Trong quá trình thực hiện đề tài này, tôi đã sử dụng các dụng cụ và hóa chất của Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ Nhƣỡng Nông Hóa.
Một số loại môi trường nuôi cấy sử dụng trong quá trình nghiên cứu
Tên Thành phần (g/l) pH Môi trƣờng AT Glucose K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O FeCl3.6H2O Na2MoO4.2H2O CaCO3 Thạch Nƣớc cất 20 0,8 0,2 0,5 0,1 0,05 20 12 1000 ml 7,4 – 7,6
Môi trƣờng Ashby Glucose K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl CaCO3 20 0,2 0,2 0,2 5,0 6,8 – 7,2
31 K2SO4 Thạch Nƣớc cất 0,1 12 1000 ml
Môi trƣờng SPA Succrose Pepton K2HPO4 MgSO4.7H2O Thạch Nƣớc cất 20 5 0,5 0,25 12 1000 ml 7 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Lấy mẫu đất
Phương pháp lấy mẫu đất và chuẩn bị mẫu đất theo TCVN 5960-1995:
Mọi dụng cụ lấy mẫu, đựng mẫu đều phải vô trùng, mẫu đất tốt nhất là phân tích ngay. Nếu chƣa có điều kiện phân tích ngay thì phải bảo quản trong tủ lạnh ở 50C và phân tích trong vòng một tuần. Khi lấy mẫu đất phải loại bỏ lớp đất ở trên mặt với độ sâu từ 1 đến 3 cm, vì lớp đất này dễ bị các vi sinh vật xâm nhiễm vào từ bên ngoài.
Mẫu đất đƣợc lấy ở tầng canh tác, từ 5 đến 10 điểm theo nguyên tắc đƣờng chéo. Trên diện tích 100 – 200 m2
cần lấy 7 – 10 mẫu, sau lấy mẫu trung bình. Mỗi mẫu lấy khoảng 0,5 – 1kg, trộn đều với nhau trên tấm nilon đã vô trùng, sau đó lấy 0,5 – 1kg cho vào hộp nhựa vô trùng, đặt vào túi vải buộc lại và cho vào túi nilon. 2.2.2. Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật
Khả năng cố định nitơ của các chủng vi sinh vật đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí.
32
Azotobacter đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dịch bán lỏng (4 ml môi trƣờng trong lọ 10 ml) hoặc cắt toàn bộ phần rễ cây lạc cho và bình tam giác 250 ml (đối với Rhizobium). Đậy kín lọ/bình bằng nút cao su, dùng bơm tiêm thay thế 10% thể tích khí trong lọ/bình bằng khí axetylen.
Ủ mẫu qua 24h rồi tiến hành phân tích mẫu trên máy sắc kí khí Kết quả tính toán đƣợc thực hiện theo công thức:
Trong đó:
M : Hoạt tính cố định nitơ đƣợc thể hiện bằng lƣợng etylen tạo thành V1: Lƣợng axetylen dùng để hoà vào bình hoà loãng khí chuẩn V2: Thể tích bình đựng mẫu
V3: Thể tích khí etylen chuẩn đã hoà loãng đƣợc bơm vào máy V4: Thể tích lọ dùng để hoà loãng khí chuẩn
V5: Thể tích mẫu bơm vào máy
L1: Chiều cao píc của vạch mẫu trên băng tự ghi của máy sắc kí khí
L2: Chiều cao píc của vạch mẫu trên vạch etylen chuẩn trên băng tự ghi của máy sắc kí khí
t: Thời gian ủ mẫu
22,4. 106: Hệ số chuyển số ml khí etylen sang số mol khí etylen 2.2.3. Xác định khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật
Khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật đƣợc xác định theo phƣơng pháp Salkowsky cải tiến [27].
