xây dựng phương án tách dòng gen gmexp1 chịu hạn từ cây đậu tương

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN GmEXP1 CHỊU HẠN TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG TỔNG QUAN VỀ GmEXP1 XÁC ĐỊNH GEN ĐÍCH XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN VÀ BIỂU HIỆN TỔNG QUAN VỀ GmEXP1  Expansin có vai trị quan trọng pha giãn thành tế bào miền sinh trưởng hệ rễ đậu tương  Hai vùng chức (DPBB Pollen allerg) xác định cho protein expansin có khả tác động phá vỡ liên kết phi hoá trị polysaccharide với vi sợi cellulose giúp thành tế bào dễ dàng giãn nở (cả chiều ngang chiều dọc) tác động sức trương nước  Hoạt động gen GmEXP1 (xác định protein expansin) liên quan đến kéo dài rễ đậu tương, làm tăng cường khả chịu hạn đậu tương TỔNG QUAN VỀ GmEXP1  Sản phẩm phiên mã gen GmEXP1 có nhiều tế bào biểu bì lớp tế bào miền sinh trưởng rễ cọc rễ bên, vùng trưởng thành Qua thấy vai trị quan trọng expansin việc phát triển kéo dài hệ rễ đậu tương  Expansin chia thành ba phân họ α, β γexpansin dựa mối quan hệ nguồn gốc chúng  Gen expansin (EXP1) từ mARN đậu tương với kích thước 1089bp CÁC BƯỚC TÁCH DỊNG GEN Xác định gen đích tách RNA tổng số Lựa chọn vecto tách dòng Biến nạp vào TB chủ Tạo vecto tách dòng tái tổ hợp Lựa chọn chủng tái tổ hợp TẠO GEN ĐÍCH  Truy cập vào trang NCBI để xác định đoạn gen cần tách: từ đậu tương  Truy cập trang Clustal Omega so sánh tương đồng gen GmEXP1 để tìm vùng bảo thủ  Tạo mồi ảo  Chạy PCR test  Chạy Blast tìm tính trạng tương đồng Truy cập trang web NCBI/ Nucleotide/  Nhập từ khóa GmEXP1 Link NCBI:  https://www.ncbi.nlm.nih.go v/ •Truy cập NCBI, đánh tìm kiếm mục Nucleotide tìm GmEXP1 =>Hiện hàng loạt kết   Tìm vùng bảo thủ Tìm bài báo liên quan (ít nhất là  3 bài)  Copy đoạn gen bằng ngơn ngữ F ASTA vào chương  trình Clustal Omega Link:  https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/ KẾT LUẬN: Sản phẩm thu qua thực chương trình PCR có khả biểu tính trạng gen GmEXP1 Kết thu mang tính tham khảo ban đầu mượn thêm trình tự để tìm vùng bào thủ, để có kết luận xác ta cần tiến hành tìm hiểu để đưa khn ảo tốt hơn, so sánh với nhiều trình tự nhiều báo khác PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN Đặt vấn đề: Đậu tương trồng tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc nhóm chịu hạn Sự biến đổi khí hậu, tình trạng hạn hán xảy liên tục kéo dài khó khăn lớn cho sản xuất đậu tương nhiều địa phương, đặc biệt nơi có địa hình đất canh tác dốc, địi hỏi phải cải thiện tính di truyền thích nghi với hạn hán để tạo giống suất cao ổn định phù hợp với vùng miền Vì vậy, cơng tác tuyển chọn giống đậu tương có kiểu gen chịu hạn ngày quan tâm nghiên cứu VẬT LIỆU *Giống đậu tương địa phương Sơn La (SL1) có hệ rễ phát triển tốt sử dụng làm vật liệu phân lập gen GmEXP1 (Gen GmEXP1 phân lập từ miền sinh trưởng rễ đậu tương) * Vector pRTRA 7/3, vector pCB301 *Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 TIẾN HÀNH TÁCH DÒNG GEN  B1: Tách RNA tổng số khuếch đại gen PCR Tách RNA tổng số từ miền sinh trưởng rễ đậu tương Trizol Reagent KIT  cDNA sau tổng hợp sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại gen mã hoá GmEXP1 với cặp mồi đặc hiệu cDNA tổng hợp theo quy trình Maxima® First Strand cDNA Synthesis KIT Gen GmEXP1 khuếch đại kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo chu kỳ nhiệt: 940C/4 phút (940C/45 giây - 560C/30 giây - 720C/60 giây)30 - 720C/10 phút  Sản phẩm PCR thu đoạn gen 606 bp Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 0.8%; gel theo Gene JETTM Gel Extraction KIT; gắn gen đích vào vector T4 ligase;  Bước : Tạo vecto tách dòng tái tổ hợp biến nạp  Lựa chọn vecto tách dòng pBT  Sản phẩm gel gen gắn vào vector tách dòng pBT_2705bp biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α để nhân dòng gen phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen  Tạo cấu trúc gen đích Cắt gen đích từ vector tách dịng pBT Gen GmEXP1 từ vector tách dòng pBT cắt hai loại enzyme hạn chế NotI NcoI cho hai phân đoạn DNA có kích cỡ khoảng 0.77 kb 2.7kb Trong đó, phân đoạn DNA 0.77kb đoạn gen đích (GmEXP1) cần thu nhận Việc sử dụng cặp enzyme hạn chế đảm bảo cho gen đích gắn thuận chiều với promoter vector tái tổ hợp Điện di sản phẩm cắt hạn chế gel agrose, băng có kích thước khoảng 0.77kb gel để thu nhận gen GmEXP1 phục vụ cho thiết kế vector tái tổ hợp Cắt mở vòng