Cloning gen mã hóa pectinase từ cộng đồng vi sinh vật không thông qua nuôi cấy

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: CLONING GEN MÃ HÓA PECTINASE TỪ CỘNG ĐỒNG VI SINH VẬT KHÔNG THÔNG QUA NUÔI CẤY Người hướng dẫn : TS Lê Văn Trường Người hướng dẫn : KS Lê Trọng Tài Sinh viên thực : Đặng Duy Đức – Lớp 1101 HÀ NỘI - 2015 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn tới TS Lê Văn Trường, Phòng Di Truyền Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn KS Lê Trọng Tài tập thể cán phòng Di Truyền Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực khóa luận Qua đây, xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội dạy dỗ, hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè không ngừng giúp đỡ chia sẻ, động viên suốt trình học tập thực khóa luận Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2015 Sinh viên Đặng Duy Đức Sinh viên: Đặng Duy Đức ii GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ PECTINASE 1.1.1 Khái niệm pectinase 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Ứng dụng pectinanase 1.1.3.1 Ứng dụng công nghiệp ép trái rượu vang 1.1.3.2 Dùng làm mềm mô thực vật 1.1.3.3 Xử lý nước thải có chứa pectinase 1.1.3.4 Ứng dụng công nghiệp sản xuất giấy 1.1.3.5 Ứng dụng trình trích ly dầu thực vật 1.1.4 Một số phương pháp thu pectinase 1.1.4.1 Pectinase thực vật 1.1.4.2 Pectin vi sinh vật 1.2 KỸ THUẬT METAGENOMIC 1.2.1 Khái niệm metagenomics 1.2.2 Lịch sử metagenomics 1.2.3 Sự ưu việt kĩ thuật metagenomic nghiên cứu quần thể vi sinh vật đất 1.2.4 Tách dòng gen 1.2.4.1 Tách dòng thực nghiệm 10 1.2.4.2 Tách dòng silicon 13 1.2.5 Một số nghiên cứu Metagenome 14 1.2.5.1 Trên giới 14 1.2.5.2 Ở Việt Nam 18 CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 20 2.1.1 Nguyên vật liệu 20 2.1.2 Hóa chất 20 Sinh viên: Đặng Duy Đức i GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2.1.3 Vật tư 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Tách chiết DNA metagenome theo Yeates cộng 21 2.2.2 Phương pháp điện di DNA gel agarose 22 2.2.3 Phương pháp tinh DNA metagenome Troughing cải tiến 23 2.2.4 Phương pháp kiểm tra nồng độ độ tinh DNA máy quang phổ 23 2.2.5 Phương pháp nhân gen Polymerase chanins reaction 25 2.2.6 Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng pJET1.2 25 2.2.7 Biến nạp plasmid vào E.coli phương pháp xung điện 26 2.2.8 Tách chiết DNA plasmid 26 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 KẾT QUẢ 28 3.1.1 Tách DNA metagenomic từ đất 28 3.1.2 Phân lập gen pectinase PCR 29 3.1.3 Tách dòng gen vào pJET1.2 30 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 4.1 KẾT LUẬN 37 4.2 KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Sinh viên: Đặng Duy Đức ii GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ qui trình tách dòng gen 11 Hình 2.1: PCR ngược 13 Hình 3.1: Điện di DNA metagenomic vi sinh vật từ mẫu đất khác 28 Hình 3.2: Kết nhân gene pectinase từ DNA metagenom thu cặp mồi đặc hiệu với gen pesctinase B subtilis 29 Hình 3.3: Các thể biến nạp E.coli DH1b mang pJET/pel môi trường chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicilin 30 Hình 3.4 : Điện di sản phẩm cắt pJET/pel XhoI XbaI 35 Hình 3.5 : Trình tự nucleotide trình tự amino acid suy diễn gen phân lập từ metagenomics primer đặc hiệu cho gen pectinase B subtilis 35 Hình 3.6 : So sánh trình tự amino acid gen thu với số trình tự amino acid pectinase biết 35 Sinh viên: Đặng Duy Đức iii GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại enzym pectinase Bảng 2.1: Hóa chất 20 Bảng 2.2: Vật tư 21 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt plasmid XhoI XbaI 24 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR: 25 Bảng 3.1: Độ mẫu DNA sau