a/ Tủa bằng amoniumsulphate
Dịch chiết enzyme từ quá trình lên men xốp trên cơ chất thích hợp ở 40oC sau 3 ngày, được tủa bằng muối amoniumsulphate ở các phân đoạn khác nhau. Kết quả cho thấy khi tủa enzyme bằng các phân đoạn khác nhau với muối (NH4)2SO4, hoạt tính phytase mất hoàn toàn ở tất cả các phân đoạn. Do đó không thể sử dụng muối (NH4)2SO4 khi tủa phytase trong trường hợp này, tuy nhiên theo nhiều nghiên cứu
của các tác giả khác như Kenruvo và cộng sự (1998) đã tủa phytase bằng (NH4)2SO4 65% và thu hồi được 56% hoạt tính phytase, theo Wang xueying và cộng sự (2003) đều thu hồi được phytase ở các phân đoạn từ 20-80% (NH4)2SO4 [54, 153].
b/ Tủa bằng cồn và acetone
Dịch chiết enzyme từ quá trình lên men xốp trên ở 40oC sau 3 ngày, được tủa bằng cồn và acetone ở các nồng độ khác nhau và kết quả thu được trong hình 27:
Hình 27. Tủa enzyme bằng cồn và aceton
Khi tủa enzyme bằng cồn và aceton cho thấy ở nồng độ 70% cồn và aceton cho hoạt tính phytase cao nhất (đạt 91-95%). Trong nghiên cứu của Keruvo và cộng sự (1998) đã sử dụng cồn 75% để tủa phytase và thu hồi được 93% hoạt tính phytase [54].
3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901
3.5.1 Phân tích trình tự gen phytase và so sánh với các loài có quan hệ gần gũi
ADN genome của chủng vi khuẩn SP1901được tách chiết và dùng làm khuôn để khuếch đại gen mã hóa phytase (gen phytase) bằng phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi FAR22 và FAR06 (theo 2.2.7.1), trình tự gen phytase được xác định. Chương
trình Blast được sử dụng để so sánh độ tương đồng với trình tự của các loài có quan hệ họ hàng gần. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự gen phytase của chủng nghiên cứu và các loài Bacillus có quan hệ họ hàng (hình 28).
Trình tự gen phytase chủng SP1901 gồm 1175 bp, được so sánh độ tương đồng với các chủng thuộc nhóm Bacillus substilis khác đã được công bố trên Genbank. Cây phân loại được xây dựng dựa vào trình tự của gen phytase của chủng SP1901 và 33 chủng khác thuộc nhóm Bacillus substilis được thể hiện trong hình 28.
Hình 28. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài
Bacillus có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen mã hóa phytase
Kết quả cho thấy chủng SP1901 có độ tương đồng 97% với trình tự gen phytase của chủng Bacillus amyloliquefaciens FZB42, 97% với trình tự gen phytase
Bacillus subtilis E20_FJ541287
B. amyloliquefaciens subsp plantarum CAU B946_HE617159
Bacillus subtilis_AJ584664
64
BacillusBacillus sp. MD2_GU143090 sp. DS11_U85968
72
Bacillus subtilis_WYCQ02_FJ986327
79
Bacillus subtilis_ARRMK33 _EF092835
Bacillus subtilis_AF292103
Bacillus subtilis IDCC 1102_DQ346197
86 Bacillus amyloliquefaciens FZB42_CP000560 100 Bacillus sp. HQ730912_B13 62 SP 19.01 89 Bacillus sp. SDBZ4_GU198969
Bacillus subtilis_AF298179
Bacillus subtilis B9601-Y2 _EU624118
Bacillus amyloliquefaciens_FZB45_ AY055220
B.amyloliquefaciens subsp plantarumYAU B9601-Y2_HE774679
Bacillus amyloliquefaciens Y2_CP00333
Bacillus subtilis WHNB02_AY220075
Bacillus sp. SD01N_AY518208 48 74 64 61 62 82 98 68 57 Bacillus amyloliquefaciens LL3_CP002634
Bacillus amyloliquefaciens TA208_CP002627
Bacillus amyloliquefaciens XH7_CP002927
93
Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 HM747163
92
Bacillus amyloliquefaciens_AF453255
93
Bacillus amyloliquefaciens DSM7_FN597644
