Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter cho sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Nồng độ muối khoáng cần thiết đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn 7 Bảng 1.2: Hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh đối với lúa ở một số quốc gia châu Á 22 Bảng 3

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ LINH

TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN AZOTOBACTER CHO SẢN

XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Thị Linh

TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN Azotobacter CHO SẢN

XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH VẬT

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

HCVSV: hữu cơ vi sinh vật

AIA: axit indol axetic

HCN: axit cyanhidric

Cs: cộng sự

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Nồng độ muối khoáng cần thiết đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn 7

Bảng 1.2: Hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh đối với lúa ở một số quốc gia

châu Á

22

Bảng 3.1: Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Azotobacter mới phân lập 32

Bảng 3.2: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter 34

Bảng3.3: Khả năng sinh tổng hợp AIA thô của các chủng Azotobacter 37

Bảng 3.4: Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh của các chủng

Bảng 3.5: Hoạt tính sinh học của chủng Azotobacter lựa chọn 40

Bảng 3.7: Khả năng sinh trưởng phát triển của các chủng trong môi trường

Bảng 3.8: Khả năng tồn tại của các chủng vi khuẩn lựa chọn khi nuôi trong

Bảng 3.9: Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lựa chọn khi nuôi cấy

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của phân hữu cơ đến cây trồng trong giai đoạn đầu ở

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của phân hữu cơ đến khả năng sinh trưởng và phát

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của phân hữu cơ tới năng suất và các yếu tố cấu

Hình 3.5: Ảnh hưởng của phân bón vi sinh vật đến khả năng sinh trưởng,

Hình 3.6: Tác động của phân bón vi sinh đến khả năng sinh trưởng, phát triển

Biểu đồ 3 1: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter 34

Biểu đồ 3 2: Khả năng sinh tổng hợp AIA thô của các chủng Azotobacter 37

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi khuẩn Azotobacter 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái và các đặc tính sinh lí, sinh hóa của Azotobacter. 3

1.1.2 Nguồn dinh dưỡng 4

1.1.3 Ảnh hưởng các nhân tố sinh thái đến sinh trưởng và phát triển của Azotobacter. 8

1.2 Sự phân bố của Azotobacter trong đất. 10

1.3 Khả năng cố định nitơ của Azotobacter 12

1.3.1 Quá trình cố định nitơ sinh học 12

1.3.2 Vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter 13

1.4 Khả năng kích thích sinh trưởng của Azotobacter. 14

1.4.1 Chất kích thích sinh trưởng ở thực vật. 14

1.4.2 Vi khuẩn sinh AIA: Azotobacter 15

1.5 Tính kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum. 16

1.5.1 Vi khuẩn R.solanacearum 16

1.5.2 Tính kháng R.solanacearum của Azotobacter 16

1.6 Chế phẩm phân bón chứa Azotobacter và hiệu quả trong trồng trọt trong

những nghiên cứu ban đầu 17

1.7 Tình hình nghiên cứu và sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật ở trong nước

và ngoài nước 19

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Vật liệu 23

2.1.1 Mẫu đất và vi sinh vật. 23

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ 23

2.2 Phương pháp 24

2.2.1 Lấy mẫu đất 24

2.2.2 Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật 24

2.2.3 Xác định khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật 25

2.2.4 Xác định khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh 26

2.2.5 Xác định tên vi sinh vật 27

2.2.6 Thí nghiệm ở quy mô nhà lưới và đồng ruộng diện hẹp với cây lạc. 27

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter hữu hiệu 31

3.1.1 Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng cố định nitơ 33

3.1.2 Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng sinh tổng hợp AIA 35

3.1.3 Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng ức chế vi khuẩn gây

bệnh héo xanh 38

3.2 Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter để sản xuất chế phẩm 40

3.3 Xác định tên các chủng lựa chọn 44

3.4 Đánh giá tác động của chế phẩm Azotobacter đến khả năng sinh trưởng,

phát triển và năng suất của cây lạc 47

3.4.1 Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm Azotobacter đối với cây lạc ở điều

kiện nhà lưới 47

3.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm Azotobacter đối với cây lạc L14

trên đồng ruộng diện hẹp. 49

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 53

Đất nước ta có nền kinh tế nông nghiệp là chủ yếu thì việc quan tâm đến năng suất và chất lượng nông sản là mục tiêu hàng đầu vì không những giúp nâng cao đời sống của nông dân mà còn thúc đẩy sự phát triển nền kinh tế quốc gia Phân bón HCVSV (hay còn gọi là phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống được tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định Phân bón HCVSV góp phần nâng cao năng suất cây trồng và chất lượng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô cơ, đóng góp quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông, lâm nghiệp bền vững Vì vậy, nghiên cứu và sử dụng nguồn dinh dưỡng tạo ra từ các hoạt động sống của vi sinh vật đã và đang được nhiều nước trên thế giới quan tâm và phát triển

Bên cạnh các sản phẩm phân HCVSV đơn chủng đã được nghiên cứu và sử dụng hiệu quả như: Nitragin, Rhizoda, Azogin, Rhizolu, Phosphobacterin, Azotobacterin một số nghiên cứu gần đây cho thấy chế phẩm phân bón tổng hợp bao gồm các nhóm cố định nitơ, phân giải photphat, kích thích sinh trưởng thực vật, đối kháng vi sinh vật gây bệnh (chế phẩm EM, vi sinh vật tổng hợp) có tác dụng đối với cây trồng tốt hơn so với từng loại vi sinh vật riêng rẽ

Nhiều kết quả nghiên cứu về phân bón HCVSV đã khẳng định, hiệu quả của phân HCVSV phụ thuộc hoạt tính sinh học, khả năng cạnh tranh với vi sinh vật có sẵn trong đất và khả năng thích ứng với điều kiện môi trường đất của các vi sinh vật

sử dụng trong phân bón [13], [14], [15] Phân vi sinh vật đặc biệt có ý nghĩa sử dụng nếu các vi sinh vật sử dụng có nhiều hoạt tính sinh học

Azotobacter là nhóm có phổ phân bố khá rộng Các nghiên cứu trước đây đã

phát hiện ra nhiều đặc tính quý của Azotobacter như khả năng cố định nitơ tự do,

kích thích sinh trưởng, đối kháng, sinh polyshacarit v.v [5], [12]

Để sản xuất phân bón HCVSV tốt, phải có chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao, đa hoạt tính, khả năng tồn tại lớn Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật là việc làm không thể thiếu trong quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh vật [11] Đây là đề tài nghiên cứu mà chúng tôi đang hướng tới

Mục đích nghiên cứu

Tuyển chọn các chủng Azotobacter có hoạt tính sinh học cao (cố định nitơ,

kích thích sinh trưởng và đối kháng bệnh héo xanh) để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh cho cây lạc

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác

- Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter thích hợp để sản xuất phân bón