tinh 29 Bảng 3.2: So sánh trình tự amino acid gen thu với gen biết ngân hàng gen 34 Sinh viên: Đặng Duy Đức iv GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẶT VẤN ĐỀ Vi sinh vật tự nhiên đa dạng phong phú, theo nghiên cứu gần đây, vi sinh vật nuôi cấy chiếm khoảng 0.1 đến 1% tổng số loài sinh vật hệ sinh thái [6], đa dạng gen phần lớn nằm vi sinh vật không nuôi cấy Để tìm enzyme có đặc tính hướng nghiên cứu sang lọc gen mã hóa enzyme từ thư viên DNA genome hệ sinh vật có mẫu tự nhiên (đât, bùn, nước…) không thông qua nuôi cấy Kỹ thuật giúp nhanh chóng tìm nhiều gen có khả tìm gen có đặc tính quý hoàn toàn Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới, có hệ vi sinh vật vô phong phú, đặc biệt hệ vi sinh vật sống môi trường đất, nguồn tài nguyên vô quý giá để khai thác gen quý Pectinase loại enzyme sử dụng rộng rãi quan trọng nhiều ngành công nhiệp sản xuất rượu vang, sản xuất nước trái cây, sản xuất giấy, trà, cà phê, xử lý nước thải…Pectinase góp phần nâng cao chất lượng sản phẩn giảm chi phí sản xuất bảo vệ môi trường sức khỏe người Vì thực đề tài "Cloning gen mã hóa pectinase từ cộng đồng vi sinh vật không thông qua nuôi cấy" Trong đề tài trình bày kết cloning gen mã hóa pectinase từ cộng đồng vi sinh vật đất mẫu đất lấy từ địa bàn Hà Nội Sinh viên: Đặng Duy Đức GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ PECTINASE 1.1.1 Khái niệm pectinase Pectinase nhóm enzyme xúc tác phân hủy polymer pectin thành acid pectinic pectin phản ứng thủy phân (hydrolases), phản ứng chyển lên kết (trans-elimination), phản ứng cắt liên kết este [15] Trong tự nhiên pectinase tìm thấy thực vật có chức làm mềm thành tế bào trình chín Ngoài pectinase tạo vi sinh vật vi khuẩn, nấm, côn trùng, động vật nguyên sinh Pectinase vi khuẩn nấm giúp cho trình xâm nhiễm vào thực vật Pectinase côn trùng giúp chúng dễ dàng tiêu hóa thực vật 1.1.2 Phân loại Enzyme pectinase phân thành nhóm dựa vào đặc điểm chất chết phân cắt thể bảng Pectinase có hai chế phản ứng bản: Thủy phân (hydrolysis) phân cắt chuyển liên kết (trans - element) Cơ chế thủy phân đòi hỏi có mặt nước, ngược lại chế chuyển liên kết diễn điều kiện không cần nước sản phẩm tạo có liên kết đôi Sinh viên: Đặng Duy Đức GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 1.1: Phân loại enzym pectinase [6] Loại enzym Số EC Cơ chất Sản phẩm Cơ chế xúc tác Esterase - Pectin methylesterase (pectin 3.1.1.11 - Pectin - Pectin acid + Methanol - Thủy phân - Pectin esterase) - Pectin acetylesterase* Polygalacturonase - Protopectinase 3.2.1.15 - Protopectin - Pectin - Thủy phân - Endopolygalacturonase 3.2.1.82 - Pectin acid - Oligogalacturonates - Thủy phân - Exopolygalacturonase - Pectin acid - Monogalacturonate - Thủy phân - Oligogalacturonate hydrolase - Trigalacturonate - Monogalacturonate - Thủy phân - 4:5 Oligogalacturonate -4:5(galacturonate)n - Monogalacturonate không no - Thủy phân hydrolase không no saturate (n-1) - Endopolymethylgalacturonases - Pectin - Methyloligogalacturonates - Thủy phân Lyase - Endopolygalacturonate lyases 4.2.2.2 - Pectin acid - Oligogalacturates không no -Phân cắt chuyển liên kết - Exopolygalacturonate lyases 4.2.2.9 - Pectin acid - Digalacturonates không no - Phân cắt chuyển liên kết - Oligogalacturonate lyases 4.2.2.6 - Digalacturonates - Monogalacturonate không no - Phân cắt chuyển liên kết Sinh viên: Đặng Duy Đức GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP không no - Endopolymethylgalacturonate 4.2.2.10 - Pectin lyase Sinh viên: Đặng Duy Đức - Methylloligogalacturonates không no GVHD: TS Lê Văn Trường - Phân cắt chuyển liên kết KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - Enzyme làm tù đầu (blunting enzyme): 0,3 µl - Nước