Bacillus amyloliquefaciens BAP_AY836773
Bacillus subtilis ATCC 12711_JQ437256
100
Bacillus subtilis McCoyRa_JN886002
100
Bacillus subtilis_AF029053
100
Bacillus subtilis_AJ277890
100
Bacillus subtilis US417 _AM501550
100 Bacillus subtilis XF-8_HM070997 99 97 100 100 0.01
của chủng Bacillus sp. B13, 96% với trình tự gen phytase của chủng Bacillus sp. DS11, 90% với trình tự gen phytase của Bacillus amyloliquefaciens DSM7. Trong cây phát sinh được xây dựng dựa trên trình tự gen phytase, các loài Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus subtilis nằm xen kẽ lẫn nhau. Khi so sánh vị trí của chủng SP1901 trong 2 cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự gen phytase và 6 gen cho thấy: trong cây xây dựng dựa trên 6 gen, vị trí của chủng SP1901 rất gần với 2 chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7 và Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42, tuy nhiên trong cây dựa trên trình tự gen phytase, vị trí chủng SP1901 chỉ gần với Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 và xa so với chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7. Như vậy, có thể thấy rằng trình tự gen phytase của các chủng trong cùng loài Bacillus amyloliquefaciens rất đa dạng và khẳng định thêm kết quả định danh chủng SP1901 đến mức dưới loài là Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum.
3.5.2 Đặc tính enzyme phytase thô
a/ Khả năng chịu nhiệt của enzyme phytase
Hình 29. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của phytase chủng SP1901
Một trong những ứng dụng lớn nhất của phytase là phụ gia thức ăn chăn nuôi. Quá trình chế biến cũng như đóng gói, bao viên thức ăn thường diễn ra trong một
khoảng thời gian nhất định ở nhiệt độ cao trong khoảng từ 65-95oC, đòi hỏi các enyme bổ sung có khả năng chịu được nhiệt độ trong khoảng thời gian đó (có tính bền nhiệt). Độ bền nhiệt của các sản phẩm phytase thương mại trở thành mối quan tâm lớn trong nhiều thời gian gần đây và đã có nhiều những nỗ lực nghiên cứu được thực hiện nhằm nâng cao khả năng bền nhiệt của enzyme phytase. Đặc tính bền nhiệt của enzyme là do khả năng biến tính thuận nghịch và hồi tính, enzyme có thể bị biến tính khi xử lý nhiệt và sau đó lại có thể gấp nếp về dạng tự nhiên và tái biểu hiện hoạt tính. Phytase của chủng SP1901 cũng đã được thử nghiệm khả năng bền ở các nhiệt độ 60, 70, 80, 90oC bằng cách ủ enzyme ở các nhiệt độ trên trong 10, 20, 30 phút sau đó xác định hoạt tính phytase. Các kết quả ở hình 29 cho thấy, phytase của chủng SP1901 bền ở 60oC sau 30 phút xử lý, hoạt tính vẫn giữ được khoảng 90%, ở 70oC hoạt tính chỉ còn 28% sau 30 phút xử lý và ở 80, 90oC phytase mất toàn bộ hoạt tính. Như vậy enzyme phytase của chủng nghiên cứu bền ở 60oC trong 30 phút. Trong một nghiên cứu của Yetti Marlida và cộng sự (2010), phytase của nấm Fusarium verticillioides bền nhiệt ở 50oC/30 phút và bị bất hoạt nhanh chóng khi nhiệt độ tăng dần trên 50oC [157]. Trong nghiên cứu của Farhat và cộng sự (2008), phytase của chủng Bacillus subtilis US417 bền ở 50oC sau 30 phút xử lý tuy nhiên hoạt tính phytase chỉ còn 22% sau 10 phút xử lý ở 60oC [29]. Một số chủng khác thuộc chi Bacillus như chủng Bacillus sp. DS11, Bacillus sp. MD2 có khả năng sinh phytase bền nhiệt. Phytase của Aspergillus fumigatus có tính bền nhiệt cao, sau khi bị biến tính ở 90oC đã gấp nếp trở lại và giữ nguyên hoạt tính [149].