V1.V2.V3.L1.10-6 V4.V5.L2.22,4 M =
33
Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung 0,1% Triptophan. Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm, thu đƣợc dịch trong. Cho 2 ml dịch trong vào ống nghiệm chứa 8 ml thuốc thử Salkowsky cải tiến. Lắc đều, để yên trong 20 phút, sau đó so màu trên máy với bƣớc sóng 530nm. Khi tác dụng với thuốc thử, hỗn hợp phản ứng cho màu hồng nhạt đến màu đỏ tuỳ theo hàm lƣợng AIA trong dịch nuôi cấy. Chỉ số OD đƣợc đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lƣợng AIA có trong dung dịch nuôi cấy.
Thuốc thử Salkowsky cải tiến: FeCl3 0,5M 15 ml
H2SO4 98% 300 ml
Nƣớc cất 500 ml
2.2.4. Xác định khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh
Phương pháp xác định hoạt tinh đối kháng của vi sinh vật với vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây trồng cạn Ralstonia solanacearum [10TCN 867:2006]
Dùng pipet vô trùng hút 0,05 ml từ huyền phù vi khuẩn R.solanacerum đã pha loãng, cấy vào đĩa petri chứa 20 ml môi trƣờng SPA-agar đã chuẩn bị sẵn. Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch vi khuẩn thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch. Chú ý không để đĩa vi khuẩn dính vào thành đĩa petri. Đợi 20 – 30 phút cho bề mặt thạch khô, dùng ống thép vô trùng khoan lỗ thạch ở tâm đĩa petri, loai bỏ phần thạch vừa khoan. Lƣu ý tránh làm vỡ hoặc chạm vào bề mặt thạch xung quanh lỗ thạch đục.
Dùng pipet vô trùng hút 0,05 ml dịch vi sinh vật đối kháng đƣa vào lỗ thạch đã chuẩn bị ở trên, giữ ở nhiệt độ 30 – 370C và thời gian 48 – 72 giờ tuỳ thuộc vào loài vi sinh vật cần xác định hoạt tính. Lƣu ý trong quá trình chuyển dịch mẫu cần giữ cho các đĩa petri trên mặt phẳng, không để dịch vi sinh vật đối kháng tràn trên bề mặt đĩa thạch.
Hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng đƣợc thể hiện thông qua vòng vô khuẩn (vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch chứa dịch vi sinh vật đối kháng)
34
đƣợc tính bằng trung bình cộng giá trị kích thƣớc vòng vô khuẩn của 3 lần lặp lại biểu thị theo công thức:
Kích thƣớc vòng vô khuẩn (mm) = D – d Trong đó: D là đƣờng kính vòng vô khuẩn. d là đƣờng kính lỗ thạch.
2.2.5. Xác định tên vi sinh vật
Xác định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp phân loại học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự đoạn gen 16s ARN riboxom của các chủng vi khuẩn nghiên cứu, so sánh với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gen quốc tế EMBL bằng phƣơng pháp FASTA 33 để định loại đến loài các chủng vi sinh vật. Cặp mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đoạn gen 16s ARN riboxom của chủng E.coli (J01695), tƣơng ứng với các vị trí nucleotid 15-33 (cho mồi thuận chiều) và 1548-1532 (cho mồi ngƣợc). Trình tự nucleotit của các chủng nghiên cứu đƣợc giải trình trên máy tự động ABI- 377 của Hãng Perkin-Elmer (Mỹ), sau đó đƣợc xử lý bằng chƣơng trình SeqEd1.03 và chƣơng trình AssemblyLIGN 1.9 trong hệ chƣơng trình MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.). Truy cập Ngân hàng Gen bằng chƣơng trình Entrez/nucleotide/ tìm kiếm các trình tự gen 16s ARN riboxom của vi khuẩn. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của tất cả các chuỗi bằng chƣơng trình GENDOC2.5. Thành phần nucleotit đƣợc thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (vi khuẩn) trong Ngân hàng Gen (bảng mã di truyền số 11) thông qua chƣơng trình GENDOC 2.5. Tên vi sinh vật đƣợc xác định với xác suất tƣơng đồng cao nhất.