- Phân loại và mức độ an toàn của các chủng vi sinh vật nghiên cứu

- Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp các chủng Azotobacter lựa chọn đến sinh

trưởng, phát triển và năng suất của cây lạc (thí nghiệm trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng diện hẹp)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Azotobacter

1.1.1 Đặc điểm hình thái và các đặc tính sinh lí, sinh hóa của Azotobacter

Họ Azotobacteraceae gồm 2 chi Azotobacter (Beijerinck, 1901) và Azomonas

(Winogradsky, 1938)

Azotobacter được phân lập lần đầu tiên vào năm 1901 Đó là loài Azotobacter chroococcum, về sau người ta tìm thấy nhiều loài khác trong chi Azotobacter

(beijerinskii, vinelandii, agllis)

Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất, hiếu khí, không sinh

bào tử, Gram âm Khi còn non tế bào thường có dạng hình que, kích thước khoảng 2,0- 7,0 × 10- 2,5 μm, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi chồng chất, tế bào nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động nhờ tiên mao mọc khắp cơ thể (chu

mao) Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại

trông giống như hình cầu Nguyên sinh chất xuất hiện nhiều hạt lổn nhổn Đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… Quan sát dưới kính hiển vi ta còn thấy khi già

tế bào Azotobacter được bao bọc bởi một vỏ nhầy khá dày Vỏ nhầy của vi khuẩn

Azotobacter chứa khoảng 75 % là chất hiđrit của axit uronic và chứa khoảng 0,023

% nitơ Lượng ADN trong tế bào Azotobacter thường thấp hơn so với nhiều loại vi

khuẩn khác (0,70- 0,81%) [4]

Azotobacter có thể sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn thức ăn

cacbon Chúng cũng cần nhiều nguyên tố khoáng, đặc biệt là 2 nguyên tố vi lượng bor (B) và molipden (Mo)(Mo cần cho quá trình cố định nitơ)

Khi sống trong điều kiện không có nitơ, Azotobacter sẽ dùng nitơ của không

khí để biến thành nitơ của cơ thể sống Khi sống trong môi trường đủ thức ăn nitơ

hữu cơ hoặc vô cơ thì tác dụng cố định nitơ sẽ rất thấp hoặc không có Azotobacter

thích hợp với điều kiện hiếu khí vừa phải và pH trung tính hoặc hơi kiềm

Khi nuôi trong môi trường thạch, vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi

hoặc tan, lúc đầu không màu, sau biến thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen

nhưng không làm nhuộm màu môi trường Ngoài ra một số loài Azotobacter có

dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng

Vi khuẩn Azotobacter thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, sống theo phương thức dị

dưỡng Chúng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau: disacarit, dextrin, tinh bột, axit hữu cơ, hợp chất thơm … Tuy vậy, nhiều tác giả cho biết có không ít

chủng Azotobacter không có khả năng đồng hoá lactose, manitơl hoặc natribenzoat

[12]

Trên các môi trường không chứa nitơ khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đôi khi nhăn nheo, chứng tỏ vi khuẩn Azotobacter có khả năng sinh trưởng trên môi

trường không có nitơ Sở dĩ chúng tồn tại được là vì có khả năng đồng hoá muối

amonium, urê Một số chủng Azotobacter có khả năng sử dụng nitrit, nitrat Hai loại axit thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dưỡng của Azotobacter là axit glutamic và

axit asparaginic

1.1.2 Nguồn dinh dưỡng

Vi sinh vật cũng như các loài động thực vật khác, luôn có nhu cầu sử dụng những chất chúng có thể hấp thụ từ môi trường xung quanh và được sử dụng làm nguyên liệu để cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào hoặc để cung cấp cho các quá trình trao đổi năng lượng Tuy nhiên không phải mọi thành phần của môi trường nuôi cấy đều được coi là chất dinh dưỡng Một số chất rắn cần thiết cho vi sinh vật nhưng chỉ làm nhiệm vụ bảo đảm các điều kiện thích hợp về thế oxy hoá - khử, về pH, về áp suất thẩm thấu, về cân bằng ion v.v… Chất dinh dưỡng phải là những chất có tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào

Nguồn cacbon

Cacbon chiếm tỷ lệ trên 50% vật chất khô của vi sinh vật Cacbon là yếu tố đặc biệt quan trọng trong cấu trúc tất cả các hợp chất có mặt trong tế bào Hợp chất cacbon là nguồn năng lượng quan trọng trong hoạt động sống của vi sinh vật Trong

tự nhiên có hai dạng hợp chất cacbon cơ bản là: Cacbon vô cơ và cacbon hữu cơ Các loại vi sinh vật khác nhau sử dụng các nguồn cacbon không giống nhau Tuỳ

theo nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO2, NaHCO3, CaCO3 …) hoặc hữu cơ Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố:

+ Thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn

+ Đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật

Hầu như không có hợp chất cacbon hữu cơ nào mà không bị nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân huỷ

Về thức ăn cacbon, Azotobacter có khả năng đồng hoá, nhiều loại

monosaccarit (glucoza, fructoza, galactoza, manoza arabinoza, xyloza), disaccarit (saccaroza, maltoza, trehaloza, melibioza, lactoza), trisaccarit (raffinoza melizitoza), polysaccarit (tinh bột, dextrin, glycogen, inulin), 2,3 butylenglycol, glyxerin, mannit, sorbit, inozit, các oxi axit (như axit lactic, axit glycolic, axit saccaric, axit sucxinic, axit malic, axit limonic, axit glycolic, axit galactonic, axit mannonic , axit glyxetinic, axit pyruvic, axit quinic, axit butyric, axit valeric, axit cepronic), các diaxit (axit fumaric, axit maleic, axit malonic, axit oxaloaxetic) các hợp chất thơm (như axit benzoic, axit salixilic, phenol )

Khả năng đồng hoá các nguồn thức ăn cacbon nói trên không phải là giống

nhau ở tất cả các chủng Azotobacter Có không ít các chủng Azotobacter không có

khả năng đồng hoá lactoza, mannit hoặc natri benzoat Khi đồng hóa glucose,

Azotobacter thường làm tích luỹ lại trong môi trường axit pyruvic, axit lactic và

etanol Chính vì lí do này cho nên khi phát triển Azotobacter thường làm axit hoá

môi trường nuôi cấy

Nguồn nitơ

Nguồn dinh dưỡng nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+ Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp với nhiều loại nấm men và vi khuẩn Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc

NO3- các ion kim loại còn lại: K+, Na+, Mg2+,… làm kiềm hoá môi trường Để tránh

hiện tượng này người ta sử dụng muối NH4NO3 làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật Tuy nhiên gốc NH4+ thường bị hấp thụ nhanh rồi mới hấp thụ đến gốc