Hình 30. pH hoạt động thích hợp của phytase chủng SP1901
Hình 31. Nhiệt độ hoạt động thích hợp của phytase chủng SP1901
Giá trị pH tối ưu có ảnh hưởng lớn đến tiềm năng ứng dụng của enzyme, đặc biệt là các enzyme được ứng dụng là phụ gia thức ăn chăn nuôi do ảnh hưởng của tính axit trong ống tiêu hóa của động vật. Phytase ở hầu hết các loài vi khuẩn thường có dải pH hoạt động tối ưu trong khoảng 4-5,5, tuy nhiên phytase của các loài thuộc chi Bacillus lại có khoảng pH hoạt động tối ưu cao hơn nằm trong khoảng 6,5-7,5 [96, 149]. Theo kết quả thu được ở hình 30 phytase của chủng SP1901 hoạt động tối ưu trong khoảng pH từ 5,6-7,2, ở pH dưới 3,2 phytase gần như không hoạt động được và từ pH trên 7,2, phytase giảm dần hoạt tính. Trong nghiên cứu của Gulati và cộng sự (2007) phytase tinh khiết của chủng Bacillus laevolacticus có pH hoạt động tối ưu là pH 7, ở pH 3 hoạt tính vẫn giữ được trên 20% và hoạt tính phytase cũng bắt đầu giảm dần khi pH trên 7. Theo một nghiên cứu mới đây của Moushree và cộng sự (2012), phytase của chủng Shigella sp. CD2 có pH hoạt động tối ưu là 5,5 [83].
Để nghiên cứu nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme phytase, chúng tôi đã tiến hàng ủ phản ứng enzyme - cơ chất ở các nhiệt độ 20, 30, 40, 50, 60, 70oC, sau đó xác định hoạt tính phytase. Với các kết quả thu được trong hình 31 phytase của chủng SP1901 có thể hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 40-60oC trong đó nhiệt độ thích hợp nhất là 50oC. Theo các kết quả nghiên cứu trước đây, phytase của B. subtilis, E. coli, Enterobacter sp. 4, Klebsiella aerogenes, K. oxytoca MO-3,
Selenomonas ruminantium, Shigella sp. CD2 có nhiệt độ hoạt động tối ưu nằm trong khoảng 50-60oC, trong khi đó phytase của Bacillus sp. DS11 và Bacillus laevolacticus, Bacillus sp. MD2 có nhiệt độ hoạt động tối ưu là 70oC [37, 57, 83, 149].
d/ Ảnh hưởng của các ion kim loại
Hình 32. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của phytase chủng SP1901
Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt động của phytase được khảo sát bằng cách xác định hoạt tính phytase trong sự có mặt của các ion và các hóa chất như: Zn2+, Mg2+, Mn2+, Ba2+, Ca2+, Cu2+, Na+, SDS, EDTA ở các nồng độ 1; 2; 5 mM. Theo kết quả thu được ở hình 32, sự có mặt của các enzyme như Ca2+ và Cu2+ ở nồng độ 2; 5 mM làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme, sự có mặt của SDS và Na+ ở các nồng độ 1; 2; 5 mM không làm thay đổi nhiều hoạt động của phytase, đặc biệt sự có mặt của EDTA ở nồng độ 1mM làm giảm một nửa hoạt tính phytase và EDTA ở nồng độ 2; 5 mM làm giảm toàn bộ hoạt tính phytase chứng tỏ phytase của SP1901 là loại phytase phụ thuộc kim loại. Sự có mặt của các ion kim loại khác như Zn2+, Mg2+, Mn2+, Ba2+ ở các nồng độ 1; 2; 5 mM làm giảm một phần hoạt tính phytase. Moushree và cộng sự (2012) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt động của phytase của chủng Shigella sp. CD2 và nhận thấy rằng