2.2.6. Thí nghiệm ở quy mô nhà lƣới và đồng ruộng diện hẹp với cây lạc.
Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm ở quy mô nhà lƣới và đồng ruộng diện hẹp theo 10TCN 216-2003. Thời gian theo dõi thí nghiệm là một chu kỳ sinh trƣởng phát triển của cây trồng (từ khi gieo trồng cho đến khi thu hoạch xong). Số liệu nghiên cứu đƣợc xử lý Microsoft Exel 2003 và phần mềm IRRISTAT.
35
Giống cây thí nghiệm là giống lạc đƣợc sử dụng đại trà L14.
Phương pháp bố trí thí nghiệm ở nhà lưới:
-Công thức thí nghiệm: Gồm 4 công thức với 3 lần lặp lại. CT1: Đối chứng dƣơng (bón NPK theo quy trình).
CT2: Đối chứng âm (Vi khuẩn gây bệnh héo xanh + bón NPK theo quy trình) CT3: Bổ sung dịch vi sinh vật + bón NPK theo quy trình.
CT4: Bổ sung dịch vi sinh vật + vi khuẩn gây bệnh héo xanh + bón NPK theo quy trình.
Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng diện hẹp: - Công thức thí nghiệm: Gồm 2 công thức với 3 lần lặp lại. CT1: Đối chứng dƣơng (bón NPK theo quy trình).
CT2: Bổ sung dịch vi sinh vật + vi khuẩn gây bệnh héo xanh + bón NPK theo quy trình.
-Nền phân bón cho một ha lạc: 10 tấn phân chuồng + 30kg N + 90kg P2O5 + 60kg K2O.
-Cách bón: Bón lót toàn bộ phân chuồng + toàn bộ phân lân + 1/2 phân đạm và 1/2 phân kali. Lƣợng phân đạm và kali còn lại bón thúc vào lúc xới vun lần một.
-Các chỉ tiêu theo dõi + Chiều cao cây (cm). + Số cành cấp 1 (cành). + Số cành cấp 2 (cành). + Số hạt chắc trên cây (hạt). + P100 hạt (g).
36
+ Năng suất thực thu (tạ/ha). + Năng suất lý thuyết (tạ/ha).
Đánh giá tính chống chịu bệnh:
Tỷ lệ cây bị bệnh: Đếm số cây bị bệnh từ sau mọc đến lúc thu hoạch. Tính tỷ lệ % cây bị bệnh theo công thức:
Tổng số cây bị bệnh
Tỷ lệ cây bị bệnh (%) = x 100 Tổng số cây điều tra
Chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của cây lạc:
+ Chiều cao cây (cm): Đo từ giao điểm rễ với thân đến điểm sinh trƣởng của ngọn cao nhất (mỗi hàng theo dõi 5 cây liên tục ở giữa ô thí nghiệm).
+ Số thân chính/khóm (thân): Đếm số thân chính của 10 khóm theo dõi (mỗi hàng theo dõi 5 cây liên tục ở giữa ô thí nghiệm).
Chỉ tiêu về năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất:
+ Số hạt/khóm (hạt): Tổng số hạt của 10 khóm Số hạt/khóm = 10 + Khối lƣợng hạt (g/hạt): Khối lƣợng hạt của 10 khóm Khối lƣợng hạt = Số hạt của 10 khóm
37
+ Năng suất lý thuyết (tấn/ha):
Khối lƣợng hạt/khóm x Số khóm/m2 Năng suất lý thuyết =
100
+ Năng suất thực thu: Cân khối lƣợng hạt thực thu trên diện tích khảo nghiệm. Quy ra năng suất tấn/ha.
