Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước HILIC

BỘ Y TẾ BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - ĐINH THÙY LINH 1201319 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC-HILIC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - ĐINH THÙY LINH 1201319 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC-HILIC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Vũ Ngân Bình Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích Độc chất HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khoá luận này, nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cô, gia đình bạn bè Cho đến khoá luận hoàn thiện, xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành đến họ Đầu tiên, xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Vũ Ngân Bình- Bộ môn Hóa phân tích Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội, người cô tận tình hướng dẫn, bảo, động viên suốt chặng đường khó khăn thực khóa luận Tôi xin cảm ơn PGS.TS Vũ Đặng Hoàng - Bộ môn Hóa phân tích Độc chất thầy dành thời gian tra cứu giúp đỡ trình tìm tài liệu Tôi xin cảm ơn thầy cô Bộ môn Hóa phân tích Độc chất tạo điều kiện cung cấp cho tài liệu cần thiết để giúp hoàn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng ban, thầy cô giáo cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội-những người dạy bảo trang bị cho kiến thức khoa học tảng suốt năm học qua mái trường Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn thân thương đến ba mẹ, gia đình, bạn bè cảm ơn tập thể lớp M1K67 quan tâm, giúp đỡ nhiều thời gian học tập thực khóa luận Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất tình cảm giúp đỡ mà thầy cô, gia đình, bạn bè dành tặng cho suốt thời gian khó khăn vừa qua Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2017 Sinh viên Đinh Thùy Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 1.1 Giới thiệu sắc ký lỏng tương tác thân nước 1.2 Nguyên lý sắc ký lỏng tương tác thân nước 1.2.1 Pha động 1.2.2 Pha tĩnh 1.2.3 Cơ chế tách yếu tố ảnh hưởng .15 1.2.4 Hệ thống phát (Detector) .20 1.3 Ưu nhược điểm HILIC .22 1.3.1 Ưu điểm 22 1.3.2 Nhược điểm 24 CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG THỰC TẾ CỦA SẮC KÝ HILIC .25 2.1 Ứng dụng HILIC phân tích acid amin, peptid protein .25 2.2 Ứng dụng HILIC phân tích kháng sinh 27 2.3 Ứng dụng HILIC phân tích nucleotid, nucleosid, nucleobase 28 2.4 Ứng dụng HILIC phân tích phospholipid .29 2.5 Ứng dụng HILIC phân tích carbohydrat .30 2.6 Ứng dụng HILIC phân tích chất dẫn truyền thần kinh 31 2.7 Ứng dụng HILIC đối tượng phân tích khác .32 2.8 Thực tế ứng dụng HILIC Việt Nam 32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34 Kết luận .34 Đề xuất 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril APCI Atmospheric Pressure Ion hóa áp suất khí Chemical Ionization CAD Charged Aerosol Detector Detector Aerosol tích điện DMF Dimethyl Formamide Dimethyl Formamid ELSD Evaporative Light Scattering Detector tán xạ ánh sáng bay Detector ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử HILIC Hydrophilic Interaction Sắc ký lỏng tương tác thân nước Chromatgraphy HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng MP Mobile Phase Pha động MS Mass Spectrometry Khối phổ NPLC Normal Phase Liquid Sắc ký lỏng pha thuận Chromatography RID Refrective Index Detector Detector số khúc xạ RPLC Reversed Phase Liquid Sắc ký lỏng pha đảo Chromatography TFA Trifluoroacetic acid Acid triflouroacetic THF Tetrahydrofurane Tetrahydrofuran SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn UHPLC Utra-High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu siêu cao Chromatography DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các cấu trúc khác pha tĩnh áp dụng cho việc phân tách HILIC Bảng 1.2 Các loại tương tác chất phân tích, pha tĩnh pha