Phân tích một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ NGÂN BÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ NGÂN BÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 9720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà HÀ NỘI, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận án Vũ Ngân Bình i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập nghiên cứu thực luận án, hướng dẫn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, giảng viên Bộ mơn Hố phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, truyền dạy cho kiến thức, kinh nghiệm quý báu ln động viên, chia sẻ để tơi hồn thành luận án Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học phòng ban trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tham gia học tập hoàn thành luận án thời hạn Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện cho sử dụng thiết bị để hồn thành luận án thời hạn Các thầy, cô, anh, chị, em Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, động viên suốt trình làm việc, học tập nghiên cứu khoa học Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè quan tâm, động viên chia sẻ với suốt trình học tập thực luận án Tác giả luận án Vũ Ngân Bình ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 1.1.1 Đặc điểm pha 1.1.2 Cơ chế tách yếu tố ảnh hưởng 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁU TRÚC, SINH TỔNG HỢP, THỐI HỐ VÀ VAI TRỊ CỦA ACID AMIN TRONG CƠ THỂ 1.2.1 Cấu trúc acid amin 1.2.2 Sinh tổng hợp thối hố acid amin 1.2.3 Vai trị acid amin thể 1.3 BỆNH DO RỐI LOẠN CHUYỂN HOÁ ACID AMIN THƠM 1.3.1 Phenylketon niệu (PKU) 1.3.2 Tăng phenylalanin huyết không PKU (HPA) 1.3.3 Tyrosin huyết (TYR) 1.4 TỔNG QUAN VỀ PHÂN TÍCH ACID AMIN 1.4.1 Tổng quan phân tích acid amin chế phẩm 1.4.2 Tổng quan phân tích acid amin dịch sinh học Chương NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.3 TRANG THIẾT BỊ 2.4 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tới thời gian lưu số acid amin HILIC 2.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích chế phẩm chứa acid amin HILIC 2.4.3 Xây dựng phương pháp phân tích phenylalanin, tryptophan tyrosin huyết tương HILIC-MS iii 2.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích chế phẩm 2.4.5 Thẩm định phương pháp phân tích huyết tương 2.4.6 Một số tính tốn thống kê Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 SƠ BỘ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐẾN SỰ LƯU GIỮ CỦA ACID AMIN 3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM CHỨA ACID AMIN BẰNG HILIC 3.2.1 Phân tích đồng thời acid amin thơm chế phẩm tiêm truyền 3.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng acid amin hoạt chất khác chế phẩm 3.3 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ACID AMIN THƠM TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HILIC KẾT NỐI KHỐI PHỔ 3.3.1 Xây dựng phương pháp 3.3.2 Thẩm định phương pháp Chương BÀN LUẬN 4.1 BÀN LUẬN VỀ PHÂN TÍCH ACID AMIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG HILIC-DAD 4.1.1 Chế phẩm chứa đa acid amin 4.1.2 Chế phẩm chứa acid amin thành phần khác 4.1.3 Bàn luận ưu nhược điểm phương pháp HILIC-DAD 4.2 BÀN LUẬN VỀ PHÂN TÍCH ACID AMIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HILIC-MS/MS 4.2.1 Bàn luận lựa chọn 4.2.2 Bàn luận ưu nhược điểm phương pháp HILIC-MS/MS 4.3 BÀN LUẬN VỀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ LƯU GIỮ, HÌNH DÁNG PIC CỦA ACID AMIN TRONG HILIC 4.3.1 Ảnh hưởng pha tĩnh 4.3.2 Ảnh hưởng pha động 4.3.3 Ảnh hưởng dung môi pha mẫu 4.4 MỘT SỐ ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT iv KẾT LUẬN ĐỀ XUẤT DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt AA ACN AG Ala APCI AQC Arg Asn Asp BEH BSA BSTFA CE CPT Cys DAD DEA DMF ESI FMOC GC Gln Glu Gly vi HFBA HPA HILIC His HPLC HQC HSA HT IEC Ile Leu LLOQ LOD LQC Lys MeOH Met MQC MS MSA NBD-F tích pic Trp, Phe Tyr diện tích pic chuẩn nội Phe-d5 sắc ký đồ thu từ dung dịch thử, hệ số a,b đường chuẩn hệ số pha loãng mẫu thử (10) PL125 PL6.2 Các sắc đồ gốc kết thẩm định phương pháp định lượng tryptophan, phenylalanin tyrosin huyết tương LC-MS/MS Phần phụ lục trình bày số sắc ký đồ gốc xuất trực tiếp từ phần mềm xử lý máy LC-MS/MS, sắc đồ gồm thành phần a, b, c, d, e, f, g, h (xem thích hình phụ lục 6.2) sau: a) Dữ liệu gốc (thời gian lưu, diện tích pic, tỷ lệ diện tích pic so với chuẩn nội…) xuất từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS b) Đường chuẩn xây dựng từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS c) Sắc đồ MRM mảnh định lượng chất phân tích (Trp, Phe Tyr) d) Sắc đồ MRM mảnh định tính chất phân tích (Trp, Phe Tyr) e) Phổ khối chất phân tích (Trp, Phe Tyr) f) Sắc đồ MRM mảnh định lượng chuẩn nội Phe-d5 g) Sắc đồ MRM mảnh định tính chuẩn nội Phe-d5 h) Phổ khối chuẩn nội Phe-d5 PL6.2.1 Các sắc đồ mẫu thẩm định độ tuyến tính – khoảng xác định xuất từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS PL6.2.1.1 Sắc ký đồ gốc dung dịch Tryptophan 6500 ppb a) b) c) d) e) f) PL126 PL6.2.1.2 Sắc ký đồ gốc dung dịch Phenylalanin 7000 ppb a) b) c) d) e) f) PL6.2.1.3 Sắc ký đồ gốc