VŨ NGÂN BÌNH PHÂN TÍCH một số ACID AMIN BẰNG sắc ký LỎNG TƯƠNG tác THÂN nước LUẬN án TIẾN sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ NGÂN BÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 9720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà HÀ NỘI, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận án Vũ Ngân Bình i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập nghiên cứu thực luận án, hướng dẫn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, giảng viên Bộ mơn Hố phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, truyền dạy cho kiến thức, kinh nghiệm quý báu ln động viên, chia sẻ để tơi hồn thành luận án Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học phòng ban trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tham gia học tập hoàn thành luận án thời hạn Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện cho sử dụng thiết bị để hồn thành luận án thời hạn Các thầy, cơ, anh, chị, em Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, động viên suốt trình làm việc, học tập nghiên cứu khoa học Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè quan tâm, động viên chia sẻ với tơi suốt q trình học tập thực luận án Tác giả luận án Vũ Ngân Bình ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ vi ix xi Chương TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 1.1.1 Đặc điểm pha 1.1.2 Cơ chế tách yếu tố ảnh hưởng 1.2 TỔNG QUAN VỀ CẤU TRÚC, SINH TỔNG HỢP, THOÁI HOÁ 3 VÀ VAI TRÒ CỦA ACID AMIN TRONG CƠ THỂ 1.2.1 Cấu trúc acid amin 1.2.2 Sinh tổng hợp thoái hố acid amin 1.2.3 Vai trị acid amin thể 1.2.4 Bệnh rối loạn chuyển hoá acid amin thơm 1.3 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.3.1 Tổng quan hợp chất nghiên cứu 1.3.2 Tổng quan chế phẩm nghiên cứu 1.3.3 Tổng quan phương pháp phân tích acid amin Chương NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.3 TRANG THIẾT BỊ 2.4 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tới thời gian lưu số acid amin HILIC 2.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích chế phẩm chứa acid amin HILIC 2.4.3 Xây dựng phương pháp phân tích số acid amin thơm huyết tương người HILIC-MS/MS 2.4.4 Các tiêu chí thẩm định phương pháp phân tích chế phẩm 16 16 18 20 21 25 25 28 29 iii 37 37 38 39 40 40 41 45 46 2.4.5 Các tiêu chí thẩm định phương pháp phân tích huyết tương 2.4.6 Một số tính tốn thống kê Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 SƠ BỘ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐẾN SỰ LƯU GIỮ CỦA ACID AMIN 3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM CHỨA ACID AMIN BẰNG HILIC-DAD 3.2.1 Phân tích đồng thời acid amin thơm chế phẩm tiêm truyền 3.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng acid amin hoạt chất khác chế phẩm 48 50 51 51 59 59 67 3.3 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ACID AMIN THƠM TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG HILICMS/MS 3.3.1 Xây dựng phương pháp 3.3.2 Thẩm định phương pháp Chương BÀN LUẬN 4.1 BÀN LUẬN VỀ PHÂN TÍCH ACID AMIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG HILIC-DAD 4.1.1 Chế phẩm chứa đa acid amin 4.1.2 Chế phẩm chứa acid amin thành phần khác 100 100 108 121 4.1.3 Bàn luận ưu nhược điểm phương pháp HILIC-DAD 125 4.2 BÀN LUẬN VỀ PHÂN TÍCH ACID AMIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HILIC-MS/MS 4.2.1 Bàn luận lựa chọn 4.2.2 Bàn luận ưu nhược điểm phương