khử ion: 1,3 µl - Phản ứng ủ 70oC phút, sau làm nguội xuống 22oC Bước Gắn sản phẩm PCR vào vector: - Bổ sung 0,3 µl vector pJET1.2/blunt vào dịch phản ứng bước - Bổ sung tiếp 0,3 µl T4 ligase, - Phản ứng gắn thực 16 oC qua đêm 2.2.7 Biến nạp plasmid vào E.coli phương pháp xung điện - Nuôi cấy khuẩn lạc vi khuẩn E.coli DH 10b môi trường LB lỏng máy lắc 200 vòng/phút 37oC qua đêm - Cấy chuyển 1% dịch tế bào vào 100ml môi trường LB lỏng, lắc tiếp 220 vòng/phút 37oC OD600 đạt 0,5 – 0,7, sau ủ đá - Thu dịch ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút 4oC - Bổ sung nước cất để rửa ly tâm tiếp lần - Hòa lại cặn 0,5ml nước khử ion lạnh - Chia tế bào khả biến sang ống eppendoft, ống 100 µl - Hút µl sản phẩm gắn gen vào ống eppendoft chứa tế bào khả biến, trộn nhẹ đưa vào cuvet xung điện - Xung điện điều kiện 2,5KV, 250F - Bổ sung 0,9 µl môi trường SOC - Hút dịch từ cuvet ống eppendoft - Lắc 220 vòng/phút, 37oC - Trả lại µl dịch biến nạp đĩa môi trường LB thạch có bổ sung kháng sinh ampycline nồng độ 10 µg/ml, ủ tủ ấm 37oC qua đêm trước kiểm tra hiệu suất biến nạp 2.2.8 Tách chiết DNA plasmid - Cho 1,5ml dịch nuôi cấy qua đêm vào ống eppendoft, li tâm 12000 rpm, 1-2 phút Bỏ phần dịch nuôi, thu tế bào Sinh viên: Đặng Duy Đức 26 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - Hòa tế bào 180 µl SolI, vortex cho tế bào an toàn - Cho 180 µl SolII, đảo 3-5 lần - Cho 180 µl SolIII, đảo 3-5 lần - Cho 500 µl Chloroform: isoaminalcohol, đảo 3-5 lần, thao tác nhẹ nhàng để chrosome không bị giải phóng dịch - Ly tâm thường 12000 rpm, phút Thu dịch (500 µl) sang ống eppendoft - Bổ sung 1ml Ethanol 96o (gấp lần thể tích dịch), ủ -20oC - Ly tâm 12000 rpm, 10 phút, 4oC, loại bỏ dịch, thu tủa - Spin nhanh (hoặc ly tâm 12000/30 giây), dùng pipet hút dịch lắng đáy (lưu ý tránh vị trí lắng plasmid) - Làm khô SpeedVac - Hòa tan 50 µl nước cất có RNase, ủ 37oC, Bảo quản mẫu -20oC Các dung dịch: Sol I: 20mM Trí pH 7.5, EDTA Sol II: 1% SDS, 200mM NaOH Sol III: 0.5M K-acetate (or Na-acetate) pH 4.2 (điều chỉnh pH acetic acid) Sinh viên: Đặng Duy Đức 27 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 3.1.1 Tách DNA metagenomic từ đất Với mục đích tách chiết AND metagenomic từ vi sinh vật đất để tách dòng mã hóa gen pectinase chọn mẫu đất vườn giàu xác thực vật có độ ẩm cao DNA metagenomic tách chiết làm mô tả phần phương pháp Kết điện di gel agarose cho thấy DNA có băng đậm rõ, bị đứt gãy (hình 3.1) Kết đo độ tinh máy quang phổ NanoDrop 1000 (Thermo Scientific USA) cho thấy hai số A260/A280 A260/A230 cải thiện đáng kể so với mẫu trước tinh gần với số mẫu DNA chuẩn BS168 (là mẫu DNA tách từ chủng bacillus subtillis 168) Điều chứng tỏ DNA metagenomic thu đủ tiêu chuẩn để sử dụng cho thí nghiệm Hình 3.1: Điện di DNA metagenomic vi sinh vật từ mẫu đất khác Sinh viên: Đặng Duy Đức 28 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 3.1: Độ mẫu DNA sau tinh A260/280 Mẫu DNA A260/230 Trước tinh Sau tinh Trước tinh sạch Sau tinh S1 1,32 1,8 0,9 1,5 S2 1,2 1,7 0,8 1,6 BS168 1,9 1,8 3.1.2 Phân lập gen pectinase PCR M 1,3 kb Hình 3.2: Kết nhân gene pectinase từ DNA metagenom thu cặp mồi đặc hiệu với gen pesctinase B subtilis Bacillus họ vi khuẩn phong phú môi trường đất, họ vi khuẩn biết đến có khả sinh pectinase Nhiều gene pectinase cloning từ chúng Với mục đích phân lập gene mã hóa pectinase từ thư viện gen metagenom, sử dụng primer đặc hiệu với gene pectinase Bacillus subtilis để phân lập gen pectinase Kết nhân gen với mẫu DNA genomics tách từ mẫu đất khác cho thấy có mẫu gen nhân lên với kích thước khoảng 1,3 kb Mẫu lại không Sinh viên: Đặng Duy Đức 29 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP thấy băng xuất (hình 3.12) Kích thước