Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp và tách kháng sinh spinosad thô từ xạ khuẩn saccharopolyspora spinosa y6

VIN I HC M H NI KHOA CễNG NGH SINH HC KHểA LUN TT NGHIP TI: La chn iu kin nuụi cy thớch hp v tỏch khỏng sinh Spinosad thụ t x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 Giỏo viờn hng dn : Th.S Nguyn Thnh Chung TS T Th Thu Thy Sinh viờn thc hin : Nguyn Th Yờn CNSH 11-01 H Ni, 2015 VIN I HC M H NI KHểA LUN TT NGHIP LI CM N Trc ht, em xin by t lũng cm n chõn thnh nht n ton th cỏc thy cụ giỏo Khoa Cụng Ngh Sinh Hc, Vin i Hc M H Ni ó trang b cho em kin thc, thit b, v húa cht nghiờn cu em cú th hon thnh khúa lun ny Em xin by t lũng bit n sõu sc ti thy giỏo ThS.Nguyn Thnh Chung - ngi ó nh hng nghiờn cu, tn tỡnh hng dn em quỏ trỡnh thc hin ti Em xin by t lũng bit n ti TS T Th Thu Thy cựng ton th cỏc thy cụ giỏo Phũng thớ nghim Sinh Hc Phõn T - Khoa Cụng Ngh Sinh Hc, Vin i Hc M H Ni, cỏc anh ch k thut viờn, cựng ton th cỏc bn Phũng thớ nghim Sinh Hc Phõn T ó tn tỡnh giỳp , hng dn, ng viờn em quỏ trỡnh thc hin ti ny Ngoi ra, em cng xin gi li cm n chõn thnh ti gia ỡnh, ngi thõn ó ng viờn em rt nhiu quỏ trỡnh thc hin ti Trong quỏ trỡnh nghiờn cu ti, mc dự bn thõn ó cú nhiu c gng, xong khụng th trỏnh c nhng sai sút, nờn em rt mong nhn c nhng gúp ý ca quý thy - cụ cng nh cỏc bn lnh vc nghiờn cu Em xin chõn thnh cm n! H Ni, ngy 20 thỏng 05 nm 2015 VIN I HC M H NI KHểA LUN TT NGHIP MC LC M U PHN I TNG QUAN TI 1.1 Tng quan v khỏng sinh 1.1.1 Lch s hỡnh thnh khỏng sinh 1.1.2 nh ngha v cht khỏng sinh 1.1.3 Phõn loi khỏng sinh 1.1.4 C ch tỏc dng ca khỏng sinh 1.2 i cng v x khun 12 1.2.1 Cỏc c im chung v vai trũ ca x khun t nhiờn 12 1.2.3 S hỡnh thnh cht khỏng sinh x khun 18 1.2.4 Cỏc yu t nh hng n kh nng sinh khỏng sinh ca x khun 19 1.2.4.1 nh hng ca ngun cacbon 19 1.2.4.2 nh ca ngun Nit 20 1.2.4.3 nh hng ca pH 20 1.2.4.4 nh hng ca nhit 20 1.2.4.5 nh hng ca yu t vi lng 20 1.3 X khun Saccharapolyspora spinosa 21 1.4 Khỏng sinh Spinosad 21 1.4.1 Cu trỳc ca Spinosad 21 1.4.2 Tớnh cht lý húa ca spinosad 22 1.4.3 Vai trũ v hot tớnh sinh hc ca Spinosad 23 1.4.4 1.5 Nhng nghiờn cu trờn th gii v Vit Nam v spinosad 23 Mc tiờu v ni dung ti 24 1.5.1 Mc tiờu ti 24 VIN I HC M H NI KHểA LUN TT NGHIP 1.5.2 Ni dung ti 24 PHN II: VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 25 2.1 Vt liu, húa cht v thit b 25 2.1.1 Vt liu 25 2.1.2 Húa chõt 25 2.1.3 Thit b 26 2.1.4 Mụi trng 27 2.2 Phng phỏp nghiờn cu 2.2.1 Phng phỏp nuụi cy vi sinh vt 29 2.2.2 Phng phỏp bo qun ging 31 2.2.3 Phng phỏp la chn mụi trng thớch hp sinh tng hp spinosad t Saccharopolyspora spinosa Y6 33 2.2.4 Phng phỏp la chn iu kin thớch hp nuụi cy x khun sinh tng hp khỏng sinh 33 2.2.5 Phng phỏp tỏch chit khỏng sinh thụ bng dung mụi hu c 35 2.2.6 Phng phỏp sc lý lp mng TLC 36 PHN III KT QU 38 3.1 Xỏc nh biu sinh trng phỏt trin, v sinh khỏng sinh ca x khun 38 3.2 La chn mụi trng lờn men sinh khỏng sinh 40 3.3 La chn iu kin thớch hp nuụi cy x khun sinh tng hp khỏng sinh 41 3.3.1 La chn nhit thớch hp 41 3.3.2 La chn pH thớch 42 3.3.3 La chn hm lng glucoz thớch hp 43 3.3.4 La chn hm lng saccaroz thớch hp 44 3.3.5 La chn hm lng cao nm men thớch hp 45 3.3.6 La chn hm lng MgCl2 thớch hp 46 3.4 Tỏch khỏng sinh Spinosad thụ bng dung mụi hu c 47 VIN I HC M H NI KHểA LUN TT NGHIP 3.4.1 La chn dung mụi tỏch khỏng sinh Spinosad t dch lờn men 47 3.4.2 La chn thi gian chuyn khỏng sinh Spinosad vo pha dung mụi 48 3.4.3 Tỏch Spinosad thụ t chng Saccharapolyspora