Các phytase thuộc nhóm này bao gồm các phytase của các loài thuộc Bacillus
spp, hạt phấn của Thypha lattifolia và Lilium longiflorum. Các trình tự gen mã hóa cho enzyme phytase của chi Bacillus đã được công bố nhiều tuy nhiên chỉ cấu trúc protein của phytase của Bacillus amyloliquefaciens DS11 đã được công bố. Khác với HAP, ß-propeller phytase không sở hữu trình tự amino axit đặc trưng là RHGXRXP và HD, mà có 2 vị trí riêng biệt gắn Ca2+ trong đó 3 ion Ca2+ gắn vào vùng có ái lực với canxi cao và 3 ion Ca2+ gắn vào vùng có ái lực với canxi thấp, do đó phytase loại này được gọi là các metallo-enzyme. Điều này khiến cho ß-propeller phytase được gọi là một metallo- enzyme và có thể dẫn đến các cơ chế thủy phân phytate khác nhau. Mặc dù trình tự phytase β-propeller rất đa dạng (độ tương đồng 65-99%) nhưng chúng vẫn bảo thủ ở 2 vị trí gắn canxi. Không giống như cấu trúc của HAP, phytase ß-propeller chứa 6 tấm dạng β được sắp xếp thành 6 hướng giống như chân vịt (hình 6) tạo nên các khe hoạt tính hẹp tích điện âm cao. Mỗi tấm trong phân tử enzyme phytase β-propeller chứa 4 tới 5 chuỗi β không cùng chiều, và
chuỗi thứ tư của mỗi tấm có liên kết với chuỗi đầu tiên của tấm tiếp theo, tấm thứ 6 được đặt dọc theo trục trung tâm của chân vịt. Tấm thứ 6 có chứa 1 chuỗi β từ đuôi N và 3 chuỗi β từ đuôi C của phân tử protein, tham gia vào cả 2 phần đuôi của phân tử protein và góp phần vào sự bền vững của enzyme. Ngoài ra một chuỗi β bổ sung từ đuôi N kết nối tấm thứ 5 và tấm thứ 6, được cho là có vai trò góp phần vào sự bền vững của enzyme, cùng với 3 ion Ca2+ ở vị trí có ái lực cao với Ca2+ làm tăng độ bền nhiệt của phytase β-propeller từ Bacillus amyloliquefaciens DS11 [40, 95, 140].
Hình 6. Mô hình cấu trúc phytase β-propeller (vẽ lại theo Ha và cộng sự, 2000) 1.2.4.3 Purple axit phosphatase (PAP) phytases
PAP phyatse có mặt trong lá mầm của đỗ tương đang nảy mầm, được gọi là GmPhy, có kiểu vùng hoạt động chứa nhân kép Fe (III)- Zn (II). Phytase của
Klebsiella terrigena và K. aerogenes, chưa được mô tả chi tiết, tuy nhiên đã có những nghiên cứu cho rằng chúng là các monomer 3 phyatse có 2 dạng cảm ứng. Dạng lớn hơn với kích thước 700 kDa và dạng nhỏ hơn 10-13 kDa, với 2 pH tối ưu khác nhau (5,2 và 4,5), đây là phân đoạn protein nhỏ nhất được biết đến có biểu hiện hoạt tính phytase [97, 140].
1.2.5 Gen mã hóa phytase
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã giải mã trình tự gen phytase của một số chủng vi sinh vật. Gen mã hóa phytase từ Apergillus niger var. awamori
tự phyA này có độ tương đồng 65% với gen phytase của A. fumigatus, 62% của A. terrus, 62% của Emericella nidulans, 61% của Thermus thermophilus và 46% của
Methanosaeta thermophila. Protein PhyB của A. niger NRRL 3135 có 99% trình tự axit amin tương đồng với protein tương ứng của A. niger var. awamori. Tuy nhiên hai loại phytase của A. niger NRRL 3135 (PhyA và PhyB) lại chỉ có 25% độ tương đồng về axit amin [98].