38
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter hữu hiệu
Thu đƣợc 25 mẫu đất từ những khu vực trồng lúa tại Xuân Mai và khu vực trồng rau màu tại đất phù sa sông Hồng ở Hà Nội. Trƣớc khi phân lập, mẫu lấy về đem hong khô ở nhiệt độ phòng để tăng tính chọn lọc. Việc hong khô đất là rất cần thiết vì các chủng phân lập từ đất khô có khả năng tồn tại tốt hơn trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo. Các chủng phân lập từ đất ẩm dễ bị chết sau một thời gian dài bảo quản và dễ bị nhầm với Azomonas, một loại vi khuẩn cũng cố định nitơ, có hình dạng giống Azotobacter nhƣng không hình thành bào nang [5].
Từ 25 mẫu đất này, đã phân lập đƣợc 09 chủng Azotobacter với đặc điểm hình thái khuẩn lạc đƣợc tổng hợp tại bảng sau:
Hình 3.1: Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Azotobacter mới phân lập.
39
Bảng 3.1: Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Azotobacter mới phân lập
Ký hiệu chủng
Đặc điểm nuôi cấy Ngày
xuất hiện
Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng khuẩn lạc
AT1 2 Non màu trắng trong, già
chuyển màu vàng lục
Bề mặt nhẵn, lồi, khi già nhăn nheo.
AT2 2 Non màu trắng đục, già
chuyển màu nâu
Bề mặt nhẵn, nhầy nhớt, tròn đều.
AT3 2 Non màu trắng đục, già
chuyển màu vàng lục
Bề mặt nhẵn, nhầy nhớt, tròn đều.
AT4 2 Non màu trắng trong, già
chuyển màu nâu
Bề mặt nhẵn, lồi, khi già nhăn nheo.
AT6 2 Non màu trắng đục, già
chuyển màu vàng lục
Bề mặt nhẵn, nhầy nhớt, tròn đều.
AT7 2 Non màu trắng đục, già
chuyển màu vàng lục
Bề mặt nhẵn, nhầy nhớt, tròn đều.
AT8 2 Non màu trắng đục, già
chuyển màu vàng lục
Bề mặt nhẵn, nhầy nhớt, tròn đều.
AT9 2 Non màu trắng trong, già
chuyển màu nâu
Bề mặt nhẵn, lồi, khi già nhăn nheo.
AT10 2 Non màu trắng đục, già
chuyển màu vàng lục
Bề mặt nhẵn, nhầy nhớt, tròn đều.
40
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, Azotobacter rất đa dạng về hình thái khuẩn lạc, mỗi loài có những đặc điểm hình thái khuẩn lạc đặc trƣng riêng. Các chủng
Azotobacter mới phân lập đƣợc có thời gian sinh trƣởng trên môi trƣờng thạch 2 – 5 ngày, khuẩn lạc có màu trắng trong hoặc trắng đục, nhày nhớt và tròn đều. Khi già khuẩn lạc chuyển thành màu vàng lục, màu nâu tối, thậm chí màu đen nhƣng không làm nhuộm màu môi trƣờng khuẩn lạc. Trên môi trƣờng lỏng, dịch nuôi cấy của các chủng phân lập phát triển nhanh sau 2 – 3 ngày nuôi cấy lắc, dịch thể màu trắng đục và có cặn. Nhiệt độ thích hợp từ 28 – 300C. Tế bào nhuộm Gram âm.
Qua kết quả trên có thể thấy sự đa dạng của vi khuẩn Azotobacter, đây chính là một trong những nguồn vi sinh vật hữu ích cho sản xuất phân bón HCVSV, hƣớng tới một nền nông nghiệp hữu cơ thân thiện với môi trƣờng và an toàn.
3.1.1. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng cố định nitơ
Các chủng vi khuẩn Azotobacter đƣợc cấy truyền trên môi trƣờng Ashby để xác định thuần chủng và ổn định hoạt tính sinh học. Sau đó đánh giá lại khả năng cố định nitơ tự do dựa vào phản ứng màu Nessler. Kết quả ở hình 3.2.