spinosa Y6 50 3.5 Kim tra hot tớnh khỏng sinh Spinoad thụ 51 3.5.1 Kim tra hot tớnh khỏng sinh Spinosad thụ bng phng phỏp s dng khoanh giy lc 51 3.5.2 Kt qu th hot tớnh Spinosad trờn bn chy TLC 52 PHN IV: KT LUN V XUT 55 4.1 Kt lun 55 4.2 xut 55 TI LIU THAM KHO 56 VIN I HC M H NI KHểA LUN TT NGHIP DANH MC CH VIT TT Ch vit tt Chỳ thớch CKS Cht khỏng sinh VSV Vi sinh vt LB Luria Bertani l lit g gam HSCC H si c cht Gram(+) Gram dng Gram(-) Gram õm D ũng kớnh vũng khỏng khun VK Vi khun CNSH Cụng ngh sinh hc VIN I HC M H NI KHểA LUN TT NGHIP DANH MC CC BNG Bng 1.1 C ch tỏc dng ca cỏc khỏng sinh 12 Bng 1.2 Tớnh cht vt lý v húa hc ca Spinosad 22 Bng 2.1 Dng c, thit b dựng ti 26 Bng 3.1 nh hng ca nhit 42 Bng 3.2 nh hng ca pH 43 Bng 3.3 nh hng ca hm lng glucoz 44 Bng 3.4 nh hng ca hm lng saccaroz 45 Bng 3.5 nh hng ca hm lng cao nm men 46 Bng 3.6 nh hng ca hm lng khoỏng 47 Bng 3.7 Th hot tớnh khỏng sinh sau quay cụ bng khoanh giy lc 48 Bng 3.8 Th hot tớnh dch sau phõn pha bng c l thch 48 Bng 3.9 Th hot tớnh dch sau thay i thi gian phõn pha 49 Bng 3.10 Th hot tớnh khỏng sinh trờn bn chy TLC vi Bacillus subtilis 53 VIN I HC M H NI KHểA LUN TT NGHIP DANH MC CC HèNH Hỡnh 1.1 Khun lc ca x khun 15 Hỡnh 1.2 Khun ty x khun 17 Hỡnh 1.3 Bo t x khun 18 Hỡnh 1.4 Bo t x khun Saccharopolyspora spinosa 21 Hỡnh 3.1.Hỡnh thỏi x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 Hỡnh 3.2 Dch nuụi x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 38 Hỡnh 3.3: ng cong sinh trng v phỏt trin ca x khun 39 Hỡnh 3.4 Kho sỏt hot tớnh khỏng sinh ca chng x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 39 Hỡnh 3.5 Th hot tớnh khỏng sinh ca cỏc mụi trng lờn men khỏc 41 Hỡnh 3.6 Khỏng sinh thụ c hũa tan methanol 51 Hỡnh 3.7 Th hot tớnh khỏng sinh bng s dng khoanh giy lc 52 Hỡnh 3.8 Kt qu th hot tớnh khỏng sinh bng phng phỏp TLC vi chng x khun Sacharopolyspora spinosa Y6 53 M U Cụng ngh sinh hc (CNSH) l b mụn hp cỏc ngnh khoa hc v cụng ngh gm: sinh hc phõn t, di truyn hc, vi sinh vt hc, sinh húa hc, cụng ngh hc, nhm to cỏc quy trỡnh cụng ngh khai thỏc quy mụ cụng nghip cỏc hot ng sng ca vi sinh vt, t bo ng, thc vt sn xut cỏc sn phm cú giỏ tr phc v i sng, phỏt trin kinh t - xó hi v bo v mụi trng CNSH ó v ang c ng dng vo rt nhiu lnh vc nh cụng nghip, nụng nghip, y hc, dch v, du lch nhm phc v cho mi nh cu ca cuc sng nh dinh dng, gii trớ, chm súc sc khe Bng nhng kin thc sinh hc v thc vt, ng vt, nm, vi khun, nhng nh khoa hc ang c gng to nhng cõy trng, vt nuụi cú nng sut v cht lng cao, nhng loi thc phm, dc phm phc v cho vic cha bnh cho ngi Nụng nghip v cỏc sn phm ca nụng nghip cú vai trũ quan trng cung cp nng lng, dinh dng cho c th phũng tr cỏc bnh vi sinh vt (VSV) gõy nờn, ngi nụng dõn thng s dng thuc húa hc vi liu lng cao iu ny mt mt dn n hin tng khỏng thuc cỏc loi sõu bnh, mt khỏc s dn n hin tng ụ nhim mụi trng, nh hng nghiờm trng ti sc khe ngi v cỏc ng vt khỏc, lm mt cõn bng sinh thỏi Th gii v Vit Nam ang hng ti mt nn nụng nghip sch bng cỏch s dng cỏc bin phỏp sinh hc Bin phỏp s dng cỏc tỏc nhõn sinh hc thay th cỏc tỏc nhõn húa hc c xem l mt chin lc quan trng vỡ nú an ton cho ngi v cho mụi trng Mt nhng bin phỏp c thc hin ú chớnh l vic s dng cỏc VSV cú kh nng sinh khỏng sinh khỏng li sõu bnh Trong cỏc nhúm VSV cú kh nng sinh khỏng sinh thỡ x khun l nhúm c quan tõm nghiờn cu nhiu nht vỡ x khun cú kh nng sinh khỏng sinh vi t l cao Trong ú Spinosad nhn uc s quan tõm c bit ca cỏc nh khoa hc trờn th gii bi tỏc dng tiờu dit sõu bnh hiu qu, c tớnh ca