NO3

-Đa số vi khuẩn không có khả năng đồng hóa N2 trong không khí, tuy nhiên có những vi sinh vật có thể chuyển hoá N2 thành NH3 nhờ hoạt động xúc tác của hệ thống enzym nitrogenaza, các vi sinh vật này gọi là các vi sinh vật cố định nitơ Cụ

thể có các loại như: Rhizobium, Azotobacter, Clostridium, v.v…

Vi sinh vật còn có khả năng đồng hoá rất tốt nitơ chứa trong thức ăn hữu cơ Thức ăn này vừa là nguồn thức ăn cacbon vừa là nguồn thức ăn nitơ cho chúng Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton – loại chế phẩm thuỷ phân không triệt để của một nguồn protein nào đó

Nguồn khoáng

Ngoài các chất hữu cơ, vô cơ, nước v.v… trong tế bào vi sinh vật còn chứa nhiều chất khoáng Lượng chất khoáng trong tế bào thường thay đổi tuỳ loài, tuỳ từng giai đoạn và điều kiện sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật Mỗi nguyên tố đều có tác dụng nhất định đối với sinh trưởng, phát triển của tế bào mà các nguyên

tố khác không thể thay thế được Nguyên tố khoáng được chia làm 2 loại chính:

- Các nguyên tố đa lượng gồm có: P, K, Ca, S, Mg, Fe, Na, Cl …

- Các nguyên tố vi lượng gồm có: Mn, Cu, Co, B …

Nhu cầu của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với từng loài, từng giai đoạn phát triển Theo nghiên cứu người ta nhận thấy nồng độ cần thiết về các muối khoáng đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn thường thay đổi trong các phạm vi sau:

Bảng 1.1: Nồng độ muối khoáng cần thiết đối với vi khuẩn, nấm và xạ

các chất khoáng chứa trong nguyên sinh chất thường thay đổi tuỳ loài, tuỳ từng giai đoạn phát triển và điều kiện nuôi cấy

Bình thường khi nuôi cấy vi sinh vật, người ta không cần bổ sung các nguyên

tố vi lượng Những nguyên tố này có sẵn trong nước máy, trong các hoá chất dùng làm môi trường hoặc có lẫn trong thuỷ tinh của các dụng cụ nuôi cấy Tuy nhiên cũng có một số trường hợp cụ thể phải bổ sung các nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cấy Ví dụ: Bổ sung Zn vào các môi trường nuôi cấy nấm mốc, bổ sung

Bo và Mo vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật cố định đạm

Chất sinh trưởng

Muốn phát triển bình thường vi sinh vật không những đòi hỏi phải được cung cấp đầy đủ protein, lipit, gluxit, muối khoáng… mà còn cần tới các chất sinh trưởng

Tuỳ thuộc vào khả năng sinh tổng hợp của từng loại vi sinh vật mà cùng một chất có thể hoàn toàn không cần thiết với vi sinh vật này nhưng có thể là có tác dụng kích thích sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật khác Hầu như không có chất nào là chất sinh trưởng chung đối với tất cả các loài vi sinh vật Tuỳ theo từng loại

vi sinh vật mà chúng ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy những chất sinh trưởng khác nhau

1.1.3 Ảnh hưởng các nhân tố sinh thái đến sinh trưởng và phát triển của

Azotobacter

Vi khuẩn Azotobacter hiếu khí, sự phát triển và khả năng cố định nitơ của

chúng trong đất chịu ảnh hưởng của các điều kiện sau:

Độ ẩm của đất

Azotobacter đòi hỏi độ ẩm rất cao của đất Nhu cầu về độ ẩm của chúng cao

hơn so với các vi khuẩn khác, tương đương với nhu cầu của cây trồng Vì vậy ít gặp chúng ở vùng khô hạn, sự khô hạn của đất chỉ có bào xác của chúng mới chịu đựng

được Ẩm độ thích hợp: 75- 80 %

Độ thoáng khí

Độ thoáng khí của đất có liên quan đến quá trình cố định nitơ của Azotobacter Tuy vậy vi khuẩn Azotobacter thuộc loại hiếu khí nhưng có thể phát triển được trong điều kiện vi hiếu khí Quá trình cố định nitơ của Azotobacter bị giảm khi thế

ôxi hoá khử của môi trường cao quá (+) 200 mv hoặc thấp quá (–) 200 mv Như vậy, không khí quá mạnh cũng ức chế quá trình cố định nitơ phân tử, khi nồng độ ôxi trong không khí là 4 % quá trình cố định nitơ vượt quá ba lần so với khi ôxi là

10- 20 %

Nhiệt độ

Mỗi loại vi sinh vật thích ứng ở nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng và tạo sản phẩm Tuỳ theo quan hệ với các vùng nhiệt khác nhau, có thể phân chia vi sinh vật thành các nhóm cơ bản sau: nhóm ưa lạnh, nhóm ưa ấm và nhóm ưa nhiệt Vì vậy, nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật

Nhiệt độ ảnh hưởng đến Azotobacter không giống nhau ở các vùng địa lí khác nhau Ở vùng nhiệt đới Azotobacter có khả năng chịu được nhiệt độ 35oC -400C Ở

70C Azotobacter có hoạt động cố định nitơ thấp hơn 5 lần so với ở 450C Tế bào

dinh dưỡng của Azotobacter không sống được khi xử lí 500C trong 30 phút, ở 800C

sẽ chết rất nhanh Nhiệt độ thích hợp đối với sự phát triển của Azotobacter vào

khoảng 20-300C

pH của đất

pH có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng của nhiều loài vi sinh vật Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có những ảnh hưởng mạnh mẽ Các loại vi sinh vật khác nhau có khả năng thích nghi với các điều kiện pH khác nhau

pH của đất ảnh hưởng không giống nhau đến sự phát triển và khả năng cố định

N của Azotobacter Azotobacter thích hợp nhất với pH = 7,2- 8,2, song có thể phát

triển được ở pH = 4,5- 9,0 Các loài Azotobacter khác nhau mẫn cảm khác nhau đối

với pH của môi trường Chẳng hạn: pH thấp nhất của môi trường đối với

Azotobacter chroococcum và A beijerinck khoảng 5,5; đối với A macrocytones là

khoảng 4,6

Phần lớn Azotobacter chỉ phát triển ở pH lớn hơn 6, vì vậy ít gặp chúng ở đất

chua Cũng có thể phân lập được một số chủng từ đất chua nhưng các chủng này thường đã mất khả năng cố định nitơ

Các nhân tố sinh học

Sự phát triển và cố định nitơ của Azotobacter trong đất còn chịu ảnh hưởng

mật thiết của khu hệ các sinh vật đất Bên cạnh các nhóm vi sinh vật có ảnh hưởng

tốt còn có nhiều nhóm có khả năng ức chế sự phát triển của Azotobacter

Ngoài ra các yếu tố khác như phân đạm, phân lân, phân kali cũng có ảnh

hưởng không nhỏ tới sự sống và quá trình cố định nitơ của Azotobacter

1.2 Sự phân bố của Azotobacter trong đất

Đất là môi trường thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật Trong thành phần sinh vật đất, vi sinh vật chiếm tới 90% Trong thành phần cacbon hữu cơ của đất, vi sinh vật chiếm khoảng 2% Số lượng vi sinh vật trong mỗi gam đất có tới hàng triệu, hàng tỉ và tới vài chục tỉ tế bào Vi khuẩn là nhóm chiếm số lượng lớn nhất trong đất (106 – 1010 tế bào/gam đất) nhưng vì kích thước nhỏ (khoảng 1µm) nên chúng chỉ chiếm không quá 20% trọng lượng của vi sinh vật trong đất [23], [29]