Hình 3.2:Hình ảnh phản ứng màu của các chủng Azotobacter với thuốc thử Nessler
41
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy cả 09 chủng đều có phản ứng màu với thuốc thử Nessler. Trong đó, chủng AT10 có phản ứng mạnh nhất với thuốc thử Nessler, sau đó lần lƣợt là các chủng AT4, AT7, AT2, AT6, AT9 và cuối cùng là 3 chủng AT1, AT3, AT8.
Để xác định hoạt tính cố định nitơ của các chủng Azotobacter mới phân lập đƣợc, 06 chủng AT10, AT4, AT7, AT2, AT6 và AT9 đƣợc cấy vào môi trƣờng bán lỏng AT ở 30 0
C trong 24 giờ, sau đó xác định hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí. Kết quả đo hoạt tính khử axetylen của từng chủng đƣợc thể hiện ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.1.
Bảng 3.2: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter.
STT Ký hiệu chủng Cố định nitơ (mol etylen/ml/ngày)
1 AT2 2148,7 2 AT4 3281,6 3 AT6 1586,5 4 AT7 2706,2 5 AT9 1071,6 6 AT10 4345,6
42
Biểu đồ 3.1: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter.
Nhƣ vậy, kết quả thử phản ứng màu của các chủng Azotobacter với thuốc thử Nessler hoàn toàn phù hợp với kết quả xác định hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí.
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, các chủng Azotobacter đều có khả năng cố định nitơ. Khả năng hình thành etylen đạt từ 1071,6 đến 4345,6 mol/ml/ngày. Trong đó chủng AT10 có khả năng cố định nitơ cao nhất, đạt 4345,6 mol/ml/ngày. Các chủng này đƣợc chọn làm đối tƣợng cho các nghiên cứu sau.
3.1.2. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng sinh tổng hợp AIA .
Từ 09 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, đã tiếp tục tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp AIA, dựa vào phản ứng với thuốc thử Salkowski. Kết quả ở hình 3.3.
43
Hình 3.3: Hình ảnh phản ứng màu của các chủng Azotobacter với thuốc thử Salkowski
Kết quả hình 3.3 cho thấy cả 09 chủng đều phản ứng màu với thuốc thử Salkowski. Dễ dàng nhận thấy, các chủng AT10, AT9, AT1, AT7 và AT2 có phản ứng mạnh với thuốc thử.
Để xác định hoạt tính sinh tổng hợp AIA thô của các chủng Azotobacter mới phân lập, 06 chủng AT10, AT9, AT1, AT7 và AT2 đƣợc nuôi cấy trong điều kiện kị ánh sáng, trên máy lắc tốc độ 150 vòng / phút ở 30oC trên môi trƣờng nuôi cấy AT có bổ sung trytophan 0,1%. Nuôi cấy và theo dõi lƣợng AIA sinh ra theo thời gian là: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày. Sau đó xác định hàm lƣợng AIA thô sinh ra bằng phƣơng pháp so màu ở bƣớc sóng 530nm với đồ thị chuẩn AIA. Kết quả thể hiện tại bảng 3.3 và biểu đồ 3.2.
44
Bảng 3.3: Khả năng sinh tổng hợp AIA thô của các chủng Azotobacter
Ký hiệu chủng
Hàm lƣợng AIA thô (g/ml)
1 ngày 2 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày
AT1 75 248 325 380 295 AT2 85 288 320 430 335 AT4 25 35 35 39 27 AT7 45 128 220 280 235 AT9 85 255 330 410 315 AT10 50 138 270 317 228
45
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, các chủng Azotobacter nghiên cứu đều có khả năng sinh AIA thô, hàm lƣợng đạt 25 - 430 g/ml, hàm lƣợng AIA đạt cao nhất sau
5 ngày nuôi cấy các chủng vi khuẩn trong môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung DL- triptophan 1%. Chủng AT2 có khả năng sinh AIA thô cao nhất, đạt 430 g/ml sau 5
ngày nuôi cấy. Các chủng này đƣợc chọn làm đối tƣợng cho các nghiên cứu sau.