pháp HILIC-MS/MS 4.3 BÀN LUẬN VỀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ LƯU GIỮ, HÌNH DÁNG PIC CỦA ACID AMIN TRONG HILIC 4.3.1 Ảnh hưởng pha tĩnh 4.3.2 Ảnh hưởng pha động 4.3.3 Ảnh hưởng dung môi pha mẫu 4.4 MỘT SỐ ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT iv 121 121 122 126 126 127 128 128 131 137 138 139 KẾT LUẬN ĐỀ XUẤT DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC 139 139 PL PL1 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PL3 PL38 PL61 PL73 PHỤ LỤC PL124 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt AA Amino acid Acid amin ACN Acetonitrile Acetonitril AG Ammonium glycyrrhizinate Amoni glycyrrhizinat Ala Alanine Alanin APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization Ion hóa áp suất khí AQC 6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl carbamate 6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl carbamat Arg Arginine Arginin Asn Asparagine Asparagin Asp Aspatic acid Acid aspatic BEH Ethylene Bridged Hybrids Cầu liên kết etylen BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bò BSTFA Heptaflorobutanol N,OBis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide Heptaflorobutanol N,OBis(trimethylsilyl) trifluoroacetamid CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản CPT Chất phân tích Cys Cysteine Cystein DAD Diod Array Detector Detector mảng diod DEA Diethylamine Diethylamin DMF Dimethyl formamide Dimethyl formamid ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử FMOC 9-fluorenylmethyl chloroformate 9-fluorenylmethyl cloroformat GC Gas Chromatography Sắc ký khí Gln Glutamine Glutamin Glu Glutamic acid Acid glutamic Gly Glycine Glycin vi HFBA Heptafluorobutyric acid Acid heptaflorobutyric HFIP Hexafluoro-2-propanol Hexafloro-2-propanol HPA Non PKU hyperphenylalaninemia Tăng phenylalanin huyết không PKU HILIC Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Sắc ký lỏng tương tác thân nước His Histidine Histidin HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HQC High quality control Dung dịch kiểm tra nồng độ cao HSA Human Serum Albumin Albumin huyết người HT Huyết tương IEC Ion Exchange Chromatography Sắc ký trao đổi ion Ile Isoleucine Isoleucin Leu Leucine Leucin LLOQ Lower Limit of Quantitation Giới giạn định lượng LOD Limit of Detection Giới hạn phát LQC Low quality control Lys Lysine Lysin MeOH Methanol Methanol Met Methionine Methionin MQC Medium quality control Dung dịch kiểm tra nồng độ MS Mass Spectrometry Khối phổ MSA Methane sulfonic acid Acid metan sulfonic NBD-F 4-fluoro-7-nitro-2,1,3benzoxadiazole 4-floro-7-nitro-2,1,3benzoxadiazol NPLC Normal Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha thuận OPA o-phthalaldehyde o-phthalaldehyd PBS Phosphate buffer saline Dung dịch đệm muối phosphat Dung dịch kiểm tra nồng độ thấp PĐ Pha động vii PITC Phenylisothiocyanate phenylisothiocyanat Phe Phenylalanine Phenylalanin PKU Phenylketonuria Phenylketon niệu Pro Proline Prolin PT Pha tĩnh RLCH Rối loạn chuyển hoá RPLC Reversed Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha đảo Ser Serine Serin SSA 5-sulfosalicylic acid Acid 5-sulfosalicylic TCA Trichloroacetic acid Acid tricloroacetic TFA Trifluoroacetic acid Acid trifloroacetic TLTK Tài liệu tham khảo Thr Threonine Threonin TMCS Trimethylclorosilane trimethylclorosilan Trp Tryptophan Tryptophan Tyr Tyrosine Tyrosin TYR Tyrosinemia Tyrosin huyết