a. Tách chiết ADN của vi khuẩn
Thực hiện theo phương pháp của Sakiyama và cộng sự (2009)
- Nuôi vi khuẩn trên môi trường dịch thể thích hợp. Thu dịch, ly tâm 10000 vòng/phút, 15phút. 1,5ml dịch nuôi lấy sinh khối tế bào và hoà trong 100 l TE. Thêm 0,4 mg lysozyme. Trộn đều, ủ 37oC trong 1 h. Trộn đều 3 phút. Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 37oC/30 phút. Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều. Ly tâm 15.000
vòng/phút, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác. Thêm 8 l ARNse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút. Thêm 12 l proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 56oC. Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều. Ly tâm 15.000 vòng/phút, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác. Thêm 1 thể tích tương ứng chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000 vòng/phút, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác. Thêm 1/10 thể tích natri acetat 3M và 1ml ethanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút. Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên và rửa tủa bằng ethanol 70%. Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không. Hoà tan ADN trong 50-100l nước hoặc TE.
b. Phản ứng khuếch đại ADN
Thành phần phản ứng (l): 10X buffer-10; dNTP 2 mM-10; mồi xuôi (10 pmol/l)- 2; mồi ngược (10 pmol/l)-2; Taq polymerase (5u/l)-2; ADN khuôn (50- 100g/l)-1-2; H2O đủ 100l Chu trình nhiệt: 95oC - 3 phút 95oC - 30giây 55oC - 30 giây 35 chu kỳ 72oC - 1 phút 4oC - Mồi
Cho khuếch đại ADNr 16S
Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. Mồi ngược 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'
Cho khuếch đại 5 gen : gyrA, rpoB, purH, polC, groEL (A. P. Rooney và cộng sự, 2009)
Bảng 3. Trình tự mồi dùng cho phản ứng khuếch đại 5 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL Mồi Trình tự 5’-3’ gyrA-42f* CAGTCAGGAAATGGGTAGGTCCTT gyrA-1066r* CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT rpoB-2292f GACGTGGGATGGCTACAACT rpoB-3354r ATTGTCGCCTTTAACGATGG purh-70f ACAGAGCTTGGCGTTGAAGT purh-1013r GCTTCTTGGCTGAATGAAGG polC-1505f TTGTCGCTCAYAATGCAAGC polC-2337r YTCAAGCATTTCRTCTGTCG groEL-550f GAGCTTGAAGTKGTTGAAGG groEL-1497r TGAGCGTGTWAACTTTTGTWG
(* Trình tự mồi gyrA của Chun và Bae, 2000)
- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di.
Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.
c. Tinh sạch sản phẩm PCR.
Sử dụng bộ kit QIAgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:
Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 nm và 280 nm. Tính tỷ lệ tinh sạch : OD 260/OD 280 > 1,7.
d. Phản ứng khuếch đại ADN cho đọc trình tự
Terminator Ready Reaction Mix (Termix): Buffer 5X- 9 l, Bigdye Ready Reaction premix-18 l, H2O- 9l. Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình tự: Termix- 8 l,
dNTP 2 mM-10, Mồi (*)- 1 l, ADN khuôn -1 l (nồng độ ADN là 40-60 g/ml), H2O- 10 l. .
(*) Các loại mồi đã sử dụng: Cho đọc trình tự ADNr 16S
Bảng 4. Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S
Mồi Trình tự 5’-3’ 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1525R AAAGGAGGTGATCCAGCC 780F GAATTGATACCCTGGTAG 350R CTGCTGCCTCCCGTAG 1100F GCAACGAGCGCAACCC 920R GTCAATTCCTTTGAGTTT
Cho đọc trình tự 5 gen: gyrA, rpoB, purH, polC, groEL như mồi cho khuếch đại. - Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen:
96oC - 1phút
96oC - 10giây 50oC - 5 giây 25 chu kỳ 60oC - 4 phút
e. Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự
Chuyển 20 l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch, thêm 5 l EDTA 125 mM và 60 l ethanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 15.000 vòng/phút, 15phút. Bỏ dịch, thêm 60l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000 vòng/phút, 10 phút. Làm khô. Thêm 10 l HiDi Formamide. Để ở 96o
C trong 2 phút sau đó ngay mẫu vào nước đá lạnh. Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự. Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant.
f. Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Trình tự của ADNr 16S được xác định theo phương pháp của Sikiyama và cộng sự (2009), sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver 1.83 của Thompson và đồng
tác giả (1994). Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987) với độ lặp lại 1000 lần trên phần mềm MEGA phiên bản 5.05.