Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển quảng trị

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị Giáo viên hướng dẫn : T.S Vũ Thị Thu Huyền Giáo viên hướng dẫn : Th.s Trần Thị Kim Dung Sinh viên thực : Phạm Vũ Vương Lớp : 13-01 Hà Nội, 05-2017 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc ********** LỜI CAM ĐOAN Tên là: Phạm Vũ Vương Sinh viên lớp: 13-01 Mã SV: 13A31010069 Tôi xin cam đoan số liệu kết thu thân trực dõi, thu thập với thái độ hoàn toàn khách quan trung thực , tài liệu trích dẫn tác giả liệt kê đầy đủ, không chép tài liệu mà khơng có trích dẫn Hà Nội, ngày12tháng 05năm 2017 Sinh viên Phạm Vũ Vương LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến T.s Vũ Thị Thu Huyền Th.s Trần Thị Kim Dung tận tình hướng dẫn suốt trình thực đề tài viết Luận văn tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình truyền đạt kiến thức năm em học tập Với vốn kiến thức tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà hành trang q báu để em bước vào đời cách vững tự tin Em xin cảm ơn Cô, Chị làm việc phòng Cơng Nghệ Sinh Học - Viện Hố Sinh Biển Viện Nghiên Cứu Khoa Học Miền Trung cho phép tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập Em kính chúc quý Thầy, Cô dồi sức khỏe thành công nghiệp cao q Đồng kính chúc Cơ, Chú, Anh, Chị trongphòng Cơng Nghệ Sinh Học - Viện Hố Sinh Biển Viện Nghiên Cứu Khoa Học Miền Trung dồi sức khỏe, đạt nhiều thành công tốt đẹp cơng việc Cuối cùng, emxin bày tỏ lòng biết ơn đến bạn bè gia đình hết lòng động viên giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn Mục Lục MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hải miên: 1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên: 1.3.Một số nghiên cứu nước giới chất có hoạt tính sinh học thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên: 1.4.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết với hải miên Việt Nam: 10 1.5 Vai trò polyketide synthase: 12 1.6 Vector tách dòng pCR2.1 invitrogen 15 PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu 18 2.1.1 Vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị phân lập 18 2.1.2 Các thiết bị sinh phẩm 18 2.1.3 Trang thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 21 2.2.1 Phương pháp tách DNA tổng vi sinh vật liên kết hải miên: 21 2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ quang phổ kế : 23 2.2.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): 24 2.2.4 Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng: 27 2.2.5 Tách chiết plasmid: 28 2.2.6 Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose (thôi gel): 31 2.2.7 Tinh vector tái tổ hợp: 33 2.2.8 Xác định trình tự gen máy tự động: 34 PHẦN 3: KẾT QUẢ 36 3.1 Kết tách DNA tổng số: 36 3.2 Kết khuếch đại gen (PCR) 37 3.3 Kết thu nhận gen polyketide synthase từ gel agarose (thôi gel) 39 3.4 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợpvào tế bào khả biến 40 3.5 Kết tách plasmid 41 3.6 Kết giải trình tự 42 PHẦN 4: KẾT LUẬN 47 PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Amp Ampicillin DNA Deoxyribonucleotid Acid DEPC Diethylpyrocarbonat dNTP Deoxyribonucleotid 5’-triphosphates EtBr Ethidium bromide EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid kb Kilo base LB Lauria-Bertani NRPS Non ribosomal peptide synthases mRNA Messenger RNA OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleotid Acid RNase Ribonuclease