UV-VIS Ultraviolet – visible Tử ngoại – khả kiến Val Valine Valin ZIC Zwitterionic Lưỡng cực viii DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Số bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Cấu trúc số pha tĩnh dùng HILIC Bảng 1.2 Đặc điểm cấu tạo 20 acid amin thường gặp 17 Bảng 1.3 Giá trị chẩn đoán mục tiêu điều trị số bệnh RLCH AA 24 Bảng 2.1 Các chất chuẩn đối chiếu 38 Bảng 3.1 Thời gian lưu số AA cột Zorbax NH2 (150 x 4,6 mm; μm) 53 Thời gian lưu số AA cột Zorbax Rx-Sil (150 x 4,6 mm, µm) 56 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ CH3COONH4 lên thời gian lưu Trp độ phân giải Trp-Phe - Pha tĩnh Inertsil Amide (150´4,6 mm; µm) 61 Bảng 3.4 Độ phù hợp hệ thống định lượng Trp, Phe Tyr chế phẩm 63 Bảng 3.5 Độ tuyến tính phương pháp định lượng Trp, Phe Tyr 64 chế phẩm Bảng 3.6 Độ xác phương pháp định lượng Trp, Phe Tyr 65 chế phẩm Bảng 3.7 Độ phương pháp định lượng Trp, Phe Tyr chế phẩm 66 Bảng 3.8 Kết định lượng Trp, Phe Tyr chế phẩm 67 Bảng 3.9 Thời gian lưu AG, Cys Gly sử dụng hai cột hai tốc độ dòng 68 Bảng 3.10 Thời gian lưu AG, Cys Gly nhiệt độ 26oC 30oC 69 Bảng 3.11 Độ cân xứng pic AG, Cys Gly theo pH 69 Bảng 3.12 Độ cân xứng pic AG, Cys Gly theo nồng độ đệm 70 Bảng 3.13 Thời gian lưu chất AG, Cys Gly 72 Bảng 3.14 Kết độ phù hợp hệ thống định lượng AG, Cys Gly 72 Bảng 3.15 Độ tuyến tính phương pháp định lượng AG, Cys Gly 72 Bảng 3.16 Độ xác phương pháp định lượng AG, Cys Gly 73 Bảng 3.17 Độ phương pháp định lượng AG, Cys Gly 74 ix PHỤ LỤC Quy trình phân tích kết thẩm định phương pháp định lượng tryptophan, phenylalanin tyrosin huyết tương PL6.1 Quy trình phân tích *Quy trình xử lý mẫu: - Các dung dịch chuẩn: Hút 20 µL dung dịch PBS + 20 µL dung dịch chuẩn có nồng độ Trp, Phe Tyr khoảng nồng độ 130-40000 ppb; 140-43000 ppb 100-30000 ppb + 20 µL chuẩn nội Phe-d5 10000 ppb vào eppendorf, lắc giây, thêm 780 µL MeOH, lắc xốy 30 giây, lọc qua màng lọc PTFE 0,2 µm vào vial sắc ký - Dung dịch thử (huyết tương): Lắc mẫu huyết tương, hút 100 µL huyết tương vào eppendorf, thêm 900 µL nước, lắc xốy 30 giây mẫu huyết tương pha loãng 10 lần Hút 20 µL huyết tương pha loãng 10 lần + 20 µL nước + 20 µL chuẩn nội Phe-d5 10000 ppb vào eppendorf, lắc giây, thêm 780 µL MeOH, lắc xoáy 30 giây, lọc qua màng lọc PTFE 0,2 µm vào vial sắc ký * Điều kiện sắc ký: - Pha tĩnh: Cột Acquity UPLC BEH Amide 130A, 150 x 2,1 mm; 1,7 µm (Waters), tiền cột Acquity UPLC BEH VanGuard 130A, x 2,1 mm; 1,7 µm (Waters); - Pha động: hỗn hợp HCOOH 0,1% ACN HCOOH 0,1% nước, tỷ lệ 85:15 (v/v), tốc độ dịng 0,3 ml/phút; - Thể tích tiêm µL * Điều kiện khối phổ Chất CTPT M Ion mẹ Frag Ion (V) CE (V) Ion CE (V) Trp Phe Tyr Phe d5 C11H12N2O2 C9H11NO2 C9H11NO3 C9H6D5NO2 204,1 165,1 181,7 170,1 205,1 166,1 182,1 171,1 105 100 90 111 28 32 32 146,0 77,2 136,0 107,1 16 36 16 24 118,1 103,1 165,0 106,1 * Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn dung dịch thử Xây dựng đường biểu diễn tỷ lệ diện tích pic Trp, Phe Tyr với chuẩn nội Phed5 theo nồng độ Trp, Phe Tyr (trọng số 1/x2), xác định hệ số góc a hệ số chắn b đường chuẩn Tính nồng độ Trp, Phe Tyr mẫu huyết tương dựa vào diện PL124 tích pic Trp, Phe Tyr diện tích pic chuẩn nội Phe-d5 sắc ký đồ thu từ dung dịch thử, hệ số a,b đường chuẩn hệ số pha loãng mẫu thử (10) PL125 PL6.2 Các sắc đồ gốc kết thẩm định phương pháp định lượng tryptophan, phenylalanin tyrosin huyết tương LC-MS/MS