vector pRTRA 7/3 Vector pRTRA 7/3 chứa đoạn tín hiệu cần thiết cho việc biểu kiểm tra gen đích (GmEXP1) tế bào thực vật gồm: promoter CaMV35S khởi động phiên mã tất tế bào mơ thể thực vật; trình tự oligonucleotide xác định chuỗi peptide c-myc để phục vụ phản ứng western blot; đoạn KDEL polyA ổn định cấu trúc phân tử mRNA tạo tế bào Sử dụng cặp enzyme NcoI NotI cắt vector pRTRA 7/3 thu hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 0.9kb 3.3kb Trong phân đoạn 3.3kb đoạn mang trình tự cần thu nhận để thiết kế  Gắn gen GmEXP1 vào vector mở vòng pRTRA 7/3 Sản phẩm gel Gen GmEXP1 gắn vào vector pRTRA 7/3 mở vòng nhờ phản ứng ligation xúc tác enzyme T4 ligase tạo cấu trúc vector tái tổ hợp mang gen chuyển  Vector tái tổ hợp biến nạp sốc nhiệt vào tế bào khả biến E.coli DH5α để nhân dòng gen môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicilin Năm khuẩn lạc chọn đưa vào môi trường nuôi cấy LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicilin để thu sinh khối, tách plasmid  Thực phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SoyEXP1F/SoyEXP1R để kiểm tra có mặt gen GmEXP1 plasmid dòng vi khuẩn  Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào vector pCB301  Thu nhận cấu trúc mang gen GmEXP1 Sử dụng enzyme cắt hạn chế HindIII xử lý vector tái tổ hợp pRTRA_GmEXP1 thu hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 1.6kb 2.3kb  Trong phân đoạn 1.6kb cấu trúc chứa gen đích (GmEXP1) cần thu nhận gồm: CaMV35S_GmEXP1_c-myc_KDEL_polyA  Điện di sản phẩm cắt hạn chế gel agrose thu hai băng tính tốn lý thuyết Băng có kích thước khoảng 1.6kb thơi gel để thu nhận cassette chứa gen GmEXP1 phục vụ cho việc thiết kế vector tái tổ hợp  Cắt mở vòng vector chuyển gen pCB301 Sử dụng enzyme HindIII xử lý vector chuyển gen pCB301 nhận hai phân đoạn DNA với kích thước 5.502bp 60bp, phân đoạn thứ phân đoạn đích cần thu nhận gel để thiết kế vector tái tổ hợp  Tạo vector tái tổ hợp mang cấu trúc mang gen đích Sử dụng T4 ligase để gắn cấu trúc có trình tự CaMV35S_GmEXP1_c-myc_KDEL_polyA vào plasmid pCB301 mở vòng  Do hai cấu trúc xử lý loại enzyme giới hạn (HindIII) tạo đầu dính giống nên việc gắn đoạn nạp vào vector mở vịng xảy hai khả gắn xuôi gắn ngược Tuy nhiên, hai cấu trúc xuôi ngược, gen GmEXP1 khởi động phiên mã CaMV35S có khả tạo sản phẩm phiên mã mang theo sau trình tự cmyc_KDEL_polyA  Vector tái tổ hợp biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến E.coli DH5α sốc nhiệt để nhân dòng Vi khuẩn sau biến nạp nuôi môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin Thực PCRcolony khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu Biến nạp vector tái tổ hợp mang gen chuyển vào grobacterium tumefaciens CV58 Cấu trúc vector thiết kế biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens CV58 kỹ thuật điện xung Vi khuẩn A.tumefaciens sau biến nạp nuôi cấy môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin Lựa chọn khuẩn lạc tốt, phát triển đồng chuyển sang môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin nuôi cấy để thu sinh khối, tách plasmid Tiến hành kiểm tra có mặt gen GmEXP1 plasmid dòng vi khuẩn tương ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu  B3: Lựa chọn chủng tái tổ hợp  Nuôi MT thạch sau chọn lọc phương pháp ủ màu  Tế bào tái tổ hợp nuôi tăng sinh, tách plasmid để kiểm tra đoạn chèn enzyme cắt hạn chế giải trình tự gen  Trình tự gen sau kiểm tra cách so sánh với trình tự gen gốc ngân hàng gen NCBI công cụ BLAST TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Giáo trình Tin sinh học, Nguyễn Văn Cách 2 https://www.google.com.vn/search?tbm=is ch&q=Vector%20pRTRA%207%2F3%2C%20vector% 20pCB301#imgrc=qrtRjuQbc1htdM ...XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN GmEXP1 CHỊU HẠN TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG TỔNG QUAN VỀ GmEXP1 XÁC ĐỊNH GEN ĐÍCH XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DỊNG GEN VÀ BIỂU HIỆN TỔNG QUAN VỀ GmEXP1  Expansin... DH5α để nhân dòng gen phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen  Tạo cấu trúc gen đích Cắt gen đích từ vector tách dịng pBT Gen GmEXP1 từ vector tách dòng pBT cắt hai loại enzyme hạn chế NotI NcoI... chọn giống đậu tương có kiểu gen chịu hạn ngày quan tâm nghiên cứu VẬT LIỆU *Giống đậu tương địa phương Sơn La (SL1) có hệ rễ phát triển tốt sử dụng làm vật liệu phân lập gen GmEXP1 (Gen GmEXP1