Gen phytase của E. coli và của chuột không có nhiều trình tự tương đồng với gen của A. niger. Tuy nhiên, chúng lại có cùng trình tự bảo thủ mã hóa cho trung tâm hoạt động của enzyme [144]. Thêm vào đó, chúng cùng mã hóa histidine và axit aspartic ở đầu C, những axit amin này tham gia trực tiếp vào phản ứng enzyme. Những phytase này được xếp vào nhóm histidine axit phosphatase. Hai đoạn gen mã hóa phytase của ngô là PHYTI và PHYTII có trình tự gần giống nhau nhưng lại rất khác biệt với các gen phytase khác. Tuy nhiên, khi phân tích vùng gen mã hóa 33 axit amin của PHYTI và PHYTII, Maugenest và cộng sự (1997) cũng tìm được sự tương đồng với phytase của A. niger. Vùng gen này có lẽ là điểm nhận biết vị trí cắt nhóm phosphate trong axit phytic [76].
David và cộng sự (1997) đã xác định hai đoạn gen mã hóa phytase từ hai loại nấm khác nhau là A. terreus và Myceliophthora thermophila. Khi so sánh với gen
phyA của A. niger cho thấy: phyA tương đồng tới 60% đối với gen mã hóa phytase của A. terreus và 48% với gen mã hóa phytase của M. thermophila [25]. Gen mã hoá phytase của B. amyloliquefaciens tương đồng 72% với gen ở B. subtilis. Gen phytase của Enterobacter sp. có độ tương đồng 30-38% với Chryseobacterium meningosepticum và Streptococcus equisimilis, đặc biệt ở vị trí mã hóa lysine và tryptophan [98]. Phytase từ B. subtilis VTT E-68013 (phyC) không có điểm tương đồng với các phytase khác, nó cũng không chứa trình tự axit amin bảo thủ RHGXRXP, mã hóa trung tâm hoạt động của các phytase đã được công bố. Tuy nhiên, enzyme này thể hiện hoạt tính phân cắt liên kết phosphodiester trong axit phytic. Có thể đây là một loại enzyme mới [55].
1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất phytase từ vi sinh vật
1.2.6.1 Các yêu tố vật lý
Các yếu tố vật lý ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng của vi sinh vật cũng như sự sản xuất các sản phẩm trao đổi chất như nhiệt độ, pH, áp suất, chế độ khuấy, hàm lượng oxy hòa tan và thời gian nuôi cấy. Các vi sinh vật sản xuất phytase hầu hết đều là các loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 25-37oC, ngoại trừ loài nấm chịu nhiệt Thermomyces lanuginosus,
Talaromyces thermophilus và Sporotrichum thermophile [149].
Cùng với nhiệt độ pH cũng là yếu tố có ảnh hưởng rõ nét đến quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật, đối với vi khuẩn và nấm dải pH tối ưu này là 5-7, tính đến thời điểm hiện nay chưa có báo cáo nào về quá trình sinh tổng hợp phytase ở điều kiện pH kiềm [149].
Chế độ thông khí, khuấy của môi trường đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo các thành phần môi trường, tế bào vi sinh vật và oxy được phối trộn đều. Ở loài Schwanniomyces castellii, quá trình sản xuất phytase diễn ra liên tục trong các thiết bị lên men được thông khí ở tỷ lệ 1 v/v/m (thể tích khí/thể tích môi trường/phút) và tốc độ khuấy 600 vòng/phút, quá trình sản xuất phytase của A. niger, A. ficuum NRRL 3135 và A. terreus diễn ra trong điều kiện lắc 270 vòng/phút, Bacillus sp. DS11 sản sinh phytase nhiều nhất ở chế độ lắc 230 vòng/phút [149].