gene pectinase thông thường khoảng 1,2 – 1,5 kb khả đoạn gen nhân lên gen pectinase 3.1.3 Tách dòng gen vào pJET1.2 - Gắn đoạn gene vào vector tách dòng Hình 3.3: Các thể biến nạp E.coli DH1b mang pJET/pel môi trường chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicilin Với mục đích giải trình tự đoạn gen, Với mục đích giải trình tự đoạn gen nhân lên phản ứng PCR trên, sản phẩm tách dòng vào vector pJET1.2 Sản phẩm PCR tách từ gel agarose sau làm tù đầu, gắn vào vector pJET1.2 biến nạp vào E coli DH 10b mô tả phần phương pháp Thể biến nạp chọn lọc môi trường thạch đĩa LB chứa ampicilin 100 µg/ml 37 ˚C qua đêm Những tế bào có chứa vector không mang đoạn gen chèn sinh trưởng gen gây chết (lethal gene) có vùng đa điểm nối vector gây Ngược lại tế bào mang vector có đoạn gen chèn làm hỏng (knock out) gen gây chết vector làm cho gen không biểu tế bào phát triển thành khuẩn lạc môi trường chọn lọc Kết biến nạp thu thể biến nạp môi trường bổ sung ampiciline, khuẩn lạc mọc đĩa đối chứng Điều chứng tỏ phản ứng gắn thí nghiệm biến nạp thành công (hình 3.13) Sinh viên: Đặng Duy Đức 30 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - Phân tích plasmid enzyme giới hạn Các khuẩn lạc môi trường chọn lọc nhân lên riêng rẽ môi trường LB lỏng để tách plasmid theo phương pháp mô tả Plasmid sau tách kit cắt enzyme giới hạn XhoI XbaI để kiểm tra đoạn gen chèn vào hay không Kết điện di sản phẩm cắt plasmid gel agarose cho thấy phần lớn mẫu cắt có băng vector 3kb băng fragment 1,3kb kích thước đoạn gen nhân lên PCR (hình 3.14) Điều chứng tỏ đoạn gen 1,3 kb nhân lên từ mẫu s1 chèn vào vector pJET1.2 nhân lên tế bào E coli Một mẫu plasmid mang gen ngoại lai chọn để giải trình tự gen M Hình 3.4: Điện di sản phẩm cắt pJET/pel XhoI XbaI - 4: pJET1.2 mang gen ngoại lai; 5: pJET1.2 không mang gen ngoại lai: Marker 10kb (Fermentas) Băng 1,3kb mũi tên 3.1.4 Giải trình tự gen so sánh trình tự gen với gen biết Plasmid thu từ mục 3.4 sử dụng để giải trình tự gen hệ giải trình tự tự động 454 sequencing GS Junior system Roche atgaaaaaagtgatgttagctacggctctgtttttaggactgactccagctggcgcgaac M K K V M L A T A L F L G L T P A G A N gcagctgatttaggccaccagacgttgggatccaatgatggctggggcgcgtactcgacc A A D L G H Q T L G S N D G W G A Y S T ggcacgacaggcggatcaaaagcatcctccttgaatgtgtataccgtcagcaacagaaac G T T G G S K A S S L N V Y T V S N R N cagcttgtctcggcattagggaaggaaacgaacacaacgccaaaaatcatttatatcaag Sinh viên: Đặng Duy Đức 31 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Q L V S A L G K E T N T T P K I I Y I K ggaacgattgacatgaacgtggatgacaatctgaagccgcttggcctaaatgactataaa G T I D M N V D D N L K P L G L N D Y K gatccggagtatgatttggacaaatatttgaaagcctatgatcctagcacatggggcaaa D P E Y D L D K Y L K A Y D P S T W G K aaagagccgtcgggcacacaagaagaagcgagaggccgctcgcagaaaaaccaaaaagca K E P S G T Q E E A R G R S Q K N Q K A cgggtcatggtcgatattcctgcaaacacgacgatcgtcggttcagggactaacgctaaa R V M V D I P A N T T I V G S G T N A K gtcttgggaggaaacttccaaatcaagagtgataacgtcattattcgcaacattgaattc V L G G N F Q I K S D N V I I R N I E F catgatgcctatgactattttccgcaatgggatccgactgacggaagctcagggaactgg H D A Y D Y F P Q W D P T D G S S G N W aactcacaatacgacaacatcacgattaacggcggcacacacatctggattgatcactgt N S Q Y D N I T I N G G T H I W I D H C acatttaatgacggttcgcgtccggacagcacatcaccgaaatattatggaagaaaatat T F N D G S R P D S T S P K Y Y G R K Y cagcaccatgacggccaaacggatgcttccaacggtgctaactatatcacgatgtcctat Q H H D G Q T D A S N G A N Y I T M S Y aactattatcacgatcatgataaaagctccattttcggatcaagtgacagcaaaacctcc N Y Y H D H D K S S I F G S S D S K T S gatgacggcaaattaaaaattacgctgcatcataaccgctatcaaaatattgtccagcgc D D G K L K I T L H H N R Y Q N I V Q R gcgccgagagtccgcttcgggcaagtgcacgtatacaacaactattatgaaggaagcaca