Ở chiều sâu đất 10 – 20cm so với bề mặt Azotobacter và các vi sinh vật khác

thấy có số lượng nhiều hơn các tầng đất khác Ở tầng đất này độ ẩm thích hợp, các chất dinh dưỡng tích lũy nhiều, không bị tác dụng của ánh sáng mặt trời nên hệ vi sinh vật phát triển nhanh, các quá trình chuyển hóa quan trọng trong đất chủ yếu xảy ra trong tầng đất này [10]

Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật phát triển mạnh nhất so với vùng không có rễ, vì rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ khi chết đi Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ độ

ẩm Tất cả những yếu tố đó làm cho số lượng vi sinh vật, trong đó có cả

Azotobacter phát triển ở vùng rễ mạnh hơn vùng ngoài rễ Tuy nhiên, mỗi loại cây

trồng trong quá trình sống thường tiết qua bộ rễ những chất khác nhau Bộ rễ chết đi cũng có thành phần các chất khác nhau Thành phần và số lượng các chất hữu cơ tiết ra từ bộ rễ quyết định thành phần và số lượng vi sinh vật sống trong vùng rễ đó

Ví dụ: vùng rễ cây họ đậu thường phân bố nhóm vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh

(Rhizobium), còn vùng rễ lúa là nơi cư trú của các nhóm cố định nitơ tự do

(Azotobacter) hoặc nội sinh [10]

Kết quả nghiên cứu sự phân bố của Azotobacter trong vùng rễ và ngoài vùng

rễ từ cánh đồng lúa mì ở Bangladesh, cho thấy rõ hơn sự có mặt của Azotobacter

ngoài vùng rễ đạt 5.2 x 104

– 7.2 x 104 CFU/g và trong vùng rễ đạt 17.2 x 104 – 25.5

x 104 CFU/g [28]

Azotobacter phát triển mạnh trong điều kiện đất thoáng khí, độ ẩm của đất cao

Tuy nhiên, yếu tố có tính quyết định đến sự có mặt của Azotobacter trong đất lại là

sự phản ứng của đất Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng Azotobacter chỉ thích

ứng với đất ít chua hoặc trung tính [9], [18]

Các điều tra ở đất Việt Nam cho biết, khi pH đất thấp hơn 5,5 sự phát triển của

Azotobacter bị hạn chế một cách rõ rệt Trong khi đó ở các đất có pH trung tính Azotobacter luôn có từ hàng nghìn đến hàng vạn tế bào trong mỗi gam chất khô [4]

Như vây, trên đất phù sa sông Hồng và sông Cửu Long luôn có mặt

Azotobacter Tuy nhiên, cùng là đất phù sa nhưng hoạt động của Azotobacter lại

không giống nhau Đất phù sa sông Hồng thường có số lượng Azotobacter cao hơn

đất phù sa sông Cửu Long do ưu điểm nổi bật của đất phù sa sông Hồng có pH trung tính [2]

1.3 Khả năng cố định nitơ của Azotobacter

1.3.1 Quá trình cố định nitơ sinh học

Nitơ là nguyên tố trơ khó liên kết hóa học với các nguyên tố khác, nếu không

có chất xúc tác và các điều kiện đặc biệt khác, nó không ngừng bị chuyển hóa trong một chu trình khép kín do các tác động sinh học hay hóa học khác nhau Dưới tác động của các hoạt động hóa học hoặc sinh học, nitơ phân tử được chuyển hóa thành đạm vô cơ, sau chuyển hóa thành đạm thực vật hoặc động vật thông qua quá trình đồng hóa Một phần đạm thực vật dưới dạng tàn dư thực vật và một phần khác được con người, động vật thải ra dưới dạng phân bón được trả lại cho đất Đạm trong đất, một phần được cây trồng sử dụng, số còn lại bị mất do rửatrôi hoặc bay hơi do hoạt động của các vi sinh vật đất có khả năng phân giải đạm Quá trình đất mất đạm chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các chế độ canh tác [15]

Nitơ đồng thời cũng là yếu tố dinh dưỡng vô cùng quan trọng không chỉ với các sinh vật bậc cao mà cả với các sinh vật nhỏ mắt thường không nhìn thấy được Trong

tự nhiên, nitơ phân tử tồn tại dưới dạng khí chiếm tới 78,16% thể tích không khí, song lại không sử dụng được làm nguồn dinh dưỡng cho sinh vật Để cây trồng có thể sử dụng nguồn tài nguyên này làm chất dinh dưỡng, nitơ không khí phải được chuyển hóa thông qua quá trình cố định nitơ (cố định đạm), trong đó nitơ phân tử được chuyển hóa thành amôn

Quá trình cố định nitơ có thể xảy ra nhờ các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học, trong đó người ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm sinh học vì hiệu quả

và tính an toàn của nó đối với môi trường [15]

Trong một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử là một bí ẩn đầy hấp dẫn của tự nhiên Quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N2 thành

NH3có xúc tác của enzym nitrogenaza, khi có mặt của ATP

N2 + AH2 + ATP nitrogenaza NH3 + A + ADP +P

Năm 1992 các nhà khoa học đã hoàn thiện được cơ chế của quátrình cố định nitơ phân tử như sau [4]

N = N NH = NH H2N-NH2 NH3

N2 + 8H+ + 8e- + 16 Mg.ATP + 16º nitrogenaza 2NH3 + H2 +16 Mg.ADP + 16P

1.3.2 Vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter

Vi khuẩn cố định nitơ tốt nhất và được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là

Azotobacter Azotobacter không có khả năng đồng hóa chất mùn, chúng chỉ có khả

năng phát triển mạnh trong đất có chứa nhiều chất hữu cơ dễ đồng hóa Azotobacter

đồng hóa rất tốt các sản phẩm phân giải của cellulose

Phần lớn các chủng Azotobacter phân lập được từ thiên nhiên có khả năng cố

định được trên 10 mg N2 khi tiêu thụ hết 1g các hợp chất cacbon Một số chủng

Azotobacter trong những điều kiện thích hợp có khả năng đồng hoá được đến 300

mg N2/g hợp chất cacbon [4]

Sự phát triển và cố định nitơ của Azotobacter trong đất còn chịu ảnh hưởng

mật thiết của khu hệ các vi sinh vật đất Bên cạnh các nhóm vi sinh vật có ảnh

hưởng tốt đối với sự phát triển của Azotobacter (tổng hợp các chất hoạt động sinh

học, phân giải các thức ăn hữu cơ bền vững) còn có nhiều nhóm vi sinh vật có khả

năng ức chế sự phát triển của Azotobacter (cạnh tranh thức ăn, sản sinh chất kháng

sinh v.v ) [4]

