nƣớc và ngoài nƣớc.
Ở trong nước
Chiến lƣợc an toàn dinh dƣỡng cho cây và đất trồng là sử dụng cân đối phân bón hoá học và phân bón sinh học cho cây trồng phù hợp với nhu cầu dinh dƣỡng và điều kiện đất đai, khí hậu, trong đó phân bón sinh học có vai trò vô cùng quan trọng. Cùng với chất hữu cơ, vi sinh vật sống tồn tại trong đất, nƣớc và vùng rễ cây có ý nghĩa quan trọng trong các mối quan hệ giữa cây trồng, đất và phân bón. Hầu nhƣ mọi quá trình xảy ra trong đất dều có sự tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp của vi sinh vật (mùn hoá, khoáng hoá chất hữu cơ, phân giải, cố định chất vô cơ. v.v.). Vì vậy từ lâu vi sinh vật đã đƣợc coi là một bộ phận của hệ dinh dƣỡng cây trồng tổng hợp.
Nhận thức đƣợc vai trò của phân bón vi sinh vật, từ những năm đầu của thập kỉ 80, nhà nƣớc đã triển khai hàng loạt các đề tài nghiên cứu thuộc chƣơng trình công nghệ sinh học phục vụ nông nghiệp giai đoạn 1986- 1990 và chƣơng trình công nghệ sinh học 1991-2005. Dƣới dây là số liệu tổng hợp một số kết quả chính trong công tác nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm phân bón phục vụ phát triển nông, lâm bền vững tại Việt Nam.
* Thu thập, phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật.
Các chủng giống vi sinh vật đƣợc thu thập, phân lập tuyển chọn và lƣu giữ tại Quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp. Ðây là bộ sƣu tập giống của 30 họ vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, nấm men, với số lƣợng gần 700 chủng, bao gồm các sinh vật cố định nitơ sống cộng sinh với cây bộ đậu (Rhizobium, Bradyrhizobium), cố định nitơ sống tự do (Azotobacter, Clotridium, Arthrobacter, Klebsiella, Serratia, Pseudomonas, Bacillus, vi khuẩn lam... hay cố định nitơ sống hội sinh trong vùng rễ cây trồng (Azospirillum), vi sinh vật phân giải lân (Bacillus, Pseudomonas, Penicillium, Aspergillus, Fussarium, Candida), vi sinh vật phân giải xenlluloza (Trichoderma, Chetomium, Aspergillus, Glioglad ium....) và vi sinh vật kích thích sinh trƣởng thực
27
vật (Agrobacterium, Flavobacterium, Bacillus, Enterobacter, Azotobacter, Gibberella...). Hàng năm quỹ gen vi sinh vật bổ sung 30-50 chủng giống vi sinh vật mới từ các nguồn phân lập khác nhau. Ngoài ra thông qua các hoạt động hợp tác quốc tế với các Viện vi sinh vật nông nghiệp liên bang Nga, Viện nghiên cứu cây trồng bán khô hạn (ICRISAT - Ấn Ðộ), trung tâm cố định đạm sinh học (NIFTAL - Mỹ, Thái Lan), Trung tâm lƣu giữ gen vi sinh vật Ðài Loan (CCRC), Cộng hoà liên bang Ðức (DSM)...quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp đƣợc mở rộng thêm với nhiều chủng giống đa dạng khác.
* Nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất phân bón vi sinh vật.
Phân bón vi sinh vật đƣợc sản xuất bằng cách nhân sinh khối vi sinh vật trong môi trƣờng và điều kiện thích hợp để đạt đƣợc mật độ nhất định sau đó xử lý bảo quản và đƣa đi sử dụng.
Tuỳ theo công nghệ sản phẩm phân bón vi sinh vật có thể chứa sinh khối từ một hay nhiều chủng vi sinh vật đã tuyển chọn và sản phẩm có thể đƣợc sản xuất ở dạng bột hoặc lỏng [11].
* Ðánh giá hiệu lực của phân bón vi sinh vật đối với cây trồng.