Phần phụ lục trình bày số sắc ký đồ gốc xuất trực tiếp từ phần mềm xử lý máy LC-MS/MS, sắc đồ gồm thành phần a, b, c, d, e, f, g, h (xem thích hình phụ lục 6.2) sau: a) Dữ liệu gốc (thời gian lưu, diện tích pic, tỷ lệ diện tích pic so với chuẩn nội…) xuất từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS b) Đường chuẩn xây dựng từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS c) Sắc đồ MRM mảnh định lượng chất phân tích (Trp, Phe Tyr) d) Sắc đồ MRM mảnh định tính chất phân tích (Trp, Phe Tyr) e) Phổ khối chất phân tích (Trp, Phe Tyr) f) Sắc đồ MRM mảnh định lượng chuẩn nội Phe-d5 g) Sắc đồ MRM mảnh định tính chuẩn nội Phe-d5 h) Phổ khối chuẩn nội Phe-d5 PL6.2.1 Các sắc đồ mẫu thẩm định độ tuyến tính – khoảng xác định xuất từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS PL6.2.1.1 Sắc ký đồ gốc dung dịch Tryptophan 6500 ppb b) a) c) d) e) f) g) h) PL126 PL6.2.1.2 Sắc ký đồ gốc dung dịch Phenylalanin 7000 ppb b) a) c) d) e) f) g) h) PL6.2.1.3 Sắc ký đồ gốc dung dịch Tyrosin 30000 ppb b) a) c) d) e) f) g) h) PL127 PL6.2.2 Các sắc ký đồ mẫu thẩm định độ độ xác xuất từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS PL6.2.2.1 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương pha loãng) thêm chuẩn Tryptophan 27000 ppb b) a) c) d) e) f) g) h) PL6.2.2.2 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương pha loãng) thêm chuẩn Phenylalanin 28000 ppb b) a) c) d) e) f) g) h) PL128 PL6.2.2.3 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương pha loãng) thêm chuẩn Tyrosin 5000 ppb b) a) c) d) e) f) g) h) PL6.2.3 Các sắc ký đồ mẫu thẩm định ảnh hưởng độ pha loãng xuất từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS PL6.2.3.1 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương thêm chuẩn Tryptophan 130000 ppb, sau pha loãng 10 lần) a) b) c) d) e) f) g) h) PL129 PL6.2.3.2 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương thêm chuẩn Phenylalanin140000 ppb, sau pha lỗng 10 lần) b) a) c) d) e) f) g) h) PL6.2.3.3 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương thêm chuẩn Tyrosin 100000 ppb, sau pha lỗng 10 lần) b) a) c) d) e) f) g) h) PL130 PL6.2.4 Các sắc ký đồ mẫu huyết tương chuẩn tham chiếu xuất từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS PL6.2.4.1 Sắc ký đồ gốc Tryptophan (QC level 1) b) a) c) d) e) f) g) h) PL6.2.4.2 Sắc ký đồ gốc Phenylalanin (QC level 2) b) a) c) d) e) f) g) h) PL131 PL6.2.4.3 Sắc ký đồ gốc Tyrosin (QC level 2) b) a) c) d) e) f) g) h) PL6.3 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ PL6.3.1 Tối ưu hố điều kiện khối phổ phân tích Tryptophan Optimizer Report Instrument Information Project Name PFOX Instrument Name Instrument Instrument Model G6460C Compound Name Tryptophan Formula C11H12N2O2 Mass 204.09 Sample Position Method Name F:\data copy tu o D\Methods\Optimizer-positive.m Polarity Positive Ion Source Precursor Ion ESI Fragmentor 205.1 105 Product Ion 188 118.1 Collision Energy 28 Abundance 170 8734 146 16 5447 91.2 36 162 PL132 PL6.3.2 Tối ưu hố điều kiện khối phổ phân tích Phenylalanin Optimizer Report Instrument Information Project Name PFOX Instrument Name Instrument Instrument Model G6460C Compound Name Formula Mass Sample Position Phenyl-alanin C9H11NO2 165.08 Method Name F:\data copy tu o D\Methods\Optimizer-positive.m Polarity Positive Ion Source ESI Precursor Ion 166.09 Product Ion Fragmentor 100 Collision