Đã có nhiều công trình nghiễn cứu đề cập đến mối quan hệ giữa Azotobacter

và cây trồng Azotobacter thường xuyên có mặt trong vùng rễ cây trồng với số

lượng cao hơn nhiều so với ngoài vùng rễ Số lượng của chúng còn biến đổi phụ thuộc vào từng loài cây, từng giai đoạn phát triển của cây và nhiều yếu tố sinh thái -

địa lý khác Azotobacter không phát triển trên bề mặt rễ mà phát triển trong đất

xung quang rễ [4]

Azotobacter có tác dụng tăng cường thức ăn nitơ cung cấp cho cây trồng

Trung bình khi tiêu thụ hết 1g các chất sinh năng lượng, Azotobacter có khả năng

đồng hoá được khoảng 10 – 15 mg nitơ phân tử [4]

1.4 Khả năng kích thích sinh trưởng của Azotobacter

1.4.1 Chất kích thích sinh trưởng ở thực vật

Các chất kích thích sinh trưởng của thực vật là những chất ở nồng độ sinh lí

có tác dụng kích thích quá trình sinh trưởng của cây Các chất kích thích sinh trưởng thực vật gồm có các nhóm chất: auxin, gibberellin, cytokinin

Quan niệm về tồn tại trong cơ thể thực vật một hoocmon nào đó để kích thích

và phát triển chúng đã xuất hiện từ khi có công trình của Charles Darwin (1881) song chưa biết đó là chất gì Sau đó có nhiều công trình nghiên cứu về chất kích thích sinh trưởng được hình thành trên đỉnh chồi của cây đã chứng minh bản chất

hóa học của chất này và gọi là Auxin (theo tiếng Hi-lạp có nghĩa là sinh trưởng)

- Điều khiển phân chia, kéo dài và phân hóa tế bào đặc biệt là ở cây gỗ, ảnh hưởng đến sự tổng hợp ADN, kích thích sự ra rễ của mô sẹo, ngăn ngừa được sự rụng đài, nụ, hoa, lá do tác động điển hình là tăng độ mềm dẻo của vách tế bào

- Có vai trò chính trong hướng quang và hướng địa Ánh sáng từ một phía tác động lên thân hay lá mầm gây nên sự chuyển dịch AIA về phần tối, vì thế

gây nên kích thích phát triển nhanh hơn so với phần sáng, là nguyên nhân gây cong thân và lá mầm về nguồn sáng Cây bao giờ cũng mọc theo chiều thẳng đứng (trừ các nhóm cây bò lan) Trường hợp này, AIA tập trung nhiều hơn mặt bên dưới, tạo cho phần này có tế bào sinh trưởng mạnh hơn làm cho cây cong theo chiều thẳng đứng Do ngược với chiều trọng lực nên còn gọi là tính hướng địa Đặc tính này chỉ có ở phần gần chóp rễ, giúp cho rễ cây luôn

ăn thẳng xuống lòng đất theo chiều của trọng lực

- Tạo nên tính chất ưu thế ngọn AIA kìm hãm sinh trưởng của chồi phụ, do đó

tạo điều kiện thuận lợi cho chồi chính phát triển

- Điều khiển hình thành và phát triển bộ rễ AIA đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển hình thành rễ phụ, là cơ sở để phát triển bộ rễ và hình thành

rễ trên thân do tác dụng kích thích của AIA là hoạt hóa phân chia tế bào

quang mao mạch [17]

1.4.2 Vi khuẩn sinh AIA: Azotobacter

AIA là một hợp chất hóa học có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật Để điều chế ra AIA có nhiều con đường, trong đó chúng ta có thể sử dụng các vi sinh vật tổng hợp AIA Đặc điểm nổi bật của con đường này, rẻ tiền nhưng vẫn cho hiệu quả khá cao

Azotobacter còn có khả năng kích thích sinh trưởng đối với cây trồng của

chúng Những thí nghiệm nhiễm dịch nuôi cấy Azotobacter lên hạt cho thấy khả

năng nâng cao rõ rệt tỉ lệ nảy mầm cũng như tốc độ phát triển của mầm hạt Sở dĩ

Azotobacter có tác dụng này là do có khả năng tích lũy trong môi trường nuôi cấy

nhiều loại chất hoạt động sinh học có giá trị Trong môi trường chứa khoảng 1g tế

bào Azotobacter (tính theo chất khô) thì đã tích lũy được 50 – 100 gama tanin, 240

– 600 gama axit nicotinic, 600 gama axit pantotenic, khoảng 6 gama piridoxin,

Azotobacter còn có khả năng tổng hợp các chất sinh trưởng loại auxin và gibberelin

[4]

1.5 Tính kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum

1.5.1 Vi khuẩn R.solanacearum

Là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại trên 200 loài cây cỏ Halted đã nghiên cứu bệnh này vào năm 1982, đến năm 1986 E.F.Smith nghiên cứu, mô tả, định tên

R.solanacearum Ở Việt Nam bệnh do vi khuẩn R.solanacearum còn được gọi là

bệnh héo xanh, héo rũ Những năm sau đó, bệnh héo xanh được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu và nghiên cứu một cách toàn diện [26], [25], [8]

Vi khuẩn R.solanacearum tồn tại trong đất thường xuyên gây ra các bệnh chết

héo (héo rũ, héo xanh) trên nhiều loại cây trồng như: lạc, khoai tây, cà chua, ớt, thuốc lá phổ biến rộng ở hầu hết các vùng Chúng lan truyền theo nước tưới, xâm nhập vào cây qua các vết thương và di chuyển vào trong bó mạchtừ thân đến lá, sinh độc tố hoặc phá bó mạch làm tắc nghẽn sự vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng làm cây héo, chết Bệnh thường xảy ra vào lúc cây đang tăng trưởng nên thường gây tổn hại lớn cho sản xuất

R.solanacearum là vi khuẩn gây hại ở hầu hết các châu lục, phổ biến là ở các

nước như Angola, Trung Quốc, Bangladesh, Ấn Độ, Indonesia, Srilanka, Đông Ấn Ethiopia, Lybia, Malaysia, Nigieria, Philippin, Nam Phi, Đài Loan, Thái Lan, Uganda, Hoa Kì, Việt Nam, Zambia

Ở Việt Nam, bệnh héo xanh trên cây lạc do vi khuẩn R.solanacearum gây ra,

là một trong những bệnh gây hại rất phổ biến làm chết héo hàng loạt cây lạc trên đồng ruộng, gây tổn thất lớn ở các vùng trồng lạc, nhất là ở vùng Đồng bằng sông Hồng