Mittal và cộng sự (2012) đã nghiên cứu thời gian nuôi cấy của Klebsiella sp.
DB-3 FJ711774.1 và nhận thấy: quá trình sinh tổng hợp phytase trên các loại cơ chất khác nhau của chủng này bắt đầu sau 30h nuôi cấy và đạt sản lượng phytase cao nhất sau 72 h nuôi cấy, sau khoảng thời gian này quá trình sinh tổng hợp phytase giảm, đây cũng là một ưu điểm của chủng này khi có thể sinh tổng hợp nhiều phytase sau một khoảng thời gian ngắn. Thời gian sinh tổng hợp phytase cao nhất cũng được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác như E. coli là 14 h,
Lactobacillus amylovorus B4552là 32 h. Đây là một đặc điểm quan trọng khiến các chủng này được ưu tiên sử dụng trong việc sản xuất phytase quy mô thương mại.
Nguyên nhân của sự giảm sinh tổng hợp phyatse sau 72 h có thể là do sự tăng sinh trưởng sinh khối tế bào làm giảm hàm lượng các yếu tố dinh dưỡng trong môi trường, cũng có thể là do sự ức chế tế bào hoặc biến tính protein do sự tương tác với các thành phần khác trong môi trường. Ngoài ra thời gian nuôi cấy cho sản lượng phytase cao nhất này còn phụ thuộc vào tốc độ sinh trưởng và cơ chế điều khiển sinh tổng hợp riêng với từng loại enzyme [81, 149].
1.2.6.2 Các yếu tố dinh dưỡng
a/ Nguồn cacbon
Nguồn cacbon và nồng độ tối ưu của nguồn cacbon là một yếu tố quan trọng trong quá trình sản xuất phytase, glucose được coi là nguồn cacbon được sử dụng rộng rãi bởi nhiều vi sinh vật, nồng độ glucose 1% là nồng độ tối ưu cho quá trình sản xuất phytase ở Lactobacillus amylovorus và Enterobacter sp. 4, trong khi đó
Bacillus subtilis thích hợp với nồng độ glucose 2%. Cám lúa mỳ (6%) là nguồn cac bon tốt cho quá trình sản sinh phytase của Bacillus sp. DS11 trong khi đó các loài
Pseudomonas sp. sử dụng myo-inositol (0,2%) như là một nguồn các bon duy nhất trong quá trình sinh trưởng và sản xuất phytase. Klebsiella aerogenes sản sinh phytase nhiều nhất trên môi trường chứa 2% natri phytate là nguồn các bon duy nhất. Khi 2% glucose được thay thế bằng galactose trong môi trường peptone- glucose- nấm men thì quá trình sinh tổng hợp phytase của Arxula adeninivorans
tăng gấp mấy lần. Schwanniomyces castellii ưa thích sử dụng galactose là nguồn cacbon trong quá trình sinh tổng hợp phytase [149].
Đối với nấm, cao men và cao malt được sử dụng là nguồn cac bon, ở A. niger
NRRL 3135, khi các nguồn cacbon đơn giản như glucose và sucrose được sử dụng thì các sự sinh trưởng hệ sợi mạnh mẽ và sản lượng phytase thấp, tuy nhiên đối với một số loại bột ngô nhất định, sự sinh trưởng hệ sợi giảm và hàm lượng phytase cao hơn. Aspergillus ficuum sản sinh phytase trong quá trình lên men pha rắn sử dụng bột canola là cơ chất và khi bổ sung glucose 2% làm tăng quá trình sản xuất phytase [149].