A P R V R F G Q V H V Y N N Y Y E G S T agctcttcaagttatccttttagctatgcatggggaatcggaaagtcatctaaaatctat S S S S Y P F S Y A W G I G K S S K I Y gcccaaaacaatgtcattgacgtaccgggactgtcagctgctaaaacgatcagcgtattc A Q N N V I D V P G L S A A K T I S V F agcgggggaacggctttatatgactccggcacgttgctgaacggcacacagatcaacgca S G G T A L Y D S G T L L N G T Q I N A tcggctgcaaacgggctgagctcttctgtcggctggacgccgtctctgcatggagcaatt S A A N G L S S S V G W T P S L H G A I gatgcttctgctaatgtgaaatcaaatgttataaatcaagcgggtgcgggtaaattaaat D A S A N V K S N V I N Q A G A G K L N taa Hình 3.5: Trình tự nucleotide trình tự amino acid suy diễn gen phân lập từ metagenomics primer đặc hiệu cho gen pectinase B subtilis Sinh viên: Đặng Duy Đức 32 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Kết giải trình tự gen cho thấy plasmid pJET 1.2/blunt mang đoạn gen có độ dài 1263 bp Khi dịch mã sang protein phần mềm dịch mã xuất trình tự gene chứa khung đọc mở cho protein (Hình 3.15) So sánh trình tự amino acid với gen biết genbank: Kiểm tra độ tương đồng ngân hàng gen quốc tế chương trình Blast trang web NCBI (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) cho thấy độ tương đồng đoạn gen giải trình tự lên từ 98% đến 99% với gen pectate lyase chủng B subtilis công bố Genbank (bảng 3.7) Điều chứng tỏ gen phân lập gen mã hóa cho pectinae Gen đặt tên UCM1 Sinh viên: Đặng Duy Đức 33 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 3.2: So sánh trình tự amino acid gen thu với gen biết ngân hàng gen Sequence ID ref|WP_003233727.1| gb|AFP43209.1| gb|AIX06520.1| Description pectate lyase [Bacillus subtilis] Ident Accession 99% WP_003233727.1 PelA [Bacillus subtilis] 99% Pectate lyase precursor [Bacillus subtilis] AFP43209.1 99% AIX06520.1 99% WP_029726877.1 99% WP_003244025.1 98% WP_032726666.1 98% 2BSP_A 98% WP_014476120.1 98% WP_015383079.1 99% WP_017697500.1 98% WP_029317499.1 MULTISPECIES: ref|WP_029726877.1| pectate lyase [Bacillales] ref|WP_003244025.1| ref|WP_032726666.1| MULTISPECIES: pectate lyase [Bacillus] pectate lyase [Bacillus subtilis] Chain A, Bacillus pdb|2BSP|A Subtilis Pectate Lyase R279k Mutant [Bacillus subtilis] ref|WP_014476120.1| ref|WP_015383079.1| ref|WP_017697500.1| ref|WP_029317499.1| pectate lyase [Bacillus subtilis] pectate lyase [Bacillus subtilis] pectate lyase [Bacillus subtilis] pectate lyase [Bacillus subtilis] Sinh viên: Đặng Duy Đức 34 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP UCM1 MKKVMLATALFLGLTPAGANAADLGHQTLGSNDGWGAYSTGTTGGSKASSLNVYTVSNRN BS-168 MKKVMLATALFLGLTPAGANAADLGHQTLGSNDGWGAYSTGTTGGSKASSSNVYTVSNRN VBS6 MKKVMLATALFLGLTPAGANAADLGHQTLGSNDGWGAYSTGTTGGSKASSSNVYTVSNRN VBS8 MKKVMLATALFLGLTPAGANAADLGHQTLGSNDGWGAYSTGTTGGSKASSSNVYTVSNRN ************************************************** ********* UCM1 QLVSALGKETNTTPKIIYIKGTIDMNVDDNLKPLGLNDYKDPEYDLDKYLKAYDPSTWGK BS-168 QLVSALGKETNTTPKIIYIKGTIDMNVDDNLKPLGLNDYKDPEYDLDKYLKAYDPSTWGK VBS6 QLVSALGKETNTTPKIIYIKGTIDMNVDDNLKPLGLNDYKDPEYDLDKYLKAYDPSTWGK VBS8 QLVSALGKETNTTPKIIYIKGTIDMNVDDNLKPLGLNDYKDPEYDLDKYLKAYDPSTWGK ************************************************************ UCM1 KEPSGTQEEARGRSQKNQKARVMVDIPANTTIVGSGTNAKVLGGNFQIKSDNVIIRNIEF BS-168 KEPSGTQEEARARSQKNQKARVMVDIPANTTIVGSGTNAKVVGGNFQIKSDNVIIRNIEF VBS6 KEPSGTQEEARARSQKNQKARVMVDIPANTTIVGSGTNAKVLGGNFQIKSDNVIIRNIEF VBS8 KEPSGTQEEARARSQKNQKARVMVDIPANTTIVGSGTNAKVVGGNFQIKSDNVIIRNIEF ***********.