1.5.2 Tính kháng R.solanacearum của Azotobacter

Thực tế cho thấy chỉ cần sử dụng thuốc hoá học, con người có thể kiểm soát được hầu hết sâu, bệnh hại cây trồng Biện pháp này giữ vị trí khá quan trọng trong phòng trừ dịch hại cây trồng Vì vậy, việc phòng trừ sâu bệnh hại bằng thuốc hoá học ở nhiều nước đã bị lạm dụng, có khi còn khá tuỳ tiện Dẫn tới sâu bệnh hại có

chiều hướng gia tăng bởi vì chúng đã quen dần với thuốc hoá học, bên cạnh đó năng suất cây trồng đã không thể tăng lên được nữa mà bị chững lại [31]

Ảnh hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này là do chúng sản sinh ra các chất kích thích tăng trưởng, chất ức chế hoặc làm suy yếu tác nhân gây bệnh hoặc cả hai

Cơ chế ban đầu ức chế tác nhân gây bệnh là tiết ra các chất kháng sinh Tuy nhiên những yếu tố khác như việc tiết ra các chất sidrophores, HCN, sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng có vai trò quan trọng trong việc ức chế các tác nhân gây bệnh [21], [22], [24]

1.6 Chế phẩm phân bón chứa Azotobacter và hiệu quả trong trồng trọt trong

những nghiên cứu ban đầu

Hoạt động của vi sinh vật có ích giúp đẩy nhanh quá trình khoáng hóa các hợp chất hữu cơ trong đất, nâng cao độ phì nhiêu của đất, phù hợp với mọi loại đất Đặc biệt là làm tăng độ mùn, cung cấp các chất dinh dưỡng và giúp cải tạo đất xám, đất xám bạc màu, đất phèn Khắc phục hiện tượng chai đất do sử dụng phân bón hóa học lâu ngày, giúp cho đất tơi xốp màu mỡ trở lại Bảo vệ đất chống rửa trôi xói mòn Cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết giúp cho cây tăng trưởng, phát triển khỏe mạnh, có khả năng chống chịu tốt với sâu bệnh, nâng cao năng suất cây trồng Cung cấp các hệ vi sinh vật có ích, khả năng thích ứng cao, cải tạo đất đồng thời có thể kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật gây hại từ đó làm giảm mầm mống sâu bệnh (nấm, mốc ) Bên cạnh đó một số chủng vi sinh vật có khả năng tiết ra hoạt chất có tác dụng kích thích sinh trưởng giúp cây phát triển nhanh, tốt, hạn chế sâu bệnh Giúp bộ rễ phát triển nhanh, sâu rộng, chắc khỏe, nâng cao năng suất, sản lượng cho cây trồng

Phân bón có sử dụng Azotobacter có thể được coi là loại phân bón vi sinh vật được ứng dụng sớm nhất Azotobacter không chỉ có khả năng cố định nitơ mà còn

có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật, một số vitamin

và hoạt chất ức chế sự sinh trưởng, phát triển của một số vi nấm gây bệnh vùng rễ một số cây trồng

Sản phẩm phân bón vi sinh vật cố định nitơ tự do từ Azotobacter và

Clostridium đã được sản xuất tại Mỹ, Úc và sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới với

tên E.2001 mang lại hiệu quả kinh tế xã hội tương đối cao Ở Việt Nam, sản phẩm E.2001 đã được khảo nghiệm hiệu lực đối với cây trồng trên đồng ruộng và được đưa vào danhmục các loại phân bón được phép sử dụng tại Việt Nam Kết quả đánh giá ảnh hưởng của sản phẩm E.2001 trên cà chua, rau diếp và bầu cho thấy, E.2001

có tác dụng tốt trong việc nâng cao năng suất rau, trong đó mức độ tăng có thể từ 33.33% đến 56% tùy từng loại rau [6]

Ở Việt Nam, phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh được nghiên cứu và phát triển từ những năm 90 của thế kỷ XX trong khuôn khổ của đề tài khoa học cấp Nhà nước KC.08.01 Sản phẩm được gọi dưới tên Azogin, Rhizolu Các thử nghiệm sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh (azogin) ở 15 tỉnh miền Bắc, Trung và miền Nam trên điện tích hàng chục ngàn hecta cho thấy, trong cùng điều kiện sản xuất, ruộng lúa được bón phân azogin đều tốt hơn so với đối chứng, biểu hiện qua

bộ lá phát triển tốt hơn, tỷ lệ nhánh hữu hiệu và số bông/khóm nhiều hơn đối chứng Năng suất hạt tăng 4 - 25%, đặc biệt nhiều nơi bón azogin và giảm 20% phân khoáng vẫn cho năng suất lúa cao hơn so với đối chứng

Đối với rau (xà lách, rau diếp, khoai tây ), bón phân azogin cũng làm tăng sản lượng thu hoạch 20 - 30% Việc bón phân azogin còn làm tăng khả năng chống chịu của cây và giảm lượng nitrat tồn dư trong rau Hiệu quả kinh tế do sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh là rõ rệt Nếu đầu tư 1 đồng cho việc sử dụng phân vi sinh, lãi suất thu về từ 16,2 đến 19,1 đồng cho cây lúa

Bón phân vi sinh vật cố định nitơ cho cây trồng có thể thay thế một phần phân đạm khoáng Kết quả nghiên cứu của các đề tài cấp Nhà nước KC.08.01 (1991 - 1995) và KHCN.02.06 (1996 - 2000) cho biết, có thể tiết kiệm được lượng phân đạm khoáng nhất định, từ 10,80 đến 22,40 kgN/ha/vụ tùy theo từng loại đất và mùa

vụ gieo trồng [6]

1.7 Tình hình nghiên cứu và sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật ở trong nước và ngoài nước

Nhận thức được vai trò của phân bón vi sinh vật, từ những năm đầu của thập

kỉ 80, nhà nước đã triển khai hàng loạt các đề tài nghiên cứu thuộc chương trình công nghệ sinh học phục vụ nông nghiệp giai đoạn 1986- 1990 và chương trình công nghệ sinh học 1991-2005 Dưới dây là số liệu tổng hợp một số kết quả chính trong công tác nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm phân bón phục vụ phát triển nông, lâm bền vững tại Việt Nam

* Thu thập, phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật

Các chủng giống vi sinh vật được thu thập, phân lập tuyển chọn và lưu giữ tại Quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp Ðây là bộ sưu tập giống của 30 họ vi khuẩn, nấm,

xạ khuẩn, nấm men, với số lượng gần 700 chủng, bao gồm các sinh vật cố định nitơ

sống cộng sinh với cây bộ đậu (Rhizobium, Bradyrhizobium), cố định nitơ sống tự

do (Azotobacter, Clotridium, Arthrobacter, Klebsiella, Serratia, Pseudomonas,

Bacillus, vi khuẩn lam hay cố định nitơ sống hội sinh trong vùng rễ cây trồng

(Azospirillum), vi sinh vật phân giải lân (Bacillus, Pseudomonas, Penicillium,

Aspergillus, Fussarium, Candida), vi sinh vật phân giải xenlluloza (Trichoderma, Chetomium, Aspergillus, Glioglad ium ) và vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực

vật (Agrobacterium, Flavobacterium, Bacillus, Enterobacter, Azotobacter,

Gibberella ) Hàng năm quỹ gen vi sinh vật bổ sung 30-50 chủng giống vi sinh vật

mới từ các nguồn phân lập khác nhau Ngoài ra thông qua các hoạt động hợp tác quốc tế với các Viện vi sinh vật nông nghiệp liên bang Nga, Viện nghiên cứu cây trồng bán khô hạn (ICRISAT - Ấn Ðộ), trung tâm cố định đạm sinh học (NIFTAL -