b/ Nguồn nitơ
Nguồn nitơ là một yếu tố dinh dưỡng khác có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sản xuất phytase, bao gồm nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ. Peptone là nguồn nitơ hữu cơ được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất phytase, Aerobacter aerogenes sử dụng peptone 1% và K. oxytoca sử dụng cao men 1% là nguồn cacbon. Các loài Pseudomonas sp., Enterobacter sp. 4, và S. castellii sử dụng nguồn nitơ vô cơ như ammonium sulfate 0.1%. B. subtilis sử dụng casein hydrolysate 1% và (NH4)2SO4 0,1% là nguồn nitơ trong quá trình sản xuất phytase. Đối với A. adeninivorans cao men 1% và peptone 1% là nguồn nitơ quan trọng [81, 149]
c/ Các nguyên tố vi lượng và vitamine
Ngoài nguồn cacbon và nitơ, quá trình sinh trưởng của một số vi sinh vật cần bổ sung các nguyên tố vi lượng (các ion kim loại Mg2+, Zn2+,Mn2+, Cu2+, Fe2+ dưới dạng muối sulfate và Ca2+, Na+ dưới dạng muối chloride có nồng độ dưới 100 ppm) và các vitamine, ví dụ như ở nấm men, trong quá trình sàng lọc chủng sinh phytase cần có các nguyên tố vi lượng và các vitamine, tuy nhiên việc bổ sung các nguyên tố vi lượng và vitamine cho quá trình sinh tổng hợp phytase lại không cần thiết ở các loài Bacillus subtilis, Bacillus sp. DS11, E. coli và các loài nấm như A. niger
ATCC 9142 và A. ficuum NRRL 3135, thậm chí quá trình sinh tổng hợp phytase ở
Saccharomyces castellii bị ức chế nhẹ bởi sự có mặt của 5 mM Ca2+, Mg2+,Mn2+ và Fe2+ . Tuy nhiên, phytase Bacillus subtilis cần Ca2+ để duy trì cấu trúc hoạt tính của chúng [81, 149].
1.2.7 Điều khiển sinh tổng hợp phytase
a/ Ảnh hưởng của nồng độ phospho
Hàm lượng phospho vô cơ trong môi trường cũng tham gia vào điều khiển quá trình sinh tổng hợp phytase. Nguồn phospho được sử dụng phổ biến nhất cho quá trình sinh tổng hợp phytase là KH2PO4 và K2HPO4. Ở một số loài Bacilus, môi trường nuôi cấy chứa KH2PO4 (0,05%) và K2HPO4 (0,04%), đối với Bacillus subtilis natri phytate (0,06%) được sử dụng cùng với KH2PO4 (0,1%) trong môi trường nuôi cấy, còn ở S. castellii natri phytate 0,06% được sử dụng như một nguồn
phospho. Tuy nhiên ở một số loài nấm men và nấm mốc, sự có mặt của phytate ức chế quá trình sinh tổng hợp phytase. Sản lượng phyatase ở nấm mốc khi sinh trưởng trên môi trường bột ngô phụ thuộc vào hàm lượng phospho có trong bột ngô, hàm lượng phospho cao trong bột ngô làm giảm quá trình sinh tổng hợp phytase ở nấm mốc. Theo Zyta và Gogol (2002) sau khi loại bỏ photphate khỏi môi trường mật đường thì hoạt động đặc hiệu của phytase cao gấp 7,3 lần ở chủng A. niger AbZ4. Ở
Lactobacillus amylovorus quá trình sinh tổng hợp phytase cao nhất ở môi trường bổ sung 240 mg/l photphate, ở Candida krusei quá trình sinh tổng hợp phytase cao nhất khi môi trường nuôi cấy bổ sung 5 mg/100ml photphor và khi tăng cứ 5 mg trên 100 ml lại ức chế quá trình sinh tổng hợp này [149].