Trong gần 20 năm qua các công trình nghiên cứu và thử nghiệm phân vi khuẩn nốt sần tại Việt Nam cho thấy phân vi khuẩn nốt sần có tác dụng nâng cao năng suất lạc vỏ 13,8 - 17,5% ở các tỉnh phía Bắc và miền Trung và 22% ở các tỉnh miền Nam [1].
Các kết quả cũng cho thấy sử dụng phân vi khuẩn nốt sần kết hợp với lƣợng đạm khoáng tƣơng đƣơng 30 - 40 kgN/ ha mang lại hiệu quả kinh tế cao, năng suất lạc đạt trong trƣờng hợp này có thể tƣơng đƣơng nhƣ bón 60 và 90 kgN/ha. Hiệu lực của phân vi khuẩn nốt sần thể hiện rõ nét trên vùng đất nghèo dinh dƣỡng và vùng đất mới trồng lạc.
Kết quả nghiên cứu của dề tài cấp nhà nƣớc KC.08.01 (1991-1995) và KHCN.02.06 (1996-2000) cho biết vi sinh vật cố định nitơ có thể tiết kiệm đƣợc
28
lƣợng phân khoáng nhất định, từ 10,08 đến 22,4 kgN/ ha/vụ tuỳ theo từng loại đất và thời vụ gieo trồng.
Trên thế giới
Ðến nay nhiều nƣớc trên thế giới đã sản xuất chế phẩm vi sinh vật theo nhiều hƣớng, nhiều dạng khác nhau. Phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội, khoa học công nghệ và trình độ dân trí của mỗi nƣớc. Nhƣng tất cả đều sản xuất theo hƣớng tiện cho ngƣời sử dụng và cho hiệu quả kinh tế cao nhất.
Các kết quả nghiên cứu từ các nƣớc Mỹ, Canada, Nga, Ấn Ðộ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản. Cho thấy sử dụng phân bón hữu co vi sinh vật có thể cung cấp cho đất và cây trồng từ 30 dến 60kg N/ha/năm hoặc thay thế 1/2 dến 1/3 lƣợng lân vô cơ bằng quặng phốt phát. Ngoài ra, thông qua các hoạtđộng sống của vi sinh vật, cây trồng đƣợc nâng cao khả năng trao đổi chất, khả năng chống chịu bệnh tật và qua đó góp phần nâng cao năng suất và chất lƣợng nông sản.
Ở Ấn Ðộ do sử dụng phân bón vi sinh vật cho các cây bộ đậu (lạc, đậu tƣơng), lúa, cao lƣơng đã mang lại lợi nhuận tƣơng ứng là: 1204, 1015, 1149, và 343 rupi/ha tƣơng đƣơngvới sự tăng năng suất lạc, đậu tƣơng là 13,9%, lúa 11,4%, cao lƣơng: 18,2% và bông 6,8% [7].
Hiện nay phân bón vi sinh vật đã trở thành hàng hóa đƣợc sử dụng tại nhiều quốc gia trên thế giới. Riêng vi khuẩn nốt sần hàng năm đem lại 25 triệu USD, trong đó tại Mỹ sản phẩm này đƣợc bán ra với danh số 19 triệuUSD. Tại Thái Lan tỷ lệ tăng trƣởng của phân vi khuẩn nốt sần từ năm 1980 đến năm 1993 cho đậu tƣơng là 199%, lạc 280%. Tổng giá trị sản phẩm này năm 1995 đạt 406.571 USD [7].
29
Bảng 1.2: Hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh đối với lúa ở một số quốc gia châu Á
nguồn Phạm Xuân Lân [7].
Tuy nhiên, bên cạnh đó phân bón HCVSV cũng có những ƣu điểm và nhƣợc điểm riêng.
Ưu điểm
Tăng năng suất cây trồng, chất lƣợng sản phẩm tốt hơn, giảm ô nhiễm của hàm lƣợng NO3.
Cải tạo đất, trả lại độ phì nhiêu cho đất bằng cách làm tăng hàm lƣợng photpho và kali dễ tan trong đất canh tác.