Mỹ, Thái Lan), Trung tâm lưu giữ gen vi sinh vật Ðài Loan (CCRC), Cộng hoà liên bang Ðức (DSM) quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp được mở rộng thêm với nhiều chủng giống đa dạng khác

* Nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất phân bón vi sinh vật

Phân bón vi sinh vật được sản xuất bằng cách nhân sinh khối vi sinh vật trong môi trường và điều kiện thích hợp để đạt được mật độ nhất định sau đó xử lý bảo quản và đưa đi sử dụng

Tuỳ theo công nghệ sản phẩm phân bón vi sinh vật có thể chứa sinh khối từ một hay nhiều chủng vi sinh vật đã tuyển chọn và sản phẩm có thể được sản xuất ở dạng bột hoặc lỏng [11]

* Ðánh giá hiệu lực của phân bón vi sinh vật đối với cây trồng

Trong gần 20 năm qua các công trình nghiên cứu và thử nghiệm phân vi khuẩn nốt sần tại Việt Nam cho thấy phân vi khuẩn nốt sần có tác dụng nâng cao năng suất lạc vỏ 13,8 - 17,5% ở các tỉnh phía Bắc và miền Trung và 22% ở các tỉnh miền Nam [1]

Các kết quả cũng cho thấy sử dụng phân vi khuẩn nốt sần kết hợp với lượng đạm khoáng tương đương 30 - 40 kgN/ ha mang lại hiệu quả kinh tế cao, năng suất lạc đạt trong trường hợp này có thể tương đương như bón 60 và 90 kgN/ha Hiệu lực của phân vi khuẩn nốt sần thể hiện rõ nét trên vùng đất nghèo dinh dưỡng và vùng đất mới trồng lạc

Kết quả nghiên cứu của dề tài cấp nhà nước KC.08.01 (1991-1995) và KHCN.02.06 (1996-2000) cho biết vi sinh vật cố định nitơ có thể tiết kiệm được

lượng phân khoáng nhất định, từ 10,08 đến 22,4 kgN/ ha/vụ tuỳ theo từng loại đất

và thời vụ gieo trồng

Trên thế giới

Ðến nay nhiều nước trên thế giới đã sản xuất chế phẩm vi sinh vật theo nhiều hướng, nhiều dạng khác nhau Phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội, khoa học công nghệ và trình độ dân trí của mỗi nước Nhưng tất cả đều sản xuất theo hướng tiện cho người sử dụng và cho hiệu quả kinh tế cao nhất

Các kết quả nghiên cứu từ các nước Mỹ, Canada, Nga, Ấn Ðộ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản Cho thấy sử dụng phân bón hữu co vi sinh vật có thể cung cấp cho đất và cây trồng từ 30 dến 60kg N/ha/năm hoặc thay thế 1/2 dến 1/3 lượng lân vô cơ bằng quặng phốt phát Ngoài ra, thông qua các hoạtđộng sống của vi sinh vật, cây trồng được nâng cao khả năng trao đổi chất, khả năng chống chịu bệnh tật

và qua đó góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản

Ở Ấn Ðộ do sử dụng phân bón vi sinh vật cho các cây bộ đậu (lạc, đậu tương), lúa, cao lương đã mang lại lợi nhuận tương ứng là: 1204, 1015, 1149, và 343 rupi/ha tương đươngvới sự tăng năng suất lạc, đậu tương là 13,9%, lúa 11,4%, cao lương: 18,2% và bông 6,8% [7]

Hiện nay phân bón vi sinh vật đã trở thành hàng hóa được sử dụng tại nhiều quốc gia trên thế giới Riêng vi khuẩn nốt sần hàng năm đem lại 25 triệu USD, trong đó tại Mỹ sản phẩm này được bán ra với danh số 19 triệuUSD Tại Thái Lan

tỷ lệ tăng trưởng của phân vi khuẩn nốt sần từ năm 1980 đến năm 1993 cho đậu tương là 199%, lạc 280% Tổng giá trị sản phẩm này năm 1995 đạt 406.571 USD [7]

Hiệu quả phân bón hữu cơ vi sinh đã được tổng kết tại một số quốc gia châu Á

Bảng 1.2: Hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh đối với lúa ở một số quốc gia

châu Á

nguồn Phạm Xuân Lân [7]

Tuy nhiên, bên cạnh đó phân bón HCVSV cũng có những ưu điểm và nhược điểm riêng

Phân bón có hiệu quả chậm

Điều kiện bảo quản nghiêm ngặt

Phân bón HCVSV thường chỉ phát huy tác dụng trong những điều kiện đất đai

và khí hậu thích hợp

Trung Quốc Triều Tiên Thái Lan

Ấn Độ

25,2 – 32,6 8,0 – 12,0 2,5 - 29,5 9,9

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu đất và vi sinh vật

Các chủng Azotobacter phân lập từ những khu vực đất phù sa sông Hồng chuyên

canh rau màu tại một số địa điểm quanh Hà Nội và đất trồng lúa tại Xuân Mai – Hà Nội

Na2MoO4.2H2O CaCO3

Thạch Nước cất

20 0,8 0,2 0,5 0,1 0,05

CaCO3

20 0,2 0,2 0,2 5,0

6,8 – 7,2

K2SO4 Thạch Nước cất

Nước cất

20

5 0,5 0,25

Phương pháp lấy mẫu đất và chuẩn bị mẫu đất theo TCVN 5960-1995:

Mọi dụng cụ lấy mẫu, đựng mẫu đều phải vô trùng, mẫu đất tốt nhất là phân tích ngay Nếu chưa có điều kiện phân tích ngay thì phải bảo quản trong tủ lạnh ở

50C và phân tích trong vòng một tuần Khi lấy mẫu đất phải loại bỏ lớp đất ở trên mặt với độ sâu từ 1 đến 3 cm, vì lớp đất này dễ bị các vi sinh vật xâm nhiễm vào từ bên ngoài

Mẫu đất được lấy ở tầng canh tác, từ 5 đến 10 điểm theo nguyên tắc đường chéo Trên diện tích 100 – 200 m2

cần lấy 7 – 10 mẫu, sau lấy mẫu trung bình Mỗi mẫu lấy khoảng 0,5 – 1kg, trộn đều với nhau trên tấm nilon đã vô trùng, sau đó lấy 0,5 – 1kg cho vào hộp nhựa vô trùng, đặt vào túi vải buộc lại và cho vào túi nilon