Spinosad thp, thi gian Nguyn Th Yờn - 1101 phõn hy ngn nờn khụng gõy nh hng ti sc khe ngi v mụi trng Spinosad c sinh tng hp t loi x khun Saccharopolyspora spinosa Tuy nhiờn ti Vit Nam Spinosad cha c tỏch chit m phi nhp di dng sn phm thng mi t nc ngoi T lớ trờn, em tin hnh nghiờn cu, thc hin ti La chn iu kin nuụi cy thớch hp v tỏch chit khỏng sinh Spinosad thụ t x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 nhm to tin cho vic nghiờn cu v sn xut khỏng sinh spinosad Vit Nam Nguyn Th Yờn - 1101 dn ( hm lng glucose 18g/l, ng kớnh vũng khỏng khun cũn 7.5mm) iu ny cú th l do, tng hm lng glucose t trờn 10g/l giỳp kộo di pha log vỡ hm lng cht dinh dng tng, m khỏng sinh c to nhiu nht cui pha cõn bng, u pha suy vong nờn ng kớnh vũng khỏng khun gim Bng 3.3 nh hng ca hm lng glucoz Khi lng (g) Trng lng t ng kớnh vũng khỏng (g/l) khun(mm) 2g/l 25,58 12 6g/l 26,65 13,5 10 g/l 27,26 23,9 14 g/l 27,56 18 g/l 28,15 7,5 Do ú hm lng glucoz thớch hp lờn men x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 sinh khỏng sinh Spinosad l 10g/L 3.3.4 La chn hm lng saccaroz thớch hp Vi cỏc iu kin thớch hp kho sỏt trờn, nhúm nghiờn cu tip tc la chn cỏc hm lng saccaroz khỏc kho sỏt nh hng ca hm lng saccaroz mụi trng nuụi cy n kh nng sinh trng v sinh tng hp khỏng sinh Spinosad C th tin hnh nuụi cy x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 mụi trng R2YE vi lng saccaroz ln lt l 60g/L, 80g/L, 100g/L, 120g/L, 140g/L Sau 72 gi nuụi cy trờn mỏy lc 220 vũng/ phỳt tin hnh xỏc nh hot tớnh khỏng sinh bng phng phỏp c l thch ta thu c kt qu theo bng 3.4 Khi thay i hm lng saccaroz t 60g/L n 100g/L sinh ca x khun tng dn t 25.58g/L n 27,26g/L, vỡ saccaroz cng l ngun dinh dng cacbon ca x khun, tng hm lng dinh dng thỡ sinh tng Khi hm lng saccarozo tng trờn 100g/l, hm lng sinh hu nh khụng tng v cú du hiu Nguyn Th Yờn - 1101 44 gim, iu ny cú th l hm lng saccaroz tng quỏ cao thỡ mụi trng tng tớnh u trng lờn cao, bt u gõy c ch n quỏ trỡnh sinh trng ca x khun Bng 3.4 nh hng ca hm lng saccaroz Khi lng (g) Trng lng t ng kớnh vũng khỏng (g/l) khun 60 g/l 25,58 19,4 80 g/l 26,65 23,5 100 g/l 27,26 26,2 120 g/l 27,11 21,9 140 g/l 26,85 17,5 Khi hm lng saccaroz tng t 60g/l n 100g/l, ng kớnh vũng khỏng khun tng t 19,4mm n 26,2mm Tip tc tng hm lng saccaroz thỡ ng kớnh vũng khỏng khun gim T ú ta chn hm lng saccaroz thớch hp sinh spinosad l 100g/l 3.3.5 La chn hm lng cao nm men thớch hp kho sỏt hm lng cao nm men mụi trng lờn men sinh khỏng sinh Spinosad, t cỏc iu kin kho sỏt thớch hp trờn nhúm nghiờn cu tin hnh thay i hm lng cao nm men mụi trng lờn men R2YE ln lt l : 4g/l, 6g/l, 8g/l, 10g/l, 12g/l Sau 72 gi nuụi cy trờn mỏy lc 220 vũng/ phỳt xỏc nh ng kớnh vũng khỏng khun ca x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 bng phng phỏp c l thch vi VSV kim nh l Bacillus subtilis ATTCC 11778 thu c kt qu theo bng 3.5 Khi thay i hm lng cao nm men t 4g/l n 8g/l sinh ca x khun tng dn t 15,58g/l n 17,26g/l, vỡ cao nm men l ngun dinh dng nit ca x khun, tng hm lng dinh dng thỡ sinh tng Tuy nhiờn ng kớnh vũng khỏng khun ca dch lờn men li khỏc, hm lng glucose tng t 15,58g/l n 17,26g/l ng kớnh vũng khỏng khun tng dn t Nguyn Th Yờn - 1101 45 18,1mm n 29,1mm Tip tc tng hm lng cao nm men ng kớnh vũng khỏng khun gim dn ( hm lng cao nm nen 12g/l, ng kớnh vũng khỏng khun cũn 27,2mm) iu ny cú th l do, tng hm lng cao nm men t trờn 8g/l, giỳp kộo di pha log vỡ hm lng cht dinh dng tng, m khỏng sinh c to nhiu nht cui pha cõn bng, u pha suy vong nờn ng kớnh vũng khỏng khun