*****************************:****************** UCM1 HDAYDYFPQWDPTDGSSGNWNSQYDNITINGGTHIWIDHCTFNDGSRPDSTSPKYYGRKY BS-168 QDAYDYFPQWDPTDGSSGNWNSQYDNITINGGTHIWIDHCTFNDGSRPDSTSPKYYGRKY VBS6 HDAYDYFPQWDPTDGSSGNWNSQYDNIAMNGGTHIWIDHCTFNDGSRPDSTSPKYYGRKY VBS8 QDAYDYFPQWDPTDGSSGNWNSQYDNITINGGTHIWIDHCTFNDGSRPDSTSPKYYGRKY :**************************::******************************* UCM1 QHHDGQTDASNGANYITMSYNYYHDHDKSSIFGSSDSKTSDDGKLKITLHHNRYQNIVQR BS-168 QHHDGQTDASNGANYITMSYNYYHDHDKSSIFGSSDSKTSDDGKLKITLHHNRYKNIVQR VBS6 QHHDGQTDASNGANYITMSYNYYHDHDKSSIFGSSDSKTSDDGKLKITLHHNRYQNIVQR VBS8 QHHDGQTDASNGANYITMSYNYYHDHDKSSIFGSSDSKTSDDGKLKITLHHNRYQNIVQR ******************************************************:***** UCM1 APRVRFGQVHVYNNYYEGSTSSSSYPFSYAWGIGKSSKIYAQNNVIDVPGLSAAKTISVF BS-168 APRVRFGQVHVYNNYYEGSTSSSSYPFSYAWGIGKSSKIYAQNNVIDVPGLSAAKTISVF VBS6 APRVRFGQVHVYNNYYEGSTSSSSYPFSYAWGIGKSSKIYAQNNVIDVPGLSAAKTISVF VBS8 APRVRFGQVHVYNNYYEGSTSSSSYPFSYAWGIGKSSKIYAQNNVIDVPGLSAAKTISVF ************************************************************ UCM1 SGGTALYDSGTLLNGTQINASAANGLSSSVGWTPSLHGAIDASANVKSNVINQAGAGKLN BS-168 SGGTALYDSGTLLNGTQINASAANGLSSSVGWTPSLHGSIDASANVKSNVINQAGAGKLN VBS6 SGGTALYDSGTLLNGTQINASAANGLSSSVGWTPSLHGSIDASANVKSNVINQAGAGKLN VBS8 SGGTALYDSGTLLNGTQINASAANGLSSSVGWTPSLHGSIDASANVKSNVINQAGAGKLN **************************************:********************* Hình 3.6 : So sánh trình tự amino acid gen thu với số trình tự amino acid pectinase biết Sinh viên: Đặng Duy Đức 35 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP So sánh trình tự amino acid UCM1 với số trình tự amino acid gen pectinase giống nhất: từ chủng BS 168 phân lập từ cỏ [11] từ chủng VBS6 VBS8 phân lập từ đất Việt Nam (Đỗ Thị Thu Hằng cs, 2012) phần mềm so sánh cụm gen ClustalW [12] Kết cho thấy có vị trí amino acid khác protein này, điều chứng tỏ trình tự amino acid gen pectinase thu gần với gen pectinase chủng so sánh (hình 3.16) Sinh viên: Đặng Duy Đức 36 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN - Đã tách tinh DNA metagenom từ đất - Đã phân lập gen pectinase từ đất PCR - Đã giải mã trình tự nucleotide gen thu được, trình tự gen giống 98 đến 99% trình tự gen pectinase B Subtilis 4.2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu thêm cloning gen mã hóa pectinase từ cậu đồng vi sinh vật đât không thông qua nuôi cấy nhiều mẫu đất Tìm rã gen mã hóa pectinase có nhiều đặc tính ưu việt Sinh viên: Đặng Duy Đức 37 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Carlotta De Filippo, Matteo Ramazzotti, Paolo Fontana and Duccio Cavalieri (2012), Bioinformatic approaches for functional annotation and pathway inference in metagenomics data Briefings in bioiformatic, Vol 13 No 696-710 doi: 10.1093/bib/bbs070 Edited by Diana Marco (2010), Metagenomics: Theory, methods and applications, Caister Academic press, Norfolk, UK ISBN 978-1-904455-54-7 Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ enzyme, Nhà xuất đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh George I et al (2010), Application of Metagenomics to Bioremediation Metagenomics: Theory, Methods and Applications Caister Academic Press, ISBN 978-1-904455-54-7 Jones BV; Sun F; Marchesi JR (2010), Comparative metagenomic analysis of plasmid encoded functions in the human gut microbiome BMC Genomics; 11: 46 Whitaker, J.R, (1990), Pectic substances, pectic enzyme and haze formation in fruit juices Enzyme Microbial Techonnol, 6:341-349 Shrikant Sharma1, Shashank Rana1, Raghvendar Singh Torsvik, 1990, 2002 Thi Huyen Do, Thi Thao Nguyen, Thanh Ngoc Nguyen, Quynh Giang Le, Cuong Nguyen, Keitarou Kimura, and Nam Hai Truong (2014), mining biomass-degrading genes through Illumina-basedde novosequencing and metagenomic analysis of freeliving bacteria in the gut of the lower termite Coptotermes gestroi harvested in Vietnam, J Biosci Bioeng 2014 Dec; 118(6):665-71 doi:10.1016/j.jbiosc.2014.05.010, Epub 2014 Jun 11 10 Torsten, Thomas, Jack Gilbert and Folker Meyer (2012), Metagenomics - a guide from sampling to data analysis Microbial