RT Room temperature SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris-Acetate-EDTA Taq polymerase Polymerase Thermus aquaticus TE Tris-EDTA KPS X-gal Vsv v/p Polyketide synthase 5-bomo-chlorua-3-indolyl-β-D-galactoside Vi sinh vật vòng/phút DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Mẫu hải miên thu nhận từ biển Quảng Trị Việt Nam Hình 1.2.Phản ứng tổng hợp polyketide sinh tổng hợp tiền chất doxorubicin, є-rhodomycinone 14 Hình 1.3.Sơ đồ cấu trúc vị trí cắt giới hạn vector pCR®2.1 17 Hình 2.1 Trình tự cắt enzyme giới hạn EcoR I 30 Hình 3.1.Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số vi sinh vật liên kết hải miên 36 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩmPCR gel agarose % 39 Hình 3.3.Kết điện di sản phẩm PCR tinh sau gel 40 Hình 3.4.Hình ảnh đĩa ni cấy sau biến nạp 41 Hình 3.5.Điện di đồ sản phẩm tách plasmid 42 Hình 3.6.Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide gen PKS thu genbank 45 Hình 3.7.So sánh trình tự acid amin dịch mã từ trinh tự nucleotide với trình tự acid amin công bố genbank 46 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.Các enzymes biển phát từ nguồn metagenomics: .6 Bảng : Thành phần vị trí vector tách dòng pCR®2.1: 16 Bảng Thành phần phản ứng PCR: 38 Bảng 4.Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 38 Bảng Thành phần phản ứng chu trình nhiệt: 43 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề: Việt Nam nằm khu vực Thái Bình Dương, nơi có nguồn đa dạng sinh học vơ phong phú.Một vài năm trước nghiên cứu hóa học hợp chất thiên nhiên biển Việt Nam mới, nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất từ nguồn sinh vật biển nhằm phục vụ sản xuất thực phẩm chức dùng làm nguyên liệu nghiên cứu thuốc giai đoạn đầu Sinh vật biển nguồn nguyên liệu lý tưởng cung cấp hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sinh, chống sốt rét, chống ung thư, kìm hãm HIV, điều biến… cung cấp nhiều loại thuốc mới, chế phẩm có giá trị cao phục vụ nơng nghiệp, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm nước xuất Đại dương chứa 500.000 loài động vật khơng xương sống cá lồi rong, tảo.Mơi trường biển kho tàng hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mà nhiều chất cho thấy đặc điểm cấu trúc chưa gặp hợp chất thiên nhiên cạn.Một số loài tạo hợp chất sinh học từ nguồn thức ăn, số khác tự tổng hợp mới, số chất vi sinh vật liên kết sinh ra, số khác đòi hỏi phải có kết hợp vật chủ vi sinh vật Cấu trúc, tính chất hợp chất mẫu bị tác động vùng phân bố mẫu hoặcbởi yếu tố địa lý mùa vụ Hải miên biết nguồn giàu sản phẩm tự nhiên giá trị polyketides, nonribosomal peptids alkaloids Các nhà khoa học tin nhiều sản phẩm hải miên thực tế vi sinh vật liên kết hải miên sinh Vùng biển Quảng Trị nơi phát đánh giá khu vực hải miên sinh nhiều hoạt chất thiên nhiên phong phú Bởi vậy, thực đề tài: “Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI hải miên vùng biển Quảng Trị.” nhằm xác định vi sinh vật liên kết hải miên nguồn thu polyketide synthase hiệu có ứng dụng thực tế Mục tiêu Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị thành cơng tìm hiểu ứng dụng polyketide synthasetrong nghiên cứu sản xuất Nội dung nghiên cứu Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose % Giếng 1: Sản phẩm PCR; giếng 2: Thang DNA 1kbp plus Fermentas Kết điện di cho thấy, sản phẩm PCR có nhiều băng rõ nét, nhiên sản phẩm lý thuyết