gim Bng 3.5 nh hng ca hm lng cao nm men Khi lng (g) Trng lng t ng kớnh vũng khỏng khun (g/l) g/l 15,58 18,1 g/l 16,65 25,3 g/l 17,26 29,1 10 g/l 17,67 28,6 12 g/l 18,25 27,2 T kt qu trờn ta thy chng Saccharapolyspora spinosa Y6 lờn men mụi trng R2YE vi hm lng cao nm men l (g/l) cho hot tớnh khỏng sinh cao nht vi ng kớnh vũng khỏng khun l 29mm 3.3.6 La chn hm lng MgCl2 thớch hp Vi cỏc iu kin thớch hp kho sỏt trờn, nhúm nghiờn cu tip tc la chn cỏc hm lng MgCl2.6H2O khỏc kho sỏt nh hng ca hm lng MgCl2.6H2O mụi trng lờn men n kh nng sinh trng v sinh tng hp khỏng sinh c th l 2g/l, 4g/l, 6g/l, 8g/l, 10g/l Sau 72 gi nuụi cy trờn mỏy lc 220 vũng/ phỳt xỏc nh ng khớnh vũng vụ khun ca x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 bng phng phỏp c l thch vi VSV kim nh Bacillus subtilis c kt qu theo bng 3.6 Nguyn Th Yờn - 1101 46 Bng 3.6 nh hng ca hm lng khoỏng Khi lng (g) Trng lng t ng kớnh vũng khỏng khun (g/g) g/l 26,58 27,2 g/l 26,71 28.8 g/l 27,32 29,4 g/l 27,39 32,7 10 g/l 26,74 26.5 Khi thay i hm lng MgCl2 t 2g/l n 8g/l trng lng sinh ca x khun tng dn t 26.58g n 27.39g, ng kớnh vũng khỏng khun tng dn t 27mm n 32,7mm Tip tc tng lng MgCl2 n 10g/l sinh v vũng khỏng khun ca x khun gim dn ( hm lng MgCl2 l 10g/l ng kớnh vũng khỏng khun gim cũn 26.5mm) iu ny cú th l tng hm lng MgCl2 quỏ cao, mụi trng cú tớnh u trng cao s nh hng n kh nng thm thu, trao i cht ca t bo Do ú hm lng MgCl2 thớch hp sinh tng hp khỏng sinh Spinosad l 8g/l 3.4 Tỏch khỏng sinh Spinosad thụ bng dung mụi hu c 3.4.1 La chn dung mụi tỏch khỏng sinh Spinosad t dch lờn men kho sỏt h dung mụi tỏch khỏng sinh Spinosad t dch lờn men, tin hnh lờn men chng x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 mụi trng R2YE vi cỏc iu kin thớch hp ó c kho sỏt, sau thi gian 72h nuụi cy trờn mỏy lc 220 vũng/phỳt thu c dch nuụi cha Spinosad Tin hnh ly tõm dch nuụi sau lờn men vi tc ly tõm 5000 vũng/ phỳt 4C.Sau thi gian ly tõm 10 phỳt thu dch ni ó loi b xỏc t bo Dch ni c b sung cỏc dung mụi: butanol, chloroform v ethyl acetate vi t l 1/1 = v/v.Tin hnh lc hn hp dung mụi- dch ni trờn mỏy lc 90 Nguyn Th Yờn - 1101 47 phỳt, sau tỏch phõn pha thu c hai pha riờng bit, pha cha hn hp dung mụikhỏng sinh, pha l dch nuụi x khun Tin hnh quay cụ pha thu khỏng sinh v dung mụi thu hi.Khỏng sinh c b sung methanol gi -20C Th hot tớnh khỏng sinh thu c sau quay cụ bng phng phỏp s dng khoanh giy lc thu c kt qu nh bng 3.7 Th hot tớnh khỏng sinh dch nuụi thu c t pha bng phng phỏp c l thch thu c kt qu nh bng 3.8 Bng 3.7 Th hot tớnh khỏng sinh sau quay cụ bng khoanh giy lc Dung mụi ng kớnh vũng khỏng khun (mm) S dng S dng S dng butanol Chloroform Ethyl acetate 8,2 7,4 12,7 Bng 3.8 Th hot tớnh dch sau phõn pha bng c l thch Dung mụi ng kớnh vũng khỏng khun (mm) S dng S dng S dng Butanol Chloroform Ethyl acetate 11 10,5 7,5 Kt qu kho sỏt dung mụi tỏch chit spinosad cho thy, s dng dung mụi Butanol v Chloroform lng khỏng sinh tỏch c thp hn so vi dung mụi Ethyl acetate, dch nuụi cũn cha nhiu khỏng sinh Do ú dung mụi c s dng tỏch chit khỏng sinh Spinosad l Ethyl acetate vi ng kớnh vũng khỏng khun bng phng phỏp s dng khoanh giy lc l 12,7mm 3.4.2 La chn thi gian chuyn khỏng sinh Spinosad vo pha dung mụi kho sỏt thi gian chuyn khỏng sinh Spinosad vo pha dung mụi, tin hnh lờn men chng x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 mụi trng R2YE vi Nguyn Th Yờn - 1101 48 cỏc yu t thớch hp ó c kho sỏt Trong iu kin nhit 28C, sau thi gian 72h lc trờn mỏy lc 220 vũng/phỳt thu c dch nuụi cha