Informatics and Experimentation 2012, 2:3 doi: 10.1186/2042-5783-2-3 Sinh viên: Đặng Duy Đức 38 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 11 Nasser W., Awadef A.C., Reverchon S., Robert-Baudouy J., 1993 “Pectate lyase from Bacillus subtilis: molecular characterization of the gene, and properties of the cloned enzyme” FEBS Lett., 335(3):319-26 12 Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ 1994 “Improved sensitivity of profile searches through the use of sequence weights and gap excision” Comput Appl Biosci 10(1):19–29 13 Zengler, K., M Walcher (2005), “High-througput cultivation of microorganisms using microcapsules” et al (2005) High-throughput cultivation of microorganisms using microcapsules 14 Olsen, Lane et al (1986) “Microbial ecology and evolution: a ribosomal RNA approach” 15 Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh, tập 2, Nhà xuất đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh 16 Kahyap, D.R; Vohra P.K, Chopra, S; Tewari, R (2001), “Application of pectinase in the comercial sector: areview”, Bioresource Technology, 77, pp 512-227 17 http://en.wikipedia.org/wiki/Cloning 18 Erika Cosset &cs, (2013), “Comprehensive metagenomic analysis of glioblastoma reveals absence of known virus despite antiviral-like type I interferon gene response” 19 Hugenholz, P; Goebel BM; Pace NR (ngày tháng năm 1998) “Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity” J Bacteriol 180 (18): 4765–74 20 Lane, DJ; Pace B; Olsen GJ; Stahl DA; Sogin ML; Pace NR (1985) “Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses” Proceedings of the National Academy of Sciences 82 (20): 6955–9 21 Pace, NR; DA Stahl; DJ Lane; GJ Olsen (1985) “Analyzing natural microbial populations by rRNA sequences” ASM News 51: 4–12 Sinh viên: Đặng Duy Đức 39 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 22 Healy, FG; RM Ray; HC Aldrich; AC Wilkie; LO Ingram; KT Shanmugam (1995) “Direct isolation of functional genes encoding cellulases from the microbial consortia in a thermophilic, anaerobic digester maintained on lignocellulose” Appl Microbiol Biotechnol 43 (4): 667–74 23 Stein, JL; TL Marsh; KY Wu; H Shizuya; EF DeLong (1996) “Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon” Journal of Bacteriology 178 (3): 591– 599 24 Breitbart, M; Salamon P; Andresen B; Mahaffy JM; Segall AM; Mead D; Azam F; Rohwer F (2002) “Genomic analysis of uncultured marine viral communities” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99 (22): 14250–14255 25 Hugenholz, P (2002) “Exploring prokaryotic diversity in the genomic era” Genome Biology (2): 1–8 26 Poinar, HN; Schwarz, C, Qi, J, Shapiro, B, Macphee, RD, Buigues, B, Tikhonov, A, Huson, D, Tomsho, LP, Auch, A, Rampp, M, Miller, W, and Schuster, SC (2006) “Metagenomics to Paleogenomics: Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA” Science 311 (5759): 392–394 27 Edwards, RA; Rodriguez-Brito B; Wegley L; Haynes M; Breitbart M; Peterson DM; Saar MO; Alexander S; Alexander EC; Rohwer F (2006) “Using pyrosequencing to shed light on deep mine microbial ecology” BMC Genomics 7: 57 28 Yeates, C., et al., 1996 “PCR amplification of crude microbial DNA extracted from soil” Lett Appl Microbiol, 25(4): p 303-7 Sinh viên: Đặng Duy Đức 40 GVHD: TS Lê Văn Trường [...]