sự có mặt của Fe2+, Zn2+, Cu2+ và SDS(2 mM) làm giảm hoạt tính phytase chỉ còn 65, 72, 87, 4% trong khi đó sự có mặt của Ca2+, Mn2+, Mg2+ và Co2+ (2 mM) làm tăng hoạt tính phytase (tương ứng 119, 121, 135, 121%). Đặc biệt hoạt tính phytase không bị ức chế bởi sự có mặt của EDTA, do đó có thể cho rằng hoạt động chức năng của phytase từ Shigella sp. CD2 không hoàn toàn đòi hỏi sự có mặt của các ion kim loại. Các chất khử như 2- mercaptoethanol và cyscteine hydrochloride không ảnh hưởng đến hoạt động của phytase Shigella sp. CD2 [83]. Ngoài ra ảnh hưởng của các ion kim loại như Li+, Co2+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Hg2+, Cs+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Ba2+, EDTA lên phytase của chủng Bacillus subtilis US417 cũng đã được nghiên cứu, trong đó đã nhấn mạnh phytase của Bacillus subtilis US417 là phytase phụ thuộc kim loại do sự có mặt EDTA 1mM ức chế hoàn toàn hoạt tính phytase [29]. Ngoài ra, nghiên cứu ảnh hưởng của ion kim loại lên phytase đã được nhiều tác giả công bố: phytase từ Enterobacter sp.4 bị ức chế mạnh bởi các ion Zn2+, Ba2+, Cu2+, Al3+ [160]. Phytase từ B. subtilis (natto) N-77 bị ức chế bởi các ion Zn2+, Cd2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+ và Al3+, hoạt tính phytase của Emericella nidulans và
Aspergillus terreus CBS bị ức chế bởi 1 mM Cu2+, phytase từ A. fumigatus bị ức chế bởi Cu2+, Zn2+, Ca2+, Co2+, Mn2+, Ni2+ và Fe3+ (1 mM), trong khi đó EDTA (1 mM và 10 mM) làm tăng (~50%) hoạt tính enzyme [56, 156].
e/ Ảnh hưởng của Ca2+ đến độ bền nhiệt của phytase
Hình 33. Ảnh hưởng của Ca2+ đến độ bền nhiệt của phytase chủng SP1901 xử lý ở 60oC (phải), xử lý ở 70oC (trái)
Để nghiên cứu ảnh hưởng của Ca2+ đến độ bền nhiệt enzyme, phytase của chủng SP1901 được ủ ở 60 và 70oC trong 10, 20 và 30 phút trong điều kiện có mặt và không có mặt Ca2+ 2 mM. Ở 60oC, khi có mặt Ca2+ và không có Ca2+ ủ với enzyme, độ bền nhiệt của phytase gần như nhau và chỉ giảm dưới 10% so với mẫu đối chứng, tuy nhiên khi xử lý enzyme ở nhiệt độ 70oC, mẫu enzyme không ủ với Ca2+ hoạt tính giảm chỉ còn 30% sau 30 phút, với mẫu enzyme được ủ với Ca2+ 2mM hoạt tính enyme chỉ giảm dưới 10% so với mẫu đối chứng (hình 33). Điều đó chứng tỏ Ca2+ có ảnh hưởng tích cực đến độ bền nhiệt của enzyme phytase của chủng nghiên cứu. Kim và cộng sự (1998) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của Ca2+ đến độ bền nhiệt của phytase từ chủng Bacillus sp. DS11 và nhận thấy rằng hoạt tính phytase vẫn giữ được khoảng 50% khi enzyme được ủ ở 90oC trong 10 phút với sự có mặt của Ca2+ 5 mM [57]. Trong nghiên cứu của Thuy và cộng sự (2010), sự có mặt của Ca2+ 5mM đã làm tăng độ bền nhiệt của phytase của chủng Bacilus sp. MD2 khi xử lý ở 70, 80, 90, 100oC. Sau 20 phút enzyme được xử lý nhiệt ở 70, 80, 90, 100oC có mặt Ca2+ 5 mM hoạt tính enzyme vẫn giữ lại khoảng 98, 64, 60, 23% (lần lượt), sau 30 phút xử lý hoạt tính enzyme giữ lại được khoảng 97, 57, 38, 3% (lần lượt). Như vậy Ca2+ có ảnh hưởng tích cực đến độ bền nhiệt của phytase chủng
Bacilus sp. MD2 [139].