Spinosad Dch nuụi sau lờn men tin hnh ly tõm 5000 vũng/ phỳt 4C, 10 phỳt Sau ly tõm thu dch ni ó loi b xỏc t bo Dch ni c b sung Ethyl acetate vi t l 1/1 = v/v.Tin hnh lc hn hp dung mụi- dch ni trờn mỏy lc 220 vũng/phỳt vi thi gian thay i 30phỳt, 60phỳt, 90phỳt, 120phỳt, 150 phỳt, thu c hai pha riờng bit, pha cha hn hp dung mụi- khỏng sinh, pha l dch nuụi x khun Tin hnh quay cụ pha thu khỏng sinh v dung mụi thu hi Khỏng sinh c b sung methanol gi -20C Th hot tớnh Spinosad thu c sau quay cụ bng phng phỏp s dng khoanh giy lc, dch nuụi sau phõn pha bng phng phỏp c l thch thu c kt qu nh bng 3.9 Bng 3.9 Th hot tớnh dch sau thay i thi gian phõn pha ng kớnh vũng Thi khỏng khun Phng phỏp c l Phng phỏp khoanh thch giy lc 30 22,2 3,1 60 13,5 6,7 90 7,5 12,6 120 4,2 19,6 150 4,1 19,8 Gian tỏch (mm) Phõn pha (phỳt) Thi gian tỏch lc pha thay i t 30 phỳt n 120 phỳt vũng khỏng khun khỏng sinh bng khoanh giy lc tng dn t 3,1mm n 19,6 mm, vũng khỏng khun ca dch nuụi bng phng phỏp c l thch gim dn t 22,2mm cũn 4,22 mm Tng thi gian lc pha lờn 150 phỳt, vũng khỏng khun th bng khoanh giy lc tng khụng ỏng k 19,8mm so vi 19,6mm, lng khỏng sinh cũn sút li dch nuụi Nguyn Th Yờn - 1101 49 sau phõn pha nhiu cng hu nh khụng gim ( 120 phỳt l 4,2mm, 150 phỳt l 4,1mm) Do ú thi gian phõn pha thớch hp tỏch khỏng sinh Spinosad l 120 phỳt 3.4.3 Tỏch Spinosad thụ t chng Saccharapolyspora spinosa Y6 Quy trỡnh thu nhn khỏng sinh Spinosad thụ t x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 Dch lờn men x khun Saccharapolyspora spinosa Y6 sau 72 gi nuụi cy 28C, 220 vũng /phỳt Ly tõm thu dch ni, loi t bo B sung dung mụi ethyl acetate (v/v=1/1) Lc u 2h Tỏch phõn pha Phn dch nuụi (loi b) Thu dch lng phõn pha Spinosad) Quay cụ chõn khụng Thu hi dung mụi Thu c khỏng sinh Spinosad thụ Hũa tan methanol Bo qun o 20 C - Dch nuụi cy x khun sau 72h c em ly tõm 6000 rpm 4oC 10 phỳt Nguyn Th Yờn - 1101 50 - Phn dch sau ly tõm s c b sung ethyl acetate vi t l 1:1 v th tớch - Hn hp dch nuụi v dung mụi c lc vi tc 200 vũng/phỳt nhit phũng t gi - Tin hnh phõn pha thu hn hp dung mụi khỏng sinh Sau ú, dch ny c em quay cụ chõn khụng 4oC, 126 mbar thu khỏng sinh thụ Khỏng sinh thụ sau quay cụ s c hũa tan methanol v bo qun nhit -20C Sau quỏ trỡnh thớ nghim, thc hin ti, tỏch c khỏng sinhSpinosad thụ hũa tan methanol nh hỡnh 3.6 Hỡnh 3.6 Khỏng sinh thụ c hũa tan methanol 3.5 Kim tra hot tớnh khỏng sinh Spinoad thụ 3.5.1 Kim tra hot tớnh khỏng sinh Spinosad thụ bng phng phỏp s dng khoanh giy lc Chng x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 c lờn men mụi trng R2YE trờn mỏy lc 200 vũng/phỳt Sau 72 gi lờn men, tin hnh ly tõm dch lờn men Nguyn Th Yờn - 1101 51 thu dch ni Dch ni ca chng x khun s c tỏch chit vi ethyl acetate theo t l v/v = 1/1 v quay cụ chõn khụng thu khỏng sinh thụ Tin hnh kim tra hot tớnh khỏng sinh Spinosad thụ thu c sau quay cụ bng phng phỏp s dng khoanh giy lc vi vi sinh vt kim nh Bacillus subtitis thu c kt qu nh hỡnh 3.7 A B A: Methanol B: khỏng sinh Spinosad ng kớnh vũng khỏng khun D= 19mm Hỡnh 3.7 Th hot tớnh khỏng sinh bng s dng khoanh giy lc Sau 16 gi th hot tớnh khỏng sinh bng phng phỏp s dng khoanh giy lc thu c vũng khỏng khun ca Spinosad l 19,6mm 3.5.2 Kt qu th hot tớnh Spinosad trờn bn chy TLC Ngoi phng phỏp khoanh giy lc, nhúm nghiờn cu cũn s dng phng phỏp sc ký bn mng TLC kim tra hot tớnh khỏng sinh ca chng x khun Tin hnh ly 30 àl cht khỏng sinh mu x khun ban u chm lờn bn mng silicagel GF thnh chm nh cú ng kớnh ữ mm Mu sau khụ c trin khai