mong đợi xuất với kích thước tương ứng khoảng 700 bp, điều chứng tỏ cặp mồi thiết kế có hiệu Ngồi sản phẩm mong muốn, xuất thêm hai sản phẩm khác, chúng tơi nhận định hệ gen của nhiều vi sinh vật liên kết hải miên tồn nhiều vùng có trình tự tương đồng với trình tự cặp mồi 3.3 Kết thu nhận gen polyketide synthase từ gel agarose (thôi gel) Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 700 bp xuất rõ điện di đồ lựa chọn Tuy nhiên, sản phẩm chưa có đủ độ cần thiết để làm thí nghiệm lẫn tạp với sản phẩm khác có sản phẩm Do đó, chúng tơi tiến hành tinh sạch, thu nhận gen từ gel agarose này, phương pháp thơi gel tiến hành theo quy trình hãng Sản phẩm tinh sau gel điện di kiểm tra gel agarose 1% (hình 3.3) Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 39 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR tinh sau gel Giếng 1: sản phẩm PCR tinh sạch; Giếng 2: Marker DNA kb Kết hình 3.3 cho thấy sản phẩm tinh băng rõ nét, không bị đứt gãy có kích thước khoảng 700 bp Điều cho thấy băng DNA đích tinh thành cơng có tính ngun vẹn cao, sử dụng làm nguyên liệu để gắn vào vector tách dòng 3.4 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợpvào tế bào khả biến Quá trình biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn khả biến chủng E coli thực phương pháp sốc nhiệt Môi trường chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp mơi trường LB đặc, có bổ sung ampicillin (100 µg/ml), X-gal (40 µg/ml), IPTG (40 µg/ml) Sau ni 370C 16 giờ, đĩa mơi trường có hai dạng khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu xanh khuẩn lạc có màu trắng Do vectơ pCR 2.1 có mang gen kháng Ampicillin, khuẩn lạc mọc mơi trường chứa Ampicilin phải vi khuẩn mang plasmid Ngồi ra, trình tự đa điểm cho enzym giới hạn nhận biết lại nằm vùng promotor gen mã cho tiểu phần α enzym β - galactosidase Bình thường, vùng đa điểm khơng ảnh hưởng tới đoạn gen, tiểu Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 40 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI phần tổng hợp enzym tạo có tác dụng phân huỷ Xgal tạo sản phẩm làm cho khuẩn lạc có màu xanh Khi có đoạn gen lạ chèn vào vùng đa điểm, điều khiển tổng hợp tiểu phần bị ngắt quãng, tế bào enzym hoạt động, kết khơng phân huỷ X-gal, khuẩn lạc có màu trắng Như khuẩn lạc trắng khuẩn lạc cho có khả mang plasmid tái tổ hợp Kết biến nạp cho thấy có nhiều khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh xuất đĩa thạch Để kiểm tra khả khuẩn lạc trắng chắn mang plasmid tái tổ hợp (plasmid có mang gen mục tiêu), lựa chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh, khuẩn lạc ni mơi trường LB lỏng có bổ sung Ampicilin nồng độ cuối 100 µg/ml , 37oC 18 Hình 3.4 Hình ảnh đĩa ni cấy sau biến nạp 3.5 Kết tách plasmid Mỗi khuẩn lạc chọn nuôi riêng 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin nêu Qui trình tách plasmit tiến hành theo phương pháp mô tả Plasmid sau tách Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 41 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI điện di kiểm tra gel agarose 1%.Kết tách chiết DNA plasmid từ E.coli thể hình 3.5 Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm tách plasmid Giếng 1, plasmid tách từ khuẩn lạc trắng; Giếng plasmid tách từ khuẩn lạc xanh Điện di đồ hình 3.5 cho thấy plasmid tách từ khuẩn lạc trắng có kích thước lớn kích thước plasmid từ khuẩn lạc xanh, cho khuẩn lạc mang plasmit có gắn gen