Energy Abundance 120.1 103.1 77.2 81.2 24 32 36 16 521 20998 1191 69 PL6.3.3 Tối ưu hố điều kiện khối phổ phân tích Tyrosin Optimizer Report Instrument Information Project Name PFOX Instrument Name Instrument Instrument Model G6460C Compound Name Tyrosine Formula C9H11NO3 Mass 181.07 Sample Position Method Name F:\data copy tu o D\Methods\Optimizer-positive.m Polarity Positive Ion Source Precursor Ion ESI Fragmentor 182.08 Product Ion 91.2 Collision Energy 28 90 Abundance 212 136 165 119 16 16 2392 2308 339 Page PL133 PL6.3.4 Tối ưu hố điều kiện khối phổ phân tích Phenylalanin-d5 Optimizer Report Instrument Information Project Name PFOX Instrument Name Instrument Instrument Model G6460C Compound Name phenyl alanin d5 Formula C9H6D5NO2 Mass 170.11 Sample Position P1-F1 Method Name F:\data copy tu o D\Methods\Optimizer-positive.m Polarity Positive Ion Source ESI Precursor Ion 171.12 Product Ion 125.1 106.1 Fragmentor 111 Collision Energy 12 32 Abundance 772 61367 107.1 80.2 24 40 9452 452 Page PL134 PL6.4 Thông tin mẫu huyết tương chuẩn tham chiếu / +lECIPE® ClinChek® - Control Plasma Control lyophlll1td / Kontrollplasma lyophilislert FOR AMINO ACIDS (by Amino ·Acid Analyser (AAA)) / FOR AMINOS.AUREN (mlt Amlnoslureanalysator (ASA)) Intended use: Storage and stability: ClinChek'" Plasma Controls are used for intemal quality assurance in clinicalchemical laboratories These lyophlllsed controls are based on hum11n pl111ma and are available with mean values In the normal as well as in the pathological range After reconstitution the controls have to be prepared like patient samples in one series of analyses • • day at - •c Notes: Add exactly 3.0 ml of HPLC-water to the vial and mix for 15 When all material is dissolved, the solution is ready to use Zweckbestimmung: hours at 15 - 30 •c • 10 days at below-18 •c (avoid repeated freezing and thawing) Reconstitution: ClinChek• Kontrollplasmen dienen der intemen Qualitatssicherung im klinischchemischen Laboratorium Es handelt sich um lyophilislerte Kontrollen auf Humanplasmabasis mil Sollwerten Im normalen und pathologischen Bereich Nach Rekonstitution werden die Kontrollproben analog zu den Patientenproben in einer Analysenserie aufgearbeitet Mean values: will This product be stable until the expiration date when stored unopened at - •c After rer.onstitution the stability of the analytes is: · The concentrations of the analytes are chosen in ranges smere valid results can be obtained According to quality assurance all ClinChek'" Controls have to pass strict quality control procedures during manufacturing RECIPE guarantees the same stability and constitution for each vial of one lot The variation of the filling volume (CV) is < % The average residual moisture ofthis lot is 1.16 % Lagerung und Haltbarkeit: Dieses Produkt ist bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum stabil, wenn es unge0ffnet bei - •c gelagert wird Die Haltbarkeit der Analyten in der rekonstitulerten L0sung betragt: • • • Stunden bei 15 - 30 Tag bei - a •c 10 Tage bei < -18 •c (nur einmal auftauen) •c Rekonstltutlon: Anmerkungen: Zurn lnhalt eines Flaschchens werden exakt 3.0 ml HPLC-Wasser gegeben und die LOsung unter gelegentlichem Umschwenken for ca 15 Minuten stehen gelasse~ Nach emeuter sorgfaltiger DurchmiSchung kann die L0sung verwendet werden Die Analytkonzentrationen liegen im gut messbaren Berei