f/ Độ bền nhiệt của enzyme trên cơ chất sấy khô
Hình 34. Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất được sấy khô ở 50oC trong 24h
Khi môi trường xốp sau lên men được sấy ở 50oC sau 24-48h và xử lý nhiệt với chính các mẫu lên men xốp đó lần lượt ở các nhiệt độ 60, 70, 80, 90oC trong 30 phút sau đó chiết xuất enzyme và xác định hoạt tính thì thấy khi cơ chất sấy khô được xử lý ở 90o
C hoạt tính enzyme vẫn còn 12,5; 19,73 và 31% sau 30, 20, 10 phút xử lý nhiệt. Kết quả cho thấy khi enzyme vẫn ở trong cơ chất được sấy khô, chưa chiết xuất thì tính bền nhiệt của enzyme cao hơn (hình 34). Trong một nghiên cứu của Marshall và cộng sự (1980) cho rằng trong tự nhiên có nhiều enzyme ở dạng glycoprotein và đây là bằng chứng gợi ý rằng carbohydrate khi kết hợp với enzyme sẽ làm cho enzyme bền vững hơn nên các enzyme chứa carbohydrate bền hơn so với các enzyme không chứa carbohydrate, vì thế ông và cộng sự đã quan tâm đến việc cải thiện độ bền của enzyme bằng cách gắn chúng với carbohydrate. Với cách làm này có thể tăng độ bền enzyme khi bảo quản, hoạt tính enzyme vẫn giữ được trong các điều kiện sử dụng bất lợi, chống lại được các tác nhân ức chế enzyme tự nhiên và nhiều các đặc tính quý khác [74].
g/ Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt động của enzyme.
Hình 35. Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt động của phytase chủng SP1901
Một trong những yêu cầu cần thiết đối với enzyme ứng dụng trong chăn nuôi là phải có khả năng chống chịu được hệ enzyme thuỷ phân trong đường tiêu hoá của động vật. Đặc tính này giúp enzyme thực hiện chức năng xúc tác sinh học trong đường tiêu hoá. Chính vì vậy việc nghiên cứu khả năng mẫn cảm với những enzyme
thuỷ phân chủ yếu trong đường tiêu của động vật có ý nghĩa quyết định đến cách ứng dụng của enzyme. Theo kết quả nhận được trong hình 35, phytase của chủng SP1901 không bị ảnh hưởng bởi trypsin 0,1 mg/ml pH 8 tuy nhiên lại khá mẫn cảm với pepsin (hoạt tính giảm chỉ còn gần 30% sau 30 phút tiếp xúc với pepsin). Kết quả này cũng trùng với kết quả nghiên cứu của Powar và cộng sự (1982) khi cho rằng phytase từ Bacillus substilis rất bền dưới tác động của papain, pancreatin, trypsin và elastase tuy nhiên enzyme này lại mẫn cảm với pepsin [101]. Ở các loại phytase khác nhau thì khả năng kháng các enzyme thủy phân protein như pancreatic và pepsin là khác nhau. Phillippy BQ (1999) cho rằng các phytase sẵn có trong lúa mỳ dễ bị bất hoạt bởi pepsin hơn là phytase của A. niger do khi ủ phytase của A. niger và lúa mỳ với 5mg pepsine/ml ở pH 3,5; phytase A. niger vẫn giữ được 95% hoạt tính còn phytase trong lúa mỳ chỉ còn giữ 70% hoạt tính ban đầu [100]. Igbasan và cộng sự (2000) cho rằng phytase của E. coli không mẫn cảm với pepsine và pancreatine [49]. Phytase của chủng Shigella sp. CD2 giữ được khoảng 80% hoạt tính sau khi xử lý với pepsine và trypsin 0.1mg/ml trong 60phút và phytase tái tổ hợp từ A. niger trên P. pastoris trong nghiên cứu của Ngô Thanh Xuân và cộng sự (2011) không mẫn cảm pepsin (2000 U/ml, pH 2) nhưng mẫn cảm với pancreatin (2 mg/ml) [2, 83]. Các sản phẩm phytase thương mại cần có tính kháng các protease trong suốt hệ tiêu hóa của động vật dạ dày đơn tuy nhiên đối với các enzyme không có đặc tính này, để khắc phục điều này enzyme phytase có thể được bọc bằng vỏ