2.2.2 Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật

Khả năng cố định nitơ của các chủng vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đo hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí

Azotobacter được nuôi cấy trên môi trường dịch bán lỏng (4 ml môi trường

trong lọ 10 ml) hoặc cắt toàn bộ phần rễ cây lạc cho và bình tam giác 250 ml (đối

với Rhizobium) Đậy kín lọ/bình bằng nút cao su, dùng bơm tiêm thay thế 10% thể

tích khí trong lọ/bình bằng khí axetylen

Ủ mẫu qua 24h rồi tiến hành phân tích mẫu trên máy sắc kí khí

Kết quả tính toán được thực hiện theo công thức:

Trong đó:

M : Hoạt tính cố định nitơ được thể hiện bằng lượng etylen tạo thành

V1: Lượng axetylen dùng để hoà vào bình hoà loãng khí chuẩn

V2: Thể tích bình đựng mẫu

V3: Thể tích khí etylen chuẩn đã hoà loãng được bơm vào máy

V4: Thể tích lọ dùng để hoà loãng khí chuẩn

V5: Thể tích mẫu bơm vào máy

L1: Chiều cao píc của vạch mẫu trên băng tự ghi của máy sắc kí khí

L2: Chiều cao píc của vạch mẫu trên vạch etylen chuẩn trên băng tự ghi của máy sắc kí khí

t: Thời gian ủ mẫu

22,4 106: Hệ số chuyển số ml khí etylen sang số mol khí etylen

2.2.3 Xác định khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật

Khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật được xác định theo phương pháp Salkowsky cải tiến [27]

V1.V2.V3.L1.10-6

V4.V5.L2.22,4

M =

Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 0,1% Triptophan Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm, thu được dịch trong Cho 2 ml dịch trong vào ống nghiệm chứa 8 ml thuốc thử Salkowsky cải tiến Lắc đều, để yên trong 20 phút, sau đó so màu trên máy với bước sóng 530nm Khi tác dụng với thuốc thử, hỗn hợp phản ứng cho màu hồng nhạt đến màu đỏ tuỳ theo hàm lượng AIA trong dịch nuôi cấy Chỉ số OD được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng AIA có trong dung dịch nuôi cấy

Thuốc thử Salkowsky cải tiến: FeCl3 0,5M 15 ml

2.2.4 Xác định khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh

Phương pháp xác định hoạt tinh đối kháng của vi sinh vật với vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây trồng cạn Ralstonia solanacearum [10TCN 867:2006]

Dùng pipet vô trùng hút 0,05 ml từ huyền phù vi khuẩn R.solanacerum đã pha

loãng, cấy vào đĩa petri chứa 20 ml môi trường SPA-agar đã chuẩn bị sẵn Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch vi khuẩn thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch Chú ý không để đĩa vi khuẩn dính vào thành đĩa petri Đợi 20 – 30 phút cho

bề mặt thạch khô, dùng ống thép vô trùng khoan lỗ thạch ở tâm đĩa petri, loai bỏ phần thạch vừa khoan Lưu ý tránh làm vỡ hoặc chạm vào bề mặt thạch xung quanh

Hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng được thể hiện thông qua vòng

vô khuẩn (vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch chứa dịch vi sinh vật đối kháng)

được tính bằng trung bình cộng giá trị kích thước vòng vô khuẩn của 3 lần lặp lại biểu thị theo công thức:

Kích thước vòng vô khuẩn (mm) = D – d

Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn

d là đường kính lỗ thạch

2.2.5 Xác định tên vi sinh vật

Xác định tên vi sinh vật bằng phương pháp phân loại học phân tử dựa trên cơ

sở giải trình tự đoạn gen 16s ARN riboxom của các chủng vi khuẩn nghiên cứu, so sánh với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gen quốc tế EMBL bằng phương pháp FASTA 33 để định loại đến loài các chủng vi sinh vật Cặp mồi được thiết kế dựa

trên trình tự đoạn gen 16s ARN riboxom của chủng E.coli (J01695), tương ứng với

các vị trí nucleotid 15-33 (cho mồi thuận chiều) và 1548-1532 (cho mồi ngược) Trình tự nucleotit của các chủng nghiên cứu được giải trình trên máy tự động ABI-

377 của Hãng Perkin-Elmer (Mỹ), sau đó được xử lý bằng chương trình SeqEd1.03

và chương trình AssemblyLIGN 1.9 trong hệ chương trình MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.) Truy cập Ngân hàng Gen bằng chương trình Entrez/nucleotide/ tìm kiếm các trình tự gen 16s ARN riboxom của vi khuẩn So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của tất cả các chuỗi bằng chương trình GENDOC2.5 Thành phần nucleotit được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (vi khuẩn) trong Ngân hàng Gen (bảng mã di truyền số 11) thông qua chương trình GENDOC 2.5 Tên vi sinh vật được xác định với xác suất tương đồng cao nhất

2.2.6 Thí nghiệm ở quy mô nhà lưới và đồng ruộng diện hẹp với cây lạc

Phương pháp bố trí thí nghiệm ở quy mô nhà lưới và đồng ruộng diện hẹp theo 10TCN 216-2003 Thời gian theo dõi thí nghiệm là một chu kỳ sinh trưởng phát triển của cây trồng (từ khi gieo trồng cho đến khi thu hoạch xong) Số liệu nghiên cứu được xử lý Microsoft Exel 2003 và phần mềm IRRISTAT

Giống cây thí nghiệm là giống lạc được sử dụng đại trà L14

Phương pháp bố trí thí nghiệm ở nhà lưới:

- Công thức thí nghiệm: Gồm 4 công thức với 3 lần lặp lại

CT1: Đối chứng dương (bón NPK theo quy trình)

CT2: Đối chứng âm (Vi khuẩn gây bệnh héo xanh + bón NPK theo quy trình) CT3: Bổ sung dịch vi sinh vật + bón NPK theo quy trình

CT4: Bổ sung dịch vi sinh vật + vi khuẩn gây bệnh héo xanh + bón NPK theo quy trình

Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng diện hẹp:

- Công thức thí nghiệm: Gồm 2 công thức với 3 lần lặp lại

CT1: Đối chứng dương (bón NPK theo quy trình)

CT2: Bổ sung dịch vi sinh vật + vi khuẩn gây bệnh héo xanh + bón NPK theo quy trình

- Nền phân bón cho một ha lạc: 10 tấn phân chuồng + 30kg N + 90kg P2O5 + 60kg K2O

- Cách bón: Bón lót toàn bộ phân chuồng + toàn bộ phân lân + 1/2 phân đạm

và 1/2 phân kali Lượng phân đạm và kali còn lại bón thúc vào lúc xới vun lần một

- Các chỉ tiêu theo dõi

+ Chiều cao cây (cm)