dung dịch Tyrosin 30000 ppb b) a) c) d) e) f) PL127 PL6.2.2 Các sắc ký đồ mẫu thẩm định độ độ xác xuất từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS PL6.2.2.1 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương pha loãng) thêm chuẩn Tryptophan 27000 ppb a) b) c) f) PL6.2.2.2 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương pha loãng) thêm chuẩn Phenylalanin 28000 ppb a) b) PL128 PL6.2.2.3 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương pha loãng) thêm chuẩn Tyrosin 5000 ppb a) b) c) d) e) f) g) h) PL6.2.3 Các sắc ký đồ mẫu thẩm định ảnh hưởng độ pha loãng xuất từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS PL6.2.3.1 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương thêm chuẩn Tryptophan 130000 ppb, sau pha lỗng 10 lần) a) b) c) d) e) f) PL129 PL6.2.3.2 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương thêm chuẩn Phenylalanin140000 ppb, sau pha lỗng 10 lần) a) b) c) d) e) f) PL6.2.3.3 Sắc ký đồ gốc dung dịch thử (huyết tương thêm chuẩn Tyrosin 100000 ppb, sau pha loãng 10 lần) a) b) c) d) e) f) PL130 PL6.2.4 Các sắc ký đồ mẫu huyết tương chuẩn tham chiếu xuất từ phần mềm hệ thống LC-MS/MS PL6.2.4.1 Sắc ký đồ gốc Tryptophan (QC level 1) a) b) c) d) e) f) PL6.2.4.2 Sắc ký đồ gốc Phenylalanin (QC level 2) a) b) c) d) e) f) PL131 PL6.2.4.3 Sắc ký đồ gốc Tyrosin (QC level 2) a) b) c) d) e) f) PL6.3 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ PL6.3.1 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ phân tích Tryptophan Optimizer Report Instrument Information Project Name Instrument Name Instrument Model Compound Name Tryptophan Method Name F:\data copy tu o D\Methods\Optimizer-positive.m Polarity Precursor Ion 205.1 Product Ion 188 118.1 146 91.2 PL132 PL6.3.2 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ phân tích Phenylalanin Optimizer Report Instrument Information Project Name Instrument Name Instrument Model Compound Name Phenyl-alanin Method Name F:\data copy tu o D\Methods\Optimizer-positive.m Polarity Precursor Ion 166.09 Product Ion 120.1 103.1 77.2 81.2 PL6.3.3 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ phân tích Tyrosin Optimizer Report Instrument Information Project Name Instrument Name Instrument Model Compound Name Tyrosine Method Name F:\data copy tu o D\Methods\Optimizer-positive.m Polarity Precursor Ion 182.08 Product Ion 91.2 136 165 119 PL133 PL6.3.4 Tối ưu hố điều kiện khối phổ phân tích Phenylalanin-d5 Optimizer Report Instrument Information Project Name Instrument Name Instrument Model Compound Name phenyl alanin d5 Method Name F:\data copy tu o D\Methods\Optimizer-positive.m Polarity Precursor Ion 171.12 Product Ion 125.1 106.1 107.1 80.2 PL134 PL6.4 Thông tin mẫu huyết tương chuẩn tham chiếu +lECIPE® / ClinChek® - Control Plasma Control lyophlll1td / Kontrollplasma lyophilislert FOR AMINO ACIDS (by Amino ·Acid Analyser (AAA)) / FOR AMINOS.AUREN (mlt Amlnoslureanalysator (ASA)) Intended use: Storage and stability: ClinChek'" Plasma Controls are used for intemal quality assurance in clinicalchemical laboratories These lyophlllsed controls are based on hum11n pl111ma and are available with mean values In the normal as well as in the pathological range After reconstitution the controls have to be prepared like patient samples in one series of analyses will • hours at 15 - 30 •c • day at - •c • 10 days at below-18 •c (avoid repeated freezing and thawing) Reconstitution: Add exactly 3.0 ml of HPLC-water to the vial and mix for 15 When all material is dissolved, the solution is ready to use Zweckbestimmung: ClinChek• Kontrollplasmen dienen der intemen Qualitatssicherung im klinischchemischen Laboratorium Es handelt sich um lyophilislerte Kontrollen auf Humanplasmabasis mil Sollwerten Im normalen und pathologischen Bereich Nach Rekonstitution werden die Kontrollproben analog zu den Patientenproben in einer Analysenserie aufgearbei-tet Rekonstltutlon: Notes: The concentrations of the analytes are chosen in ranges smere valid results can be obtained According to quality assurance all ClinChek'" Controls have to pass strict quality control procedures du-ring manufacturing RECIPE guarantees the same stability and constitution for each vial of one lot The variation of the filling volume (CV) is < % The average residual moisture ofthis lot is 1.16 % Lagerung und Haltbarkeit: Dieses Produkt ist bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum stabil, wenn es unge0ffnet bei - •c gelagert wird Die Haltbarkeit der Analyten in der rekonstitulerten L0sung betragt: • • • Stunden bei 15 - 30 Tag bei - •c a •c 10 Tage bei < -18 •c (nur einmal auftauen) Anmerkungen: Zurn lnhalt eines Flaschchens werden exakt 3.0 ml HPLC-Wasser gegeben und die LOsung unter gelegentlichem Umschwenken for ca 15 Minuten ste-hen gelasse~ Nach emeuter sorgfalti-ger DurchmiSchung kann die L0sung verwendet werden Mean values: This product be stable until the expi-ration date when stored unopened at - •c After rer.onstitution the stability of the analytes is: · Die Analytkonzentrationen liegen im gut messbaren Berei