xây dựng phương án tách dòng gen mã hoá interferon alpha 2b từ gà gallus gallus

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DỊNG GEN MÃ HỐ INTERFERON ALPHA 2b TỪ GÀ GALLUS GALLUS TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA 2b XÁC ĐỊNH GEN ĐÍCH XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DỊNG GEN VÀ BIỂU HIỆN TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA Cấu trúc không gian interferon alpha TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA • Khái quát chung:  Interferon là nhóm các protein tự nhiên sản xuất tế bào của hệ miễn dịch ở hầu hết các động vật nhằm chống lại tác nhân ngoại lai như virus, vi khuẩn  vàTB ung thư Interferon đóng vai trị quan trọng cửa ngõ miễn dịch, hàng rào bảo vệ thể chống lại virus phát triển bất thường tế bào  Kích thước 165 aa, với trọng lượng khoảng 19,2 kDa Là gen khơng có intron với chiều dài gen 498 bp TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA • Chức năng:  Kích thích tế bào chưa bị nhiễm virus đề kháng với virus thông qua chế hoạt hóa gene làm hạn chế tổng hợp các mRNA và hạn chế tổng hợp protein virus  Các cytokin này kích thích hầu hết tế bào thể tăng biểu phức hợp hòa hợp tổ chức lớp I (MHC I) nhờ tế bào đề kháng với tác dụng tế bào NK Mặt khác, IFN-α IFN-β kích thích tế bào nhiễm virus tăng biểu (MHC I) dễ bị tiêu diệt tế bào CD8 độc tế bào  Những phân tử có khả hoạt hóa tế bào NK, nhờ hoạt hóa mà tế bào giết tự nhiên (khơng phân biệt đối tượng) hoạt động có chọn lọc hơn, nghĩa tiêu diệt tế bào nhiễm virus CÁC BƯỚC TÁCH DÒNG GEN Xác định gen đích tách RNA tổng số Lựa chọn vecto tách dòng Tạo vecto tách dòng tái tổ hợp Biến nạp vào TB chủ Lựa chọn chủng tái tổ hợp TẠO GEN ĐÍCH • Truy cập vào trang NCBI để xác định gen đích cần tách: từ lồi gà có tên Gallus gallus (lấy từ loài giồng khác thời gian lấy mẫu) • Truy cập trang Clustal Omega so sánh tương đồng loài gà thời điểm khác để tìm vùng bảo thủ • Tạo mồi ảo • Chạy PCR test • Chạy Blast tìm tính trạng tương đồng •Truy cập NCBI, đánh tìm kiếm mục Nucleotide tìm interferon alpha Gallus Gallus •Hiện hàng loạt kết quả, lấy chủng Gallus Gallus với thời gian lấy mẫu khác •Truy cập Clustal Omega tìm vùng bảo thủ từ nu 1582 •Thiết kế mồi cho lồi mã AB021153.1 Thiết kế mồi ảo chương trình Primer Blast Chạy mồi xuôi mồi ngược, sản phẩm PCR dự kiến có 501bp với mồi Primer pair Lý chọn mồi số mồi có tỷ lệ GC cao kích thước sản phẩm PCR tạo thành phù hợp với việc tạo interferon alpha 2b Chạy PCR Test Sản phẩm PCR ảo, có kích thước 501 bp → phù hợp với kết dự đoán chạy Primer Chạy Blast Kết chạy Blast: Total score = max score: có vùng bảo thủ E value: nhỏ nên khác biệt không lớn Per Ident: 100%, nghĩa tương đồng 100% tính trạng Sự tương đồng lồi: Khi ấn vào dịng bắt cặp mồi loài tương ứng tương đồng cặp nu, dựa vào quy định màu sắc Dự đốn tính chất Sự bắt cặp mồi: Mồi xi tạo sản phẩm kích thước 501 bp, bắt cặp 100% → Mồi ảo tương thích 100% PHƯƠNG ÁN TÁCH DỊNG GEN VẬT LIỆU • Gen mã hố Interferon α tách từ gà • Vecto tách dịng: plasmid PJET1.2 • Vecto biểu hiện: Plasmid pPIC9K dùng cho chủng nấm men Pichia pastoris GS115 • Chủng nấm men Pichia pastoris GS115 TIẾN HÀNH TÁCH DỊNG GEN • B1: Tách RNA tổng số khuếch đại gen PCR  Tách RNA tổng số từ lách gà  cDNA sau tổng hợp sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại gen mã hoá interferon alpha với cặp mồi đặc hiệu  Sản phẩm PCR thu đoạn gen 501 bp kiểm tra gel agarose tinh TIẾN HÀNH TÁCH DỊNG GEN • B2: Gắn vào vecto tách dòng  Sử dụng vecto tách dòng plasmid PJET1.2  Sản phẩm PCR nhân gen vector tách dòng pBluescript cắt đồng thời hai enzyme đặc hiệu là: NotI EcoRI (10U/μL)  - Sản phẩm cắt sau tinh ghép nối enzyme T4 ligase  Sản phẩm ghép nối sau biến nạp vào tế bào ckhả biến theo phương pháp điện biến nạp 2,5 kV 5ms  Ni MT thạch YPD có G418 cấy chuyền vào MT thạch MM, ủ 16 28oC TIẾN HÀNH TÁCH DỊNG GEN • B3: Lựa chọn chủng tái tổ hợp  Nuôi MT thạch sau chọn lọc phương pháp ủ màu  Tế bào tái tổ hợp nuôi tăng sinh, tách plasmid để kiểm tra đoạn chèn enzyme cắt hạn chế giải trình tự gen  Trình tự gen sau kiểm tra cách so sánh với trình tự gen gốc ngân hàng gen NCBI cơng cụ BLAST BIỂU HIỆN GEN • Vector biểu pPIC9K sử dụng để chuyển gen vào động vật (gà) • Vector pPIC9K cắt đồng thời enzyme đặc hiệu sau ghép nối enzyme T4 DNA ligase • Sản phẩm ghép nối chuyển vào tế bào pPIC9K nuôi cấy môi trường thạch YPD • Để chuyển vào động vật, plasmid tái tổ hợp chuyển vào tế bào vi khuẩn, sau ni động vật với điều kiện thích hợp để biểu tính trạng ngồi TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình Tin sinh học, Nguyễn Văn Cách Luận văn Tạo dịng biểu gen mã hố Interferon alpha 2b người hệ thống pichia pastoris ...XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DỊNG GEN MÃ HỐ INTERFERON ALPHA 2b TỪ GÀ GALLUS GALLUS TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA 2b XÁC ĐỊNH GEN ĐÍCH XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN VÀ BIỂU HIỆN TỔNG QUAN VỀ INTERFERON. .. TIẾN HÀNH TÁCH DỊNG GEN • B1: Tách RNA tổng số khuếch đại gen PCR  Tách RNA tổng số từ lách gà  cDNA sau tổng hợp sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại gen mã hoá interferon alpha với... kích thước 501 bp, bắt cặp 100% → Mồi ảo tương thích 100% PHƯƠNG ÁN TÁCH DỊNG GEN VẬT LIỆU • Gen mã hố Interferon α tách từ gà • Vecto tách dịng: plasmid PJET1.2 • Vecto biểu hiện: Plasmid pPIC9K