Xây dựng phương pháp tách một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH HẢI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH HẢI MÃ SINH VIÊN: 1401175 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà Th.S Vũ Ngân Bình Nơi thực Bộ mơn Hóa phân tích – độc chất HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu đến từ thầy cơ, bạn bè gia đình Khi khóa luận hồn thiện, tơi xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến họ Đầu tiên, với tất lòng biết ơn kính trọng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, Th.S Vũ Ngân Bình – Giảng viên mơn Hóa phân tích độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình để giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu, thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Nguyễn Lâm Hồng, Th.S Ngô Minh Thúy, Th.S Nguyễn Thị Thùy Linh thầy cô, anh/chị kĩ thuật viên Bộ mơn Hóa phân tích độc chất, Bộ mơn Vật lý – hóa lý giúp đỡ, bảo tận tình đạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng ban, thầy tập thể cán công nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – người đào tạo giúp đỡ suốt năm học tập sinh hoạt trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln bên cạnh, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sính viên Lê Đình Hải MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẺ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Các acid amin 1.2 Sơ lược sắc ký lỏng tương tác thân nước 1.2.1 Cơ chế tách sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) 1.2.2 Pha tĩnh 1.2.3 Pha động 1.2.4 Ưu điểm phương pháp HILIC 1.3 Xác định pH pha động HILIC 1.4 Sơ lược phương pháp phân tích acid amin có 10 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Nguyên vật liệu 14 2.2.1 Hóa chất 14 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 14 2.2.4 Chuẩn bị dung dịch làm việc 15 2.3 Nội dung nghiên cứu 17 2.3.1 Khảo sát thay đổi pH dung dịch theo tỉ lệ acetonitril 17 2.3.2 Khảo sát thời gian lưu acid amin số pha động pha tĩnh khác 17 2.3.3 Xây dựng thẩm định phương pháp tách đồng thời số acid amin HILIC 17 2.4 Phương pháp thực nghiệm 17 2.4.1 Khảo sát thay đổi pH dung dịch theo tỉ lệ acetonitril 17 2.4.2 Khảo sát thời gian lưu acid amin số pha tĩnh pha động khác 19 2.4.3 Xây dựng thẩm định phương pháp tách đồng thời số acid amin HILIC 20 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Khảo sát thay đổi pH dung dịch theo tỉ lệ acetonitril 23 3.1.1 Khảo sát thay đổi pH dung dịch acid thay đổi tỉ lệ acetonitril 23 3.1.2 Khảo sát thay đổi pH dung dịch đệm/muối nồng độ pha loãng acetonitril 25 3.2 Khảo sát thời gian lưu acid amin số pha tĩnh pha động khác 26 3.2.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu 26 3.2.2 Kết khảo sát thời gian lưu acid amin pha tĩnh Zorbax NH2 (150x4,6mm, 5μm) với pha động khác 27 3.2.3 Kết khảo sát thời gian lưu acid amin pha tĩnh Zorbax RX-Sil (150 x 4,6 mm, µm) với pha động khác 28 3.2.4 Kết khảo sát thời gian lưu acid amin pha tĩnh Supelco Ascentis Silica (250x4,6 mm, μm) với pha động khác 30 3.3 Xây dựng thẩm định phương pháp tách đồng thời số acid amin HILIC 31 3.3.1 Xây dựng phương pháp tách đồng thời số acid amin 31 3.3.2 Thẩm định phương pháp tách đồng thời acid amin 34 3.4 Bàn luận 36 3.4.1 Ý nghĩa khảo sát pH dung dịch thay đổi tỉ lệ acetonitril 36 3.4.2 Kết khảo sát thời gian lưu acid amin pha tĩnh pha động khác 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitril Acetonitril ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic AQC 6-aminoquinolyl-N- 6-aminoquinolyl-N- hydroxysuccinimidyl carbamate hydroxysuccinimidyl tắt carbamat Điện di mao quản CE Capilary electrophoresis CNBF Chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride Cloro-3,5dinitrobenzotrifluorid DABS-Cl Dimethylamino- Dimethylamino- azobenzensulfonyl chlorid azobenzensulfonyl clorid DAD Diod array detector Detector mảng diod ESI Electrospray ionisation Bộ ion hóa tia điện tử FOMC 9-fluorenylmethyl chloroformate 9-fluorenylmethyl cloroformat HILIC HPLC Hydrophilic interaction Sắc ký lỏng tương tác thân chromatography nước High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography LC Liquid chromatography Sắc ký lỏng LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng MS Mass spectrometry Phân tích khối phổ NBD-F 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3- 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa- diazol 1,3-diazol Normal phase liquid Sắc ký lỏng pha thuận NP-LC chromatography OPA ortho-phthalaldehyde Aldehyd (o) – phthalic PITC Phenylisothiocyanate Phenylisothiocyanat RP-LC Reverse phase liquid Sắc ký lỏng pha đảo chromatography Rs Resolution Độ phân giải RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối UPLC Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu chromatography UV Ultra violet Bức xạ tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Nội dung 1.1 Tên gọi, tên viết tắt, pI acid amin 1.2 Một số phương phát phân tích acid amin 11 2.1 Các điều kiện pha động khảo sát 20 3.1 Giá trị sspKa acid formic acid acetic thay 23 Trang đổi tỉ lệ ACN 3.2 Kết khảo sát khả tách acid amin thơm 33 (Phe, Tyr) thay đổi thành phần pha động 3.3 Độ phù hợp hệ thống phương pháp tách đồng 35 thời acid amin 3.4 Kết xác định giới hạn phát phương pháp 36 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Hình Nội dung Trang 1.1 Công thức tổng quát acid amin 1.2 Tính lưỡng tính acid amin 3 1.3 Các chế lưu giữ chủ yếu triển khai HILIC 2.1 Cách xác định tỉ số tín hiệu/độ nhiễu (S/N) 22 3.1 Sự thay đổi sspKa theo tỉ lệ ACN(%) acid acetic 23 acid formic 3.2 Mối quan hệ tỉ lệ 𝑠𝑠𝑝𝐾𝑎 / 𝑤 𝑤𝑝𝐾𝑎 theo tỉ lệ ACN(%) 24 3.3 Quan hệ sspKa wwpKa acid hữu mạch 25 thẳng tỉ lệ ACN khác 3.4 Sự biến đổi swpH dung dịch đệm acid acetic:amoni 25 acetat (2:1), đệm acid acetic:amoni acetat (1:1), muối amoni acetat 2,5,10 mM theo tỉ lệ ACN 3.5 Sắc ký đồ mẫu Prolin pha nước, amoni 27 acetat, dung môi pha động 10 3.6 Kết thời gian lưu số acid amin cột amino 28 11 3.7 Thời gian lưu acid amin biểu thị qua hệ số 29 chọn lọc với Tryptophan αTrp acid amin pha động có swpH thay đổi 12 3.8 Sắc ký đồ tách acid amin thơm 33 13 3.9 Sắc ký đồ chương trình tách đồng thời acid amin 34 14 3.10 Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu phương pháp 36 cực pha tĩnh thật (các nhóm Silanol có khơng có dẫn xuất) pha tĩnh giả (lớp nước hấp phụ bề mặt pha tĩnh thật) Có thể giải thích điều tính chất tích điện cột amino: tích điện dương tồn thang pH dụng cột (wwpH từ tới 8) [20], tương tác có ưu cột amino tương tác tĩnh điện [14] Thời gian lưu acid amin ảnh hưởng pH Acid aspatic, acid glutamic không rửa giải khỏi cột amino giải thích tính chất tích điện dương cột amino acid amin có nhóm R mang điện âm, xảy tương tác hút tĩnh điện nhóm -NH3+ pha tĩnh, kéo dài thời gian lưu Trong đó, acid amin threonin, serin, cystein khơng rửa giải xuất thêm liên kết hidro nhóm -OH, -SH với hidro nhóm -NH3+ pha tĩnh Glutamin nhóm acid amin có gốc R phân cực khơng mang điện khơng có khả tạo liên kết hidro nên rửa giải Đối với cột Silica, kết thời gian lưu acid amin có gốc R mang điện âm (acid aspatic acid glutamic) tương đối khác biệt với acid amin lại Hai chất thường không lưu giữ trừ pha động có acid Có thể giải thích tương tác đẩy tĩnh điện pha tĩnh mang điện âm nhóm COO- gốc R Mức độ ion hóa nhóm silanol bề mặt pha tĩnh phụ thuộc vào pH pha động Ở khoảng pH từ tới 3, bề mặt pha tĩnh Silica gần không mang điện [18] Khoảng pH khoảng bắt đầu có ion hóa rõ rệt bề mặt pha tĩnh Silica [11], [14], [18] Các dung mơi có pH thấp (acid formic, acid acetic) làm giảm mức độ anion hóa bề mặt pha tĩnh, làm giảm bớt tương tác đẩy tĩnh điện nên acid aspatic acid glutamic lưu giữ tốt Đồng thời, pH thấp làm giảm tỉ lệ tồn dạng nhóm mang điện âm COO- phân tử acid amin nên tương tác đẩy tĩnh điện Đặc biệt, pha động chứa amoni acetat 10 mM, pic acid aspatic acid glutamic tách khỏi vùng dung môi rửa giải trước Tryptophan Điều cho phép đề xuất rằng, việc tăng nồng độ ion làm tăng khả lưu giữ acid aspatic acid glutamic 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Sau thời gian nghiên cứu làm thực nghiệm, chúng tơi hồn thành mục tiêu đề ra: 1, Tính tốn pH pha động sử dụng HILIC tỉ lệ ACN khác • Tính sspKa acid formic acid acetic tỉ lệ ACN từ đến 90%, phục vụ tính pH cho pha động có acid formic acid acetic chạy HILIC nồng độ acid tỉ lệ ACN khác • Tính swpH pha động có muối amoni acetat theo phương trình: o 𝑠 𝑤𝑝𝐻 = 0,0146 𝑋𝐴𝐶𝑁 + 𝑤 𝑤𝑝𝐻 • Tính sspH pha động có thành phần dung dịch đệm pha từ acid acetic amoni acetat theo phương trình: o 𝑠 𝑤𝑝𝐻 = 0,0291 𝑋𝐴𝐶𝑁 + 𝑤 𝑤𝑝𝐻 2, Khảo sát thời gian lưu của 16 acid amin pha tĩnh khác • Trên pha tĩnh amino: pH pha động ảnh hưởng tới thời gian lưu acid amin • Trên pha tĩnh silica: o Thời gian lưu acid amin có xu hướng tăng pH tăng o Nồng độ ion pha động ảnh hưởng tới khả lưu giữ chọn lọc acid amin Nồng độ ion cao cho kết chọn lọc tốt khoảng 2-15 mM 3, Dựa khảo sát thời gian lưu acid amin, xây dựng chương trình tách đồng thời acid amin: Tryptophan, Phenylalanin, Tyrosin, Methionin, Cystein với điều kiện sắc ký sau: • Pha tĩnh: Cột Supelco Ascentis Silica (250x4,6 mm, μm) • Pha động: ACN:Amoni acetat 15 mM 85:15 39 • Tốc độ dòng: mL/phút • Bước sóng phát hiện: 205 nm • Thời gian phân tích: 30 phút Chương trình tách định tính thẩm định tiêu chí • Độ phù hợp hệ thống (RSD