Giá thành hạ.
Nhược điểm
Phân bón có hiệu quả chậm. Điều kiện bảo quản nghiêm ngặt.
Phân bón HCVSV thƣờng chỉ phát huy tác dụng trong những điều kiện đất đai và khí hậu thích hợp.
Tên quốc gia Tỉ lệ % tăng năng suất
Trung Quốc Triều Tiên Thái Lan Ấn Độ 25,2 – 32,6 8,0 – 12,0 2,5 - 29,5 9,9
30
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu đất và vi sinh vật.
Các chủng Azotobacter phân lập từ những khu vực đất phù sa sông Hồng chuyên canh rau màu tại một số địa điểm quanh Hà Nội và đất trồng lúa tại Xuân Mai – Hà Nội.
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ
Trong quá trình thực hiện đề tài này, tôi đã sử dụng các dụng cụ và hóa chất của Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ Nhƣỡng Nông Hóa.
Một số loại môi trường nuôi cấy sử dụng trong quá trình nghiên cứu
Tên Thành phần (g/l) pH Môi trƣờng AT Glucose K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O FeCl3.6H2O Na2MoO4.2H2O CaCO3 Thạch Nƣớc cất 20 0,8 0,2 0,5 0,1 0,05 20 12 1000 ml 7,4 – 7,6
Môi trƣờng Ashby Glucose K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl CaCO3 20 0,2 0,2 0,2 5,0 6,8 – 7,2
31 K2SO4 Thạch Nƣớc cất 0,1 12 1000 ml
Môi trƣờng SPA Succrose Pepton K2HPO4 MgSO4.7H2O Thạch Nƣớc cất 20 5 0,5 0,25 12 1000 ml 7 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Lấy mẫu đất
Phương pháp lấy mẫu đất và chuẩn bị mẫu đất theo TCVN 5960-1995:
Mọi dụng cụ lấy mẫu, đựng mẫu đều phải vô trùng, mẫu đất tốt nhất là phân tích ngay. Nếu chƣa có điều kiện phân tích ngay thì phải bảo quản trong tủ lạnh ở 50C và phân tích trong vòng một tuần. Khi lấy mẫu đất phải loại bỏ lớp đất ở trên mặt với độ sâu từ 1 đến 3 cm, vì lớp đất này dễ bị các vi sinh vật xâm nhiễm vào từ bên ngoài.
Mẫu đất đƣợc lấy ở tầng canh tác, từ 5 đến 10 điểm theo nguyên tắc đƣờng chéo. Trên diện tích 100 – 200 m2
cần lấy 7 – 10 mẫu, sau lấy mẫu trung bình. Mỗi mẫu lấy khoảng 0,5 – 1kg, trộn đều với nhau trên tấm nilon đã vô trùng, sau đó lấy 0,5 – 1kg cho vào hộp nhựa vô trùng, đặt vào túi vải buộc lại và cho vào túi nilon. 2.2.2. Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật
Khả năng cố định nitơ của các chủng vi sinh vật đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí.
32
Azotobacter đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dịch bán lỏng (4 ml môi trƣờng trong lọ 10 ml) hoặc cắt toàn bộ phần rễ cây lạc cho và bình tam giác 250 ml (đối với Rhizobium). Đậy kín lọ/bình bằng nút cao su, dùng bơm tiêm thay thế 10% thể tích khí trong lọ/bình bằng khí axetylen.
Ủ mẫu qua 24h rồi tiến hành phân tích mẫu trên máy sắc kí khí Kết quả tính toán đƣợc thực hiện theo công thức:
Trong đó:
M : Hoạt tính cố định nitơ đƣợc thể hiện bằng lƣợng etylen tạo thành V1: Lƣợng axetylen dùng để hoà vào bình hoà loãng khí chuẩn V2: Thể tích bình đựng mẫu
V3: Thể tích khí etylen chuẩn đã hoà loãng đƣợc bơm vào máy V4: Thể tích lọ dùng để hoà loãng khí chuẩn
V5: Thể tích mẫu bơm vào máy
L1: Chiều cao píc của vạch mẫu trên băng tự ghi của máy sắc kí khí
L2: Chiều cao píc của vạch mẫu trên vạch etylen chuẩn trên băng tự ghi của máy sắc kí khí
t: Thời gian ủ mẫu
22,4. 106: Hệ số chuyển số ml khí etylen sang số mol khí etylen 2.2.3. Xác định khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật
Khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật đƣợc xác định theo phƣơng pháp Salkowsky cải tiến [27].
