Hoạt tính phytase được xác định theo phương pháp của Shimizu và cộng sự, 1992 [129]. Lượng Pi giải phóng dưới tác động của phytase được xác định bằng dung dịch thử màu.
Dung dịch thử màu có chứa 4 lần thể tích dung dịch A( ((NH4)6Mo7O2)4.4H2O 1,5% pha trong H2SO4 5,5%) và 1 lần thể tích dung dịch B (FeSO4.7H2O 2,7% pha trong nước cất). Dung dịch thử mầu được pha và sử dụng trong ngày.
Dung dịch cơ chất: có chứa 3 mM phytate-Na trong đệm Na - acetate 0,1M pH 5,5.
Cách pha dung dịch cơ chất: Cân 0,198 g muối phytate-Na (MW=660,04 đvc) pha trong 10 ml nước cất ta thu được dung dịch gốc phytate-Na có nồng độ 30 mM (bảo quản -20°C). Từ dung dịch gốc này pha loãng 10 lần với dung dịch đệm Na- acetate 0,1M (pH 5,5) để thu được dung dịch cơ chất nồng độ 3 mM.
Cách tiến hành phản ứng enzyme thực hiện như sau
- Mẫu thí nghiệm: 0,2 ml dịch enzyme + 0,2 ml dịch cơ chất (3 mM phytate-Na trong đệm Na-acetate 0,1M pH 5,5) ủ 50°C (có thể thay đổi tùy theo mẫu enzyme) trong 20 phút, sau đó bổ sung 0,4 ml dung dịch TCA 15% (trichloroacetic axit) để dừng phản ứng, tiếp theo bổ sung 0,8 ml thuốc thử, để phản ứng màu bền sau 5 phút rồi xác định OD ở bước sóng 700 nm.
- Mẫu đối chứng: 0,2 ml dịch enzyme + 0,4 ml TCA 15% nhằm bất hoạt enzyme, sau đó + 0,2 ml dịch cơ chất (3 mM phytate-Na trong đệm Na-acetate 0,1M pH 5,5) ủ ở 50°C (có thể thay đổi tùy theo mẫu enzyme) trong 20 phút, tiếp theo bổ sung 0,8 ml thuốc thử phản ứng màu bền sau 5 phút rồi xác định OD ở bước sóng 700 nm.
Một đơn vị hoạt tính phytase (IU hoặc FTU) được quy định là lượng enzyme
cần thiết để giải phóng 1μmol Pitrong 1 phút ở điều kiện thử trên
Xác định đồ thị chuẩn phospho
Dung dịch KH2PO4 được sử dụng làm chuẩn phospho. Cân chính xác 1,36 g KH2PO4 hoà tan vào 100 ml nước cất thu được dung dịch 0,1M KH2PO4 (tương đương 0,1 M Pi = 100 mM) từ dung dịch gốc này ta pha loãng thành các nồng độ: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2 mM. Từ mỗi độ pha loãng này lấy ra 0,4 ml để thử phản ứng màu bằng cách bổ sung 0,4 ml TCA, rồi bổ sung 0,8 ml thuốc thử màu và xác định OD700 nm.
Từ giá trị OD và hàm lượng Pi trong dung dịch, phương trình hồi qui tuyến tính (hàm tương quan) đã được thiết lập bằng phần mềm excel và đã thu được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ OD 700 theo hàm lượng Pi và hàm hồi quy như sau:
Hình 8. Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng Pi
Đồ thị đường chuẩn có dạng y= 1,174x + 0,062 (y là giá trị OD700 và x là hàm lượng Pi theo đơn vị µmol) với độ chính xác R> 99%. Như vậy mức độ liên hệ giữa x và y là rất chặt chẽ, kết quả đo được là đáng tin cậy.