bn mng h dung mụi Chloroform : Methanol vi t l 9:1, ti h dung mụi Nguyn Th Yờn - 1101 52 chy cỏch mộp trờn ca bn mng khong 0.5 ữ 1cm thỡ nhc bn mng Chiu ốn UV xỏc nh khỏng sinh spinosad trờn bn TLC Tip ú bn mng c khụ t nhiờn v t vo cỏc a petri vụ trựng Tin hnh mụi trng LB c ó cú sn chng Bacillus subtilis ATCC 11778 lờn a petri Kt qu chy TLC thu c hỡnh 3.8 Bng 3.10 Th hot tớnh khỏng sinh trờn bn chy TLC vi Bacillus subtilis Khong cỏch di chuyn ca dung Mu Saccharopolyspora sapinosa Y6 mụi ( ) 3.5 (cm) Khong cỏch m cht phõn tớch di chuyn c ( ) Giỏ tr Rf 1.8 (cm) 0.51(cm) n v: cm b a Hỡnh 3.8 Kt qu th hot tớnh khỏng sinh bng phng phỏp TLC vi chng x khun Sacharopolyspora spinosa Y6 Nguyn Th Yờn - 1101 53 Kt qu chy TLC nhn c vch sỏng rừ nột cú giỏ tr Rf= 0.51 Kt qu ny phự hp vi kt qu ca cỏc nghiờn cu khỏc trờn th gii ng thi vũng khỏng khun trờn bn TLC xut hin ỳng v trớ vch sỏng quan sỏt c soi UV, chng t vch sỏng ny chớnh l khỏng sinh T õy, ta cú th kt lun ó tỏch thnh cụng khỏng sinh Spinosad thụ t x khun Saccharopolysporaspinosa Y6 Nguyn Th Yờn - 1101 54 PHN IV: KT LUN V XUT 4.1 Kt lun Sau thi gian nghiờn cu nhúm ó thc hin c mc tiờu ti v thu c nhng kt qu sau: ó la chn c mụi trng lờn men thớch hp sinh tng hp khỏng sinh Spinosad t x khun Saccharapolyspora spinosa Y6 l mụi trng R2YE ó la chn c cỏc yu t thớch hp cho mụi trng lờn men thớch hp sinh lờn men sinh tng hp khỏng sinh Spinosad t x khun Saccharapolyspora spinosa Y6 Nhit lờn men thớch hp l 28C pH cho mụi trng lờn men thớch hp l pH= Lng Cacbon thớch hp t ngun glucose l 10g/L Lng Cacbon thớch hp t ngun saccaroz l 100g/l Lng Nito thớch hp t ngun cao nm men l 8g/l Lng khoỏng MgCl2.6H2O l 8g/l La chn c dung mụi tỏch chit spinosad l Ethyl acetate La chn c thi gian chuyn spinosad vo pha dung mụi l 120 phỳt ó tỏch c khỏng sinh Spinosad thụ t dch lờn men ca x khun Saccharapolyspora spinosa Y6 4.2 xut Tỡm iu kin nuụi cy ti u sinh tng hp khỏng sinh Spinosad t x khun Saccharopolyspora spinosa Y6 Tinh sch khỏng sinh Spinosad Nguyn Th Yờn - 1101 55 TI LIU THAM KHO Ti liu ting Vit Cao Vn Thu, (2000), bi ging khỏng sinh v vitamin PGS.TS Kiu Hu nh, giỏo trỡnh vi sinh vt hc (tp 2) (tr 12 19) Thu H (2004), Nghiờn cu x khun sinh cht khỏng sinh chng nm phõn lp t t Qung Nam Nng, Lun ỏn tin s sinh hc, H Ni Nguyn Lõn Dng, Phm Th Trõn Chõu (1978), Mt s phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc Tp III NXB khoa hc v k thut, H Ni Bựi Th H (2008), Nghiờn cu x khun thuc chi Streptomyces sinh khỏng sinh chng nm gõy bnh trờn cõy chố Thỏi Nguyờn, Lun Thc s sinh hc, Trng i hc s phm Thỏi Nguyờn Vi Th oan Chớnh, Tuyn chn v nghiờn cu x khun cú kh nng i khỏng vi mt s chng vi khun gõy nhim trựng bnh vin, Bỏo cỏo tng kt ti khoa hc v cụng ngh cp B Mó s B2009 TN07 02 Nguyn Lõn Dng (1993), Thc vi sinh vt hc NXB i hc v Trung hc chuyờn nghip, H Ni Ti liu ting anh 8.Genome Sequence of the Spinosyns-Producing Bacterium Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395 Yuanlong Pan,1,2 Xi Yang,1,2 Jing Li,1 Ruifen Zhang,1 Yongfei Hu,1 Yuguang Zhou,3 Jun Wang,4 and Baoli Zhu1,* Cloning and analysis of the spinosad biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora spinosa1 10 Invitro Characterization of the Enzymes Involved in TDP-d-Forosamine Biosynthesis in the Spinosyn Pathway ofSaccharopolyspora spinosa Lin Hong, Zongbao Zhao, Charles E Melanỗon, III, Hua Zhang, Hung-wen Liu Nguyn Th Yờn - 1101 56 J Am Chem Soc Author manuscript; available in PMC 2010 January 29 11.Studies on the mode