V1.V2.V3.L1.10-6 V4.V5.L2.22,4 M =
33
Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung 0,1% Triptophan. Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm, thu đƣợc dịch trong. Cho 2 ml dịch trong vào ống nghiệm chứa 8 ml thuốc thử Salkowsky cải tiến. Lắc đều, để yên trong 20 phút, sau đó so màu trên máy với bƣớc sóng 530nm. Khi tác dụng với thuốc thử, hỗn hợp phản ứng cho màu hồng nhạt đến màu đỏ tuỳ theo hàm lƣợng AIA trong dịch nuôi cấy. Chỉ số OD đƣợc đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lƣợng AIA có trong dung dịch nuôi cấy.
Thuốc thử Salkowsky cải tiến: FeCl3 0,5M 15 ml
H2SO4 98% 300 ml
Nƣớc cất 500 ml
2.2.4. Xác định khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh
Phương pháp xác định hoạt tinh đối kháng của vi sinh vật với vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây trồng cạn Ralstonia solanacearum [10TCN 867:2006]
Dùng pipet vô trùng hút 0,05 ml từ huyền phù vi khuẩn R.solanacerum đã pha loãng, cấy vào đĩa petri chứa 20 ml môi trƣờng SPA-agar đã chuẩn bị sẵn. Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch vi khuẩn thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch. Chú ý không để đĩa vi khuẩn dính vào thành đĩa petri. Đợi 20 – 30 phút cho bề mặt thạch khô, dùng ống thép vô trùng khoan lỗ thạch ở tâm đĩa petri, loai bỏ phần thạch vừa khoan. Lƣu ý tránh làm vỡ hoặc chạm vào bề mặt thạch xung quanh lỗ thạch đục.
Dùng pipet vô trùng hút 0,05 ml dịch vi sinh vật đối kháng đƣa vào lỗ thạch đã chuẩn bị ở trên, giữ ở nhiệt độ 30 – 370C và thời gian 48 – 72 giờ tuỳ thuộc vào loài vi sinh vật cần xác định hoạt tính. Lƣu ý trong quá trình chuyển dịch mẫu cần giữ cho các đĩa petri trên mặt phẳng, không để dịch vi sinh vật đối kháng tràn trên bề mặt đĩa thạch.
Hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng đƣợc thể hiện thông qua vòng vô khuẩn (vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch chứa dịch vi sinh vật đối kháng)
34
đƣợc tính bằng trung bình cộng giá trị kích thƣớc vòng vô khuẩn của 3 lần lặp lại biểu thị theo công thức:
Kích thƣớc vòng vô khuẩn (mm) = D – d Trong đó: D là đƣờng kính vòng vô khuẩn. d là đƣờng kính lỗ thạch.
2.2.5. Xác định tên vi sinh vật
Xác định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp phân loại học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự đoạn gen 16s ARN riboxom của các chủng vi khuẩn nghiên cứu, so sánh với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gen quốc tế EMBL bằng phƣơng pháp FASTA 33 để định loại đến loài các chủng vi sinh vật. Cặp mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đoạn gen 16s ARN riboxom của chủng E.coli (J01695), tƣơng ứng với các vị trí nucleotid 15-33 (cho mồi thuận chiều) và 1548-1532 (cho mồi ngƣợc). Trình tự nucleotit của các chủng nghiên cứu đƣợc giải trình trên máy tự động ABI- 377 của Hãng Perkin-Elmer (Mỹ), sau đó đƣợc xử lý bằng chƣơng trình SeqEd1.03 và chƣơng trình AssemblyLIGN 1.9 trong hệ chƣơng trình MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.). Truy cập Ngân hàng Gen bằng chƣơng trình Entrez/nucleotide/ tìm kiếm các trình tự gen 16s ARN riboxom của vi khuẩn. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của tất cả các chuỗi bằng chƣơng trình GENDOC2.5. Thành phần nucleotit đƣợc thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (vi khuẩn) trong Ngân hàng Gen (bảng mã di truyền số 11) thông qua chƣơng trình GENDOC 2.5. Tên vi sinh vật đƣợc xác định với xác suất tƣơng đồng cao nhất.
