 1,2% Ca2+ được bổ sung thì hoạt tính phytase bắt đầu giảm xuống (hình 25).
Với những kết quả thu được khi tối ưu hóa các điều kiện lên men xốp của chủng SP1901, ngô vỡ là cơ chất thích hợp nhất cho quá trình sản xuất phytase, độ ẩm 50% và tỷ lệ cấy giống từ 10-20% tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp phytase và hoạt tính phytase đạt được cao nhất sau 84 h nuôi cấy. Chủng SP1901 có thể sử dụng nguồn cacbon và nitơ sẵn có trong cơ chất tuy nhiên khi có mặt lactose, glycerol, ure và NH4NO3 cũng làm tăng nhẹ hoạt tính phytase thu được. Ion Ca2+
có vai trò quyết định đối với quá trình sản sinh phytase ở nồng độ thích hợp từ 0,1-1%, các môi trường không có mặt Ca2+ đều không có sự sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901.
3.4 THU HỒI ENZYME