mục tiêu Do vậy, chúng tơi tiến hành giải trình tự plasmid khuẩn lạc 1,2 để kiểm tra 3.6 Kết giải trình tự Trình tự nucleotide gen mục tiêu giải máy giải trình tự tự động ABI PRISM  3100 Avant (Aplied Biosytem) với hóa chất sinh phẩm chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi M13 Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 42 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Trên sở hoạt động máy, trước tiên phản ứng gắn nucleotide đánh dấu vào sợi DNA tổng hợp sợi khuôn tiến hành máy PCR Thành phần phản ứng mô tả bảng Bảng 5: Thành phần phản ứng chu trình nhiệt trình bày sau: Thành phần phản ứng Big Dye : µl Chu trình nhiệt Bước : 960C / phút Mồi (xuôi ngược ):1,275 µl Bước : 960C / 10 giây Buffer 2,5 X : µl Bước : 500C / giây Plasmid : µl Bước : 600C / phút H2O khử ion vô trùng : 4,725 µl Bước : Lặp lại 25 chu kì từ bước đến bước Tổng thể tích : 15 µl Bước : 40C / ∞ Tinh sản phẩm để xác định trình tự - Bổ sung µl EDTA 125mM pH ống sản phẩm - Thêm vào 60 µl etanol 100% Ủ nhiệt độ phòng 15 phút - Ly tâm tốc độ 4500 vòng 45 phút Thu tủa, rửa 60 µl etanol 70% - Ly tâm tốc độ 10000 v/p 10 phút Loại dịch thu cặn - Làm khơ DNA Thêm vào 15µl Hidiformamide - Biến tính 95oC phút Đưa mẫu vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Sau kết thúc trình giải trình tự, trình tự xử lý phần mềm Bio-edit, kết xác định trình tự với cặp mồi M13R sau (trình tự nucleotit từ vị trí nucleotide số đến 683): Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 43 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI GCCATGGACCCGCAGCAACGCATCTTGCTGACGTATGCGTGGAAAGCGATTGAAGATGCCGGATAT GCGTCAAAGAGTCTCTCAGGCACAAAGACAGGTG 101 TGTTTATCGGGACCGGAAACACCGGCTACGGTTCTCTTTTAGCCAATGCCGATGCGGCGATTGAAG GGTCATCCGCGGCGAATACAAGTCCGTCTGTCGG 201 ACCGAGCCGTGTCAGCTATACGCTCAATCTGCACGGGCCGAGCGAGCCGATTGATACCGCCTGCTC AAGCTCACTCGTTGCCATACACCATGCCGTTTCT 301 TCAATTGAAGAAGGGACGTGCGACATGGCTTTGGCGGGAGGAATCAATACGATTGTTCTTCCGGAT GTGTATATCAGCTTTGACAAAGCGGGCGCGCTGA 401 GCAAAGAAGGAAGATGCAAAACGTTCTCCGATCAGGCTGACGGTTTTGCCCATGGTGAAGGAGCCG GGCTCTTTTTCCTTAAAAAGCTGAAAGCCGCTGA 501 GGCGGATGGGGACCATATTTACGGCGTCATTAAAGGAAGCGCGGTGAATCACGGCGGCCGTGCGGC ATCTTTAACAACGCCTAACCCGAAACAACAGGCG 601 GAAGTTATTAAAGCCGCATACAAAAAAGCGGGCATTGATCCGAAAACAGTCTCTTATGTCGAGGCG CATGGCACGGGGACAAG Trình tự sau dịch mã sang acid amin: Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 44 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI AMDPQQRILLTYAWKAIEDAGYASKSLSGTKTGV FIGTGNTGYGSLLANADAAIEGSSAANTSPSVGPS RVSYTLNLHGPSEPIDTACSSSLVAIHHAVSSIEEG TCDMALAGGINTIVLPDVYISFDKAGALSKEGRCK TFSDQADGFAHGEGAGLFFLKKLKAAEADGDHIY GVIKGSAVNHGGRAASLTTPNPKQQAEVIKAAYK KAGIDPKTVSYVEAHGTGT Trình tự sau xử lý phần mềm bioedit so sánh ngân hàng gen quốc tế, kết cho thấy trình tự có độ tương đồng 99% nucleotidevà trình tự acid amin với trình tự polyketide synthase kí hiệu WPySW2 công bố bởiFang,W Zhu,P Trường Đại học Ningbo,Zhejiang, P.R China Điều cho thấy tách dòng thành cơng đoạn gen PKS dài 683 bp, làm tiền đề cho công việc Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 45 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Hình 3.6 Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide gen PKS thu genbank Hình 3.7: So sánh trình tự acid amin dịch mã từ trinh tự nucleotide với trình tự acid amin cơng bố genbank Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 46 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI PHẦN 4: KẾT LUẬN Từ kết nhận được, chúng tơi khẳng định tách dòng thành cơng đoạn gen polyketide synthase có độ dài 683 bp từ vi sinh vật liên kết hải miên, làm tiền đề cho việc biểu gen thu nhận protein có hoạt tính từ dòng gen Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 47 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Abdelmohsen Usama Ramadan, Matthias Szesny, Eman Maher Othman, Tanja Schirmeister, Stephanie Grond, Helga Stopper and Ute Hentschel (2012) Antioxidant and Anti-Protease Activities of Diazepinomicin from the SpongeAssociated Micromonospora Strain RV115 Mar Drugs, 10, 2208-2221; doi:10.3390/md10102208 Azzini Francesca, Barbara Calcinai, Carlo Cerrano, Giorgio Bavestrello, Maurizio Pansini (2007) Sponges of the marine karst lakes and of the coast of the islands of Ha Long Bay (North Vietnam)Porifera Research: Biodiversity, Innovation and Sustainability 2007: 157- 164 Basáak Oăztuărk, Lenny de Jaeger, Hauke Smidt & Detmer Sipkema (2013) Culture-dependent and independent approaches for identifying novel halogenases encoded by Crambe crambe (marine sponge) microbiota Sci Reports 3:2780 DOI:10.1038/srep02780 Basáak Oăztuărk, Lenny de Jaeger, Hauke Smidt & Detmer Sipkema (2013) Culture-dependent and independent approaches for identifying novel halogenases encoded by Crambe crambe (marine sponge) microbiota Scientific Reports 3:2780 DOI: 10.1038/srep02780 Brakhage A.A., 2013 Regulation of fungal secondary metabolism Nat Rev Microbiol 11, 21–32 Calcinai Barbara, Francesca Azzini, Giorgio Bavestrello, Carlo Cerrano, Maurizio Pansini and Do Cong Thung (2006) Boring sponges from Ha Long Bay, Tonkin Gulf, Vietnam Zoological studies 45(2): 201-212 Desbois, A P., and V J Smith 2010 Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential Appl Microbiol Biotechnol 85:1629–1642 Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 48 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Đỗ Mạnh Hào, Phạm Thế Thư (2010) Một số kết nghiên cứu vi sinh vật vùng ven biển Hải Phòng TC Khoa học Công nghệ biển 10(1):51-65 Feby Annie, Shanta Nair (2010) Sponge-associated bacteria of Lakshadweep coral reefs, India:resources for extracellular hydrolytic enzymes Adv Biosci Biotechnol 1:330-337, doi:10.4236/abb.2010.14043 Goode Ann Marie (2009) Polyketide synthase pathway discovery from soil metagenomic libraries MS thesis, Auburn University 10 He R, Bochu Wang, Toshiyuki Wakimoto, Manyuan Wang, Liancai Zhu and Ikuro Abe (2013) Cyclodipeptides from Metagenomic Library of a Japanese Marine Sponge J Braz Chem Soc., 24(12): 1926-1932 11 He Rui, Toshiyuki Wakimoto, Yoko Egami, Hiromichi Kenmoku, Takuya Ito, Yoshinori Asakawa, Ikuro Abe (2012) Heterologously expressed bhydroxyl fatty acids from a metagenomic library of a marine sponge Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 22 7322–7325 12 Hill Malcolm, April Hill, Nora Lopez, Olivia Harriott (2006) Sponge-specific bacterial symbionts in the Caribbean sponge, Chondrilla nucula (Demospongiae, Chondrosida) Marine Biology 148: 1221–1230 DOI 10.1007/s00227-005-0164-5 13 Jiang Cheng-Jian, Zhen-Yu Hao, Rong Zeng, Pei-Hong Shen, Jun-Fang Li and Bo Wu (2011) Characterization of a Novel Serine Protease Inhibitor Gene from a Marine Metagenome Mar Drugs, 9, 1487-1501; doi:10.3390/md9091487 14 Karpushova, A., F Bruămmer, S Barth, S Lange, and R D Schmid 