2.2.6. Thí nghiệm ở quy mô nhà lƣới và đồng ruộng diện hẹp với cây lạc.
Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm ở quy mô nhà lƣới và đồng ruộng diện hẹp theo 10TCN 216-2003. Thời gian theo dõi thí nghiệm là một chu kỳ sinh trƣởng phát triển của cây trồng (từ khi gieo trồng cho đến khi thu hoạch xong). Số liệu nghiên cứu đƣợc xử lý Microsoft Exel 2003 và phần mềm IRRISTAT.
35
Giống cây thí nghiệm là giống lạc đƣợc sử dụng đại trà L14.
Phương pháp bố trí thí nghiệm ở nhà lưới:
-Công thức thí nghiệm: Gồm 4 công thức với 3 lần lặp lại. CT1: Đối chứng dƣơng (bón NPK theo quy trình).
CT2: Đối chứng âm (Vi khuẩn gây bệnh héo xanh + bón NPK theo quy trình) CT3: Bổ sung dịch vi sinh vật + bón NPK theo quy trình.
CT4: Bổ sung dịch vi sinh vật + vi khuẩn gây bệnh héo xanh + bón NPK theo quy trình.
Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng diện hẹp: - Công thức thí nghiệm: Gồm 2 công thức với 3 lần lặp lại. CT1: Đối chứng dƣơng (bón NPK theo quy trình).
CT2: Bổ sung dịch vi sinh vật + vi khuẩn gây bệnh héo xanh + bón NPK theo quy trình.
-Nền phân bón cho một ha lạc: 10 tấn phân chuồng + 30kg N + 90kg P2O5 + 60kg K2O.
-Cách bón: Bón lót toàn bộ phân chuồng + toàn bộ phân lân + 1/2 phân đạm và 1/2 phân kali. Lƣợng phân đạm và kali còn lại bón thúc vào lúc xới vun lần một.
-Các chỉ tiêu theo dõi + Chiều cao cây (cm). + Số cành cấp 1 (cành). + Số cành cấp 2 (cành). + Số hạt chắc trên cây (hạt). + P100 hạt (g).
36
+ Năng suất thực thu (tạ/ha). + Năng suất lý thuyết (tạ/ha).
Đánh giá tính chống chịu bệnh:
Tỷ lệ cây bị bệnh: Đếm số cây bị bệnh từ sau mọc đến lúc thu hoạch. Tính tỷ lệ % cây bị bệnh theo công thức:
Tổng số cây bị bệnh
Tỷ lệ cây bị bệnh (%) = x 100 Tổng số cây điều tra
Chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của cây lạc:
+ Chiều cao cây (cm): Đo từ giao điểm rễ với thân đến điểm sinh trƣởng của ngọn cao nhất (mỗi hàng theo dõi 5 cây liên tục ở giữa ô thí nghiệm).
+ Số thân chính/khóm (thân): Đếm số thân chính của 10 khóm theo dõi (mỗi hàng theo dõi 5 cây liên tục ở giữa ô thí nghiệm).
Chỉ tiêu về năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất:
+ Số hạt/khóm (hạt): Tổng số hạt của 10 khóm Số hạt/khóm = 10 + Khối lƣợng hạt (g/hạt): Khối lƣợng hạt của 10 khóm Khối lƣợng hạt = Số hạt của 10 khóm