of action of Spinosad: The Internal effective concentration and the concentration dependence of neural excitation Vincen L Salgado, Joel J Sheets, Gerald B Watson, and Arthur L Schmidt Dow AgroSciences LLC, 9330 Zionsville Road, Indianapolis, Indiana 46268 12 Development of Spinosad and Attributes of A New Class of Insect Control Products 13 Environmental Fate of Spinosad Dissipation and Degradation in Aqueous Systems Cheryl B Cleveland ,* Gary A Bormett , Donald G Saunders , Fred L Powers ,Đ Alec S McGibbon , Graham L Reeves ,# Laura Rutherford , and Jesse L Balcer Global Regulatory Laboratories, Dow AgroSciences, 9330 Zionsville Road, Indianapolis, Indiana 46268-1054, and Dow AgroSciences, Letcombe Regis, Wantage, Oxon OX129JT, England 14 Expression of Xenobiotic Metabolizing Cytochrome P450 Genes in a SpinosadResistant Musca domestica L Strain Dorte H Hojland, Karl-Martin Vagn Jensen, Michael Kristensen 15 Differential proteomic profiling reveals regulatory proteins and novel links between primary metabolism and spinosad production in Saccharopolyspora spinosa Qi Yang,1 Xuezhi Ding, Xuemei Liu,1 Shuang Liu,1 Yunjun Yu,1 Shengbiao Hu,1 Jie Rang,1 Hao He,1Lian He,1 and Liqiu Xia Sun,1 Ziquan 16 Expression of Xenobiotic Metabolizing Cytochrome P450 Genes in a SpinosadResistant Musca domestica L Strain Dorte H Hứjland, Karl-Martin Vagn Jensen, and Michael Kristensen* John Vontas, Editor 17 Evaluation of spinosad for the oral treatment and control of flea infestations on cats in Europe Nguyn Th Yờn - 1101 57 18 Metabolic Engineering of Rational Screened Saccharopolyspora spinosa for the Enhancement of Spinosyns A and D Production Amit Kumar Jha, Anaya Raj Pokhrel, Amit Kumar Chaudhary, Seong-Whan Park,1 Wan Je Cho,1 and Jae Kyung Sohng* 19 Characterization of SpnQ from the Spinosyn Biosynthetic Pathway ofSaccharopolyspora spinosa: Mechanistic and Evolutionary Implications for C-3 Deoxygenation in Deoxysugar Biosynthesis Lin Hong, Zongbao Zhao,# and Hung-wen Liu 20 Suitable extracellular oxidoreduction potential inhibit rex regulation and effect central carbon and energy metabolism in Saccharopolyspora spinosa Xiangmei Zhang, Chaoyou Xue, Fanglong Zhao, Dashuai Li, Jing Yin, Chuanbo Zhang, Qinggele Caiyin, and Wenyu Lu 21 The Biosynthesis of Spinosyn in Saccharopolyspora spinosa: Synthesis of the Cross-Bridging Precursor and Identification of the Function of SpnJ Hak Joong Kim, Rongson Pongdee, Qingquan Wu, Lin Hong, and Hung-wen Liu 22 The Biosynthesis of Spinosyn in Saccharopolyspora spinosa: Synthesis of Permethylated Rhamnose and Characterization of the Functions of SpnH, SpnI, and SpnK Hak Joong Kim, Jess A White-Phillip, Yasushi Ogasawara, Nara Shin, Eta A Isiorho, and Hung-wen Liu* 23 Four-stage dissolved oxygen strategy based on multi-scale analysis for improving spinosad yield by Saccharopolyspora spinosa ATCC49460 Yun Bai,1,2 Peng-Peng Zhou,1,2 Pei Fan,1,2 Yuan-Min Zhu,1,2 Yao Tong,1,2 Hong-bo Wang,1,2 and Long-Jiang Yu1,2,* Nguyn Th Yờn - 1101 58 [...]... và nội dung đề tài 1.5.1 Mục tiêu đề tài Tìm điều kiện thích hợp sinh tổng hợp kháng sinh Spinosad từ xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa Y6 Tách chiết thành công kháng sinh Spinosad thô từ xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa Y6 1.5.2 Nội dung đề tài Lựa chọn môi trường lên men thích hợp sinh tổng hợp kháng sinh spinosad từ xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa Y6 Lựa chọn điều kiện thích hợp nuôi cấy xạ. .. điều kiện thích hợp nuôi cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp kháng sinh Spinosad từ xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa Y6 Tách chiết kháng sinh thô bằng dung môi Nguyễn Thị Yên - 1101 24 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1 Vật liệu Chủng xạ khuẩn: Xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa Y6 cung cấp bởi Đại học Sun MoonHàn Quốc Chủng vi sinh vật kiểm định: Chủng Bacillus... 