b/ Ảnh hưởng của hàm lượng phytate
Ảnh hưởng của phytate lên quá trình sinh tổng hợp phytase được nghiên cứu bằng cách thêm 0,2-1% phytate vào môi trường lên men. Theo nghiên cứu của Mittal và cộng sự (2012) đối với chủng Klebsiella sp. DB-3 FJ711774.1 trên môi trường sử dụng cám lúa mỳ và bột vỏ mỳ là cơ chất hoạt độ phytase lần lượt là 1,9 U/ml và 2,48 U/ml, trong khi đó khi môi trường sử dung phytate tinh khiết là cơ chất thì hoạt độ phytase 1,5 U/ml, điều này cho thấy rằng, cám bột mỳ và bột vỏ mỳ là một trong các nguồn cơ chất tốt, rẻ tiền được sử dụng thay thế phytate đắt tiền để sản xuất phytase trong quy mô công nghiệp [81].
c/ Ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt
Ở chủng A. niger NRRL 3135, khi glucose hay fructose được sử dụng là nguồn cacbon duy nhất thì các cục hệ sợi được hình thành và quá trình sinh tổng hợp phytase thấp. Ở môi trường có chứa chất hoạt động bề mặt như sodium oleate 0,5% (v/v) quá trình sinh trưởng giảm và sản lượng phytase cao gấp 4-7 lần so với đối chứng. Trong suốt quá trình sinh trưởng của A. carbonarius trên môi trường lên men pha rắn với cơ chất là bột canola, tốc độ sinh trưởng, sự sinh tổng hợp phytase và quá trình phân giải phytic axit cao hơn so với mẫu đối chứng khi bổ sung các chất hoạt động bề mặt như Na-oleate và Tween-80, tuy nhiên Triton X-100 không có ảnh hưởng gì tới quá trình sinh tổng hợp phytase [149].
Tỷ lệ cấy giống đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp phytase ở lên mên chìm và lên men pha rắn. Tỷ lệ cấy giống quá nhỏ và độ nhớt của môi trường tương đối thấp, chúng có xu hướng hình thành các khối (cục) và quá trình sinh tổng hợp phytase thấp, đây cũng là một đặc điểm thường thấy ở các loài vi sinh vật. Ở các loài Klebsiella sp. khi lên men chìm, tỷ lệ cấy giống 1,5% cho sản lượng phytase cao nhất đối với mọi loại cơ chất [81]. Tỷ lệ cấy giống trên 1,5% làm giảm sản lượng phytase sinh ra là do các yếu tố dinh dưỡng tập trung tăng cường cho quá trình sản xuất sinh khối. Ngoài tỷ lệ cấy giống thì tuổi của giống có liên quan chặt chẽ với quá trình sản xuất phytase và sinh khối. Do đó tỷ lệ cấy giống và tuổi giống cần thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp phytase.
1.2.8 Các ứng dụng của phytase
Dựa trên những đặc tính hóa lý và chức năng, phytase có rất nhiều ứng dụng khác nhau tập trung chính vào 2 lĩnh vực sau: sản xuất thực phẩm và thức ăn động vật trên quy mô công nghiệp, là công cụ trong các nghiên cứu hóa sinh. Ngoài ra phytase còn được sử dụng nhiều trong việc phục hồi đất và bán tổng hợp peroxydase.
1.2.8.1 Ứng dụng của phytase là phụ gia thức ăn chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản
Thực vật là thành phần chính trong thức ăn của các loại gia cầm, cá khoảng 2/3 hàm lượng phospho trong loại thức ăn có nguồn gốc thực vật này là phytic axit tồn tại dưới dạng muối phytate và gia cầm không thể hấp thụ được phospho ở dạng này. Thêm vào đó sự có mặt của phytate trong thức ăn làm giảm sự hấp thu các ion khoáng cũng như một số hợp chất khác.
Đối với các động vật nhai lại, do có hệ vi sinh vật khu trú trong ruột sinh tổng hợp phytase phân giải phytate giải phóng ra phospho vô cơ. Tuy nhiên ở các động vật dạ dày đơn như người, gà, lợn chỉ sản xuất một lượng rất ít hoặc không sản xuất phytase trong ruột, do đó trong khẩu phần ăn cần được bổ sung phospho dưới dạng