2005 Cloning, recombinant expression and biochemical characterization of novel esterases from Bacillus sp associated with the marine sponge Aplysina aerophoba Appl Microbiol Biotechnol 67:59–69 Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 49 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI 15 Kennedy J., N.D O’Leary, G.S Kiran, J.P Morrissey, F O’Gara, J Selvin and A.D.W Dobson (2011) Functional metagenomic strategies for the discovery of novel enzymes and biosurfactants with biotechnological applications from marine ecosystems J Appl Microbiol 111, 787–799 16 Kennedy Jonathan, Caroline E Codling, Brian V Jones, Alan D W Dobson and Julian R Marchesi (2008) Diversity of microbes associated with the marine sponge, Haliclona simulans, isolated from Irish waters and identification of polyketide synthase genes from the sponge metagenome Environmental Microbiology 10(7): 1888–1902 17 Kim Tae Kyung and John A Fuerst (2006) Diversity of polyketide synthase genes from bacteria associated with the marine sponge Pseudoceratina clavata : culture-dependent and culture-independent Approaches Environmental Microbiology 18 Lại Thúy Hiền, Dương Văn Thắng, Trần Cẩm Vân, Dỗn Thái Hòa (2003) Vi khuẩn tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học phân lập từ bãi biển Nha Trang TC Sinh học 25(4): 53-61 19 Li Zhiyong, Ye Hu, Yan Liu,Yi Huang, Liming He, Xiaoling Miao(2007) 16S rDNA clone library-based bacterial phylogenetic diversity associated with three South China Sea sponges World J Microbiol Biotechnol 23:1265–1272 20 Nguyen Huu Tung, Chau Van Minh, Tran Thu Ha, Phan Van Kiem, Hoang Thanh Huong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Jae-Hee Hyun, Hee-Kyoung Kang, Young Ho Kim (2009) C29-Sterols with a cyclopropane ring at C-25 and 26 from the Vietnamese marine sponge Ianthella sp and their anticancer properties Bioorganic & Medicinal Chem Letter DOI: 10.1016/j.bmcl.2009.06.097 21 Nguyen Xuan Cuong, Arlette Longeon, Van Cuong Pham, Félix Urvois, Christine Bressy, Thi Thanh Van Trinh , Hoai Nam Nguyen, Van Kiem Phan, Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 50 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN I HC M H NI Van Minh Chau, Jean-Franỗois Briand, and Marie-Lise Bourguet-Kondracki (2013) Antifouling 26,27-Cyclosterols from the Vietnamese Marine Sponge Xestospongia testudinariaJ Nat Prod., 76 (7):1313–1318 22 Nguyen Xuan Cuong,Tran Anh Tuan,Phan Van Kiem,Chau Van Minh,Eun Mi Choi,and Young Ho Kim (2008) New Cembranoid Diterpenes from the Vietnamese Soft Coral Sarcophyton mililatensis Stimulate Osteoblastic Differentiation in MC3T3-E1 CellsChem Pharm Bull 56(7) 988—992 23 Okamura, Y., et al 2010 Isolation and characterization of a GDSL esterase from the metagenome of a marine sponge-associated bacteria Mar Biotechnol 12:395–402 24 Penesyan Anahit, Jan Tebben, Matthew Lee, Torsten Thomas, Staffan Kjelleberg, Tilmann Harder and Suhelen Egan (2011) Identification of the Antibacterial Compound Produced by the Marine Epiphytic Bacterium Pseudovibrio sp D323 and Related Sponge-Associated Bacteria Mar Drugs, 9, 1391-1402 25 Piel Joă rn, Dequan Hui, Gaiping Wen, Daniel Butzke, Matthias Platzer, Nobuhiro Fusetani, and Shigeki Matsunaga (2004) Antitumor polyketide biosynthesis by an uncultivated bacterial symbiont of the marine sponge Theonella swinhoei PNAS 101(46):16222-16227 26 Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007) Tối ưu số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp QN6 sinh tổng hợp protease TC Công nghệ sinh học, 5(2):187-196 27 Radjasa Ocky Karna, Agus Sabdono, Junaidi and Elena Zocchi (2007) Richness of secondary metabolite-producing marine bacteria associated with sponge Haliclona sp Inter J Pharmacology 3(3): 275-279 28 Schirmer Andreas, Rishali Gadkari, Christopher D Reeves, Fadia Ibrahim, Edward F DeLong and C Richard Hutchinson (2005) Metagenomic analysis Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 51 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI reveals diverse polyketid synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta Appl Environ Microbiol, 71(8): 4840- 4849 29 Sipkema D, Schippers K, Maalcke WJ, Yang Y, Salim S, Blanch HW (2011) Multiple approaches to enhance the cultivability of bacteria associated with the marine sponge Haliclona (gellius) sp Appl Environ Microbiol 77, 21302140 30 Thomas Tresa Remya A., Devanand P Kavlekar and Ponnapakkam A LokaBharathi (2010) Marine Drugs from Sponge-Microbe Association—A Review Mar Drugs 8: 1417-1468; doi:10.3390/md8041417 31 Tseng C-H and Sen-Lin Tang (2014) Marine Microbial Metagenomics: From Individual to the Environment Int J Mol Sci., 15, 8878-8892; doi:10.3390/ijms15058878 32 Utkina N K and V A Denisenko (2011) Sesquiterpene Quinones From a Viet Nam sea sponge Spongia SP Chem Natural Compounds 47(1): 135-137 33 Wahyudi AT, Qatrunnada, Nisa Rachmania Mubarik (2010) Screening and Characterization of Protease Inhibitors from Marine Bacteria Associated with Sponge Jaspis sp HAYATI Journal of Biosciences December, 17(4): 173178 34 Wahyudi AT, Qatrunnada, Nisa Rachmania Mubarik Screening and Characterization of Protease Inhibitors from Marine Bacteria Associated with Sponge Jaspis sp HAYATI Journal of Biosciences December 2010, 17(4): 173-178 35 Wang Guangyi (2006)Diversity and biotechnological potential of the spongeassociated microbial consortia J Ind Microbiol Biotechnol 33: 545-551 36 Yung Pui Yi, Catherine Burke, Matt Lewis, Staffan Kjelleberg, Torsten Thomas (2010)Novel antibacterial Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH proteins from the microbial Trang 52 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI communitiesassociated with the sponge Cymbastela concentrica and the green alga Ulva australis Appl Environ Microbiol., doi:10.1128/AEM.0203810 37 Zhang Hongzhen, Fengli Zhang, Zhiyong Li(2009) Gene analysis, optimized production and property of marine lipase from Bacillus pumilus B106 associated with South China Sea sponge Halichondria rugosa World J Microbiol Biotechnol 25:1267–1274 DOI 10.1007/s11274-009-0010-x Phạm Vũ Vương - Lớp 1301 – CNSH Trang 53 ... NGHIỆP VI N ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI hải miên vùng biển Quảng Trị. ” nhằm xác định vi sinh vật liên kết hải miên nguồn thu polyketide synthase hiệu có ứng dụng thực tế Mục tiêu Tách dòng gen mã hóa polyketide. .. polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị thành cơng tìm hiểu ứng dụng polyketide synthasetrong nghiên cứu sản xuất Nội dung nghiên cứu Tách dòng gen mã hóa polyketide. .. hải miên thu nhận từ biển Quảng Trị Vi t Nam Bên nhiều loài hải miên nơi cư trú cộng đồng vi sinh vật bao gồm vi khuẩn cổ, vi khuẩn, nấm virus Sinh khối vi sinh vật chiếm tới 35% khối lượng hải