1.1µm ÷ 1.5µm Xạ khuẩn Sacharapolyspora spinosa sinh sản vô tính bằng bào tử Có khả năng sinh trưởng, phát triển và tạo kháng sinh tốt nhất trong môi trường R2YE Trong dải nhiệt độ từ 28 ÷ 30˚C và pH từ 6,5 ÷ 7,2 1.4 Kháng sinh Spinosad 1.4.1 Cấu trúc của Spinosad Spinosad thuộc nhóm kháng sinh macrolide, là sản phẩm trao đổi chất bậc 2 của chủng xạ khuẩn Saccharapolyspora spinosa Y6, được tách chiết... nguồn gốc từ xạ khuẩn Một trong những tính chất của các chất kháng sinh có nguồn gốc từ VSV nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc Mỗi chất kháng sinh chỉ có tác dụng với một nhóm VSV nhất định Hầu hết chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn Nguyễn Thị Yên - 1101 18 đều có phổ kháng khuẩn rộng Khả năng kháng khuẩn của các chất kháng sinh là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn. .. lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp chất kháng sinh của nhiều chủng xạ khuẩn Nguyễn Thị Yên - 1101 20 1.3 Xạ khuẩn Saccharapolyspora spinosa Hình 1.4 Bào tử xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa Xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa Y6 thuộc họ Saccharopolyspora được phân lập lần đầu tiên vào năm 1983 trên đảo Virgin Loài Saccharapolyspora spinosa là xạ khuẩn duy nhất có khả năng sinh. .. tìm ra vào năm 1944 bởi sự nuôi cấy nấm Streptomycesgriseu Đến này với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học và hóa được con người đã biết được hơn 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn , 150 kháng sinh được dùng trong y khoa và thú y 1.1.2 Định nghĩa về chất kháng sinh Năm 1942 Tiến Sĩ Selman A.Waksman đưa ra đinh nghĩa đầu tiên về kháng sinh: Kháng sinh. .. không thích hợp cho sự sinh tổng hợp chất kháng sinh của nhiều chủng xạ khuẩn 1.2.4.3 Ảnh hưởng của pH Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzyme và tác động gián tiếp qua môi trường pH thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp. .. xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh, còn có các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và cofactor 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn 1.2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và. .. phân chia cơ chế tác dụng của kháng sinh theo các nhóm kháng sinh như bảng 1.1 Bảng 1.1 Cơ chế tác dụng của các kháng sinh Nơi tác dụng Kháng sinh Thành tế bào Bacitracin Tổng hợp mucopeptid Diệt khuẩn Các cephalosporin Thành tế bào Kháng khuẩn Các penicillin Thành tế bào Kháng khuẩn Cycloserin Tổng hợp peptid của thành tế bào Kháng khuẩn Vancomycin Tổng hợp mucopeptid Kháng khuẩn Amphotericin B Chức năng... gồm các kháng sinh có tác dụng với vi Nguyễn Thị Yên - 1101 5 khuẩn Gram (-) như: Baxitraxin, Heliomycin; tác dụng với vi khuẩn Gram (-) như: Neomycin, Polymycin - Nhóm kháng sinh chống lao: Rifamycin - Nhóm kháng sinh chống nấm như: Nystatin, Grycefulvin, Ampoterytin-B Dựa vào nguồn gốc - Kháng sinh có nguồn gốc từ sinh vật, xạ khuẩn - Nhóm kháng sinh có nguồn gốc hóa dược hay do con người tổng hợp lên