... đặc điểm của thông tin qua hệ thống di truyền 16S Dựa trên số liệu về metagenomics của cộng đồng vi sinh vật có thể có thông tin của toàn bộ chức năng gen, mỗi quan hệ giữa các gen trong một nhóm vi sinh vật và giữa các nhóm vi sinh vật đều được làm sáng tỏ rõ ràng Các thí nghiệm này tập trung vào vi c xác định vai trò của các gen và các vi sinh vật trong vi c thành lập cộng đồng vi sinh vật động [9]... đáp vi sinh vật nào ở đó?”, vi sinh vật đang làm gì?” và vi sinh vật hoạt động như thế nào?” Kết quả phong phú của gene và cấu trúc phân tử được giải mã từ các vi sinh vật không thông qua nuôi cấy có tiềm năng to lớn trong sự phát triển chất xúc tác sinh học (biocatalysts) mới cho ứng dụng công nghiệp và dược phẩm Dữ liệu và siêu dữ liệu metagenome có thể được tận dụng để thiết kế các thí nghiệm thông. .. Sự ưu vi t của kĩ thuật metagenomic trong nghiên cứu quần thể vi sinh vật đất Hiện nay, chúng ta có rất ít thông tin về đại đa số các vi sinh vật hiện diện trong các môi trường khác nhau trên trái đất, chủ yếu là do chúng ta không thể nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm Người ta ước lượng được rằng, chỉ có dưới 1% vi khuẩn được nuôi cấy Trong thời gian qua, chúng ta không nuôi cấy các vi sinh vật được... được thu trực tiếp từ các cộng đồng của các vi sinh vật môi trường, do đó từng bước vượt qua sự cần thiết của vi c phân lập hay nuôi cấy Kỹ thuật này được xây dựng trên những thành công của các cuộc nghiên cứu 16S rRNA các mẫu môi trường nuôi cấy độc lập [14] Nó cung cấp những hiểu biết về lịch sử tiến hóa cũng như các khả năng chưa biết từ trước của cộng đồng vi sinh không nuôi cấy sống trong môi... 1998 Metagenomics là ngành khoa học nghiên cứu về đa hệ gen (metagenome) – nguyên liệu di truyền được thu trực tiếp từ các mẫu môi trường Metagenome còn được gọi là “hệ gen cộng đồng (community genomics) hay “hệ gen môi trường” (enviromental genomics) Kỹ thuật metagenomic là các phương pháp nghiên cứu về metagenome cho phép khai thác được tối đa các gen của vi sinh vật không nuôi cấy hoặc không có... khả năng nuôi cấy trong các quần thể sinh vật Tùy vào từng mẫu môi trường khác nhau mà số lượng vi sinh vật không nuôi cấy được dao động từ 99 đến 99,7% Nếu tất cả các gen của vi sinh vật trong mẫu môi trường được tập hợp lại sẽ là nguồn nguyên liệu vô cùng phong phú cho vi c khai thác gen, cũng như tìm hiểu cơ chế tác động giữa các vi sinh vật đảm bảo sự ổn định, phát triển chung của hệ sinh thái... kháng thuốc Sinh vi n: Đặng Duy Đức 15 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trong khoa học sự sống: Số liệu về metagenomics cung cấp thông tin về lịch sử tiến hóa cũng như các khả năng của vi sinh vật sống trong môi trường Các câu hỏi Vi sinh vật nào ở đó?”, Vi sinh vật đang làm gì?”, Vi sinh vật hoạt động như thế nào?” đều có thể được giải đáp [2, 9] Trong 20 năm qua, các nhà vi sinh vật đã nhiều... với gen pesctinase của B subtilis Bacillus là họ vi khuẩn khá phong phú trong môi trường đất, họ vi khuẩn này đã được biết đến có khả năng sinh pectinase Nhiều gene pectinase đã được cloning từ chúng Với mục đích phân lập được ít nhất một gene mã hóa pectinase từ thư vi n gen metagenom, chúng tôi sử dụng primer đặc hiệu với gene pectinase của Bacillus subtilis để phân lập gen pectinase Kết quả nhân gen. .. dòng từ DNA, ARN hoặc dựa trên cơ sở trình tự chuỗi acid amin - Tách dòng gen từ DNA Thường được sử dụng với các đối tượng là vi sinh vật nhân sơ cấu trúc của AND không tồn tại các vùng không mã hóa intron Các bước tách dòng gen từ DNA Bước 1: Chuẩn bị gen cần tách dòng (gen đích-target gen) và chọn vector tách dòng - Chuẩn bị gen tách dòng Trong phòng thí nghiệm gen đích thường được chuẩn bị từ mẫu sinh. .. lượng cao và thông lượng thấp, các thí nghiệm này tập trung vào vi c xác định vai trò của các gen và các vi sinh vật trong vi c thành lập cộng đồng vi sinh vật động 1.2.4 Tách dòng gen Tách dòng gen là tập hợp các kĩ thuật sinh học phân tử nhằm đưa gen mong muốn vào tế bào chủ tạo điều kiện cho tế bào chủ phân chia thành nhiều tế bào cùng Sinh vi n: Đặng Duy Đức 9 GVHD: TS Lê Văn Trường KHÓA LUẬN TỐT