động 16 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơ chế phân tách hệ thống HILIC 18 Hình 1.2 Lớp điện tích kép bề mặt pha tĩnh liên kết 20 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nhiều năm gần đây, kỹ thuật sắc ký nói chung sắc ký lỏng nói riêng áp dụng nhiều lĩnh vực khác hóa sinh, sinh học, phân tích môi trường, phân tích thuốc, lâm sàng Trong số kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký phân bố kỹ thuật thông dụng chia làm hai loại dựa độ phân cực tương đối pha tĩnh pha động: sắc ký pha thuận - NPLC (normal phase liquid chromatography) sắc ký pha đảo - RPLC (reverse phase chromatography) Tuy nhiên có thêm nhiều kỹ thuật sắc ký lỏng khác nghiên cứu, sử dụng để mở rộng ứng dụng nhiều đối tượng phân tích khắc phục nhược điểm kỹ thuật sắc ký truyền thống Một số kỹ thuật sắc ký lỏng tương tác thân nước - HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography) HILIC lần đề xuất Alpert vào năm 1990 Kỹ thuật sắc kí sử dụng pha tĩnh phân cực với dung môi pha động phân cực So với NPLC, HILIC cải thiện khả hòa tan chất phân tích nhờ sử dụng pha động chứa nước so với pha động hữu sắc ký pha thuận So với RPLC, HILIC phân tích chất phân cực, không lưu giữ cột sắc ký pha đảo Nhờ ưu điểm mà HILIC ngày nhận nhiều quan tâm dần trở nên phổ biến giới Tuy nhiên kĩ thuật số lượng nghiên cứu nước Vì vậy, việc có hiểu biết đầy đủ kỹ thuật cần thiết để áp dụng kĩ thuật HILIC cách phù hợp hiệu Vậy nên, khóa luận thực với mong muốn đem đến nhìn tổng quan HILIC, cung cấp hiểu biết khả ứng dụng phân tích đặc biệt nghành Dược, nhằm tạo tảng cho việc ứng dụng kỹ thuật sắc ký HILIC điều kiện thực tế Việt Nam Khóa luận thực hiên với ba mục tiêu sau: Tìm hiểu nguyên lý, chế tách sắc ký HILIC Phân tích ưu nhược điểm phương pháp HILIC so với phương pháp sắc ký khác Tổng quan nghiên cứu ứng dụng HILIC ngành Dược Nucleobase, nucleosid, nucleotid acetic/ACN ACN amoni acetat 12 nucleobase nucleosid ACN Nucleosid nucleotid Acetonitril /nước acetonitrilvà đệm (0,20% acid formic 20 mmol/L amoni acetat) acetonitril 10 mM dung dịch acid ammoni acetat ACN Nước tiểu Dịch chiết vi sinh vật 16 nucleosid nucleobase biển 10 Geosaurus Leech 14 nucleosid nucleobase Quả Ziziphus (Z jujuba, Z jujuba var spinosa and Z nucleosid dẫn xuất (hydroxyl hóa methyl hóa) 20 nucleobase, nucleosid A: 0,8% acetic nucleotid acid 10 mM amoni 11 12 PL-16 zwitterionic MS silica-based monolithic capillary s (140 mm × 0,1 mm) amid pentahydroxy functionalized silica SP XBridge Amid UV [109] [136] [118] Venusil HILIC ESI(250 x 4,6 mm, TOF/M μm) S LOD 0,6130,0 ng/mL [52] TSKgel Amid80 (150 mm x 2,0 mm, 3,0 μm) ZIC-HILIC 0,07-30,49 ng/mL 0,26-60,98 ng/mL [60] ACQUITY MS UPLC BEH Amid (2,1 mm 0,11–3.12 ng.mL-1 and 0,29–12.48 [120] [75] mauritiana) acetattrong nước B: 0,1% acetic acid acetonitril A: mM amoni format (pH 5) 90/10 acetonitril 13 Hỗn hợp 27 oligonucleotid chuẩn Oligonucleotid 14 Mẫu sinh học cytosine (Cyt) , methylcytosine (5mC), 5hydroxymethylcytosine (5hmC) A: amoni format 2,5 mM nước B: acetonitril 15 Sữa bột trẻ sơ sinh công thức dinh dưỡng dành cho người lớn / trẻ em nucleotid sau: adenosin 5'monophosphat (AMP), guanosin 5'-monophosphat (GMP), uridin 5'monophosphat (UMP), cytidin 5'-monophosphat (CMP) inosin 5'monophosphat (IMP) nucleotid (AMP, ADP, 16 ng.mL-1 x 100 mm, 1,7 µm) 50 mm × 4,6 mm ID × µm (100A˚ pore size) Ascentis Silica (BEH) HILIC (100 × 2,1 mm id, 1,7 µm) ESI-MS Amoni format (30 mmol/L) nước (pH 2,5 điều chỉnh acid formic) TSK-gel NH2100 MS ACN đệm bare TiO2 UV PL-17 MS [94] pg/mL, pg/mL Cyt, 45 pg/ml, 90 pg/mL cho 5mC, 57 pg/ml, 100 pg/mL 5hmC LOD LOQ dung dịch chuẩn 0,005-0,01 0,010,03 μg/mL [50] [82] [147] 17 18 ATP, UMP, UDP, UTP, Na phosphat GMP, GDP, GTP , CMP CTP) chất trung gian chúng (NAD, NADH, UDP-Glu UDPGluNAc) Oligonucleotid: acid polythymidylic có độ dài khác (10, 15, 20 30 nucleotid) (150 mm × 4,6 mm I.D., 3µm) Purin, pyrimidin nucleosid ACN, amoni format ZIC-HILIC 150 x 2,1 mm, microm cột aminopropyl (100 mm x 2,0 mm, μm) MS 19 Mô gan Xác định số lượng nucleosid triphosphat biến đổi 2'-C ACN ACN / nước (5:95 v/v) với 20 mM amoni acetat pH 9,45 20 Isatidis Radix 16 nucleosid nơ-ron ACN (0,1% Acquity UPLC acidacetic) nước BEH Amid (0,8% acid acetic 10 PL-18 LOD 1,69 pmol, 1,21 pmol, 1,0 pmol 0,55 pmol cho 10, 15, 20 30 mer [10] MS [29] LC-MS / MS [38] LOQ: 0,0598.18 ng mL-1 [35] mmol.L-1amoni acetat) PL-19 Bảng 2.4 Ứng dụng HILIC phân tích phospholipid STT Nền mẫu Đối tượng phân tích Pha động Pha tĩnh A: acetonitril/nước 10% (v/v) 2,5 mmol/L amoni acetat B: methanol/nước 10% (v/v) 2,5 mmol/L amoni acetat Detector LOD, LOQ ESI-MS SupelcoAscentis (Supelco, Bellefonte, PA, USA) silica (15 cm × 2,1 mm, µm), A: acetonitril/nước Sequant ZIC– ESI-MS (95:5) với 6,5 mM amoni cHILIC (150 format mm × 2,1 mm, B: 2-propanol/nước µm, (50:50) với 6,5 mM amoni format Tham khảo [102] Sản phẩm Phospholipid gốc oxy trình oxy hóa hóa lipit chiết xuất từ đậu nành dầu thực vật, chất béo động vật dầu tảo Phospholipid Khối u thận mô bình thường Lipid A: acetonitril B: mmol/L amoni acetat Spherisorb Si (250 × 4,6 mm, µm) ESI-MS [62] Tảo xanh Jaoa bullata, Peridinium cinctum Vitis vinifera glycerophospholipid, glycosphyngolipid, glycolipid chất betain lipid 10 mm amoni acetat/acetonitril DIOL MS [54] PL-20 [138] corvina Lipoprotein tỷ trọng thấp Sữa phospholipid (Lysophosphatidylethanola min, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Sphingomyelin, Lysophosphatidylcholin) Lipid phân cực Sữa Phospholipid: phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamin, phosphatidylinostol, phosphatidylcholin, phosphatidylserin, sphingomyelin lysophosphatidylcholin Phospholipid Nãothiênnga Phospholipid Silica ELSD A: acetonitril-amoni format (9:1, v/v; pH=5.5) B: acetonitril-methanolamoni format (55:35:10, v/v/v; pH=5.5) acetonitril, nước, amoni format acid formic Ascentis Express HILIC, 150×4,6 mm I.D., 2.7 μm MS [40] diol MS [150] nước/acetonitril partially porous (150 mm × 2,1 mm I.D., 2.7 μm d.p) Silica(250mm× 3mm; 5µm) IT-TOF MS [67] MS [127] acetonitril, methanol,amoniacetat 10 mM (55:35:10) PL-21 10 ng 30 ng [73] 10 Các tế bào tiền nhân prokaryotic Các chất chuyển hóa lipid A: acetonitril B: 10 mM amoni acetat/nước điều chỉnh pH với acid formic PL-22 50 mm×2,1 mm Kinetex 2,6 μm HILIC MS [11] Bảng 2,5 Ứng dụng HILIC phân tích carbohydrat STT Nền mẫu Đối tượng phân tích Pha động Pha tĩnh Detector Heparin Oligosaccharid oligosaccharid có nguồn gốc tự nhiên dẫn xuất huỳnh quang maltooligosaccharid không dẫn xuất dẫn xuất với 2aminobenzoic acid, 2aminobenzamid, 2aminopyridin 8aminonaaphthalen1,3,6-trisulfonic acid Sữa non dê Các oligosaccharid acetonitril: nước với carbohydrat 0,1% amoni hydroxit XBridge Amid 3,5µm (4,6 × 250 mm) Cột amid Huỳnh quang MS A: 50 mM amoni acetat pH 9.0 với NH4OH B: ACN acetonitril Nước (30-85% acetonitril nước, v/v) thêm 0,1% Acid acetic, amoni acetat (5, 10, 20 30 mmol L-1) BEH X-Bridge ); 150 mm × 4,6 mm; 3,5µm) MS PL-23 LOD, LOQ MS Tham khảo [70] [57] 140 đến 315 mg L-1 oligosacchar id trung tính từ 83 đến 251 mg L-1 oligosacchar [106] Sản phẩm trình biến đổi sinh học glycerol iminosugar carbohydrat phân tử Dịch chiết lượng thấp Aglaonema sp acetonitril: nước với mM amoni acetat Các Glycosaminogly Oligosaccharid Penicillium dextran sp oligosaccharid mmol/L NH4Ac diol-HILIC MS [72] A: nước:acetonitril (5:95, v/v) 10 mM amoni acetat B:Nước 10 mM amoni acetat ACN/Nước ACQUITY UPLC BEH GlyACN (2,1 × 150 mm, 1,7 μm TSKgel NH2100 BEH amid MS [48] IR [58] glycerol, arabitol mannitol A: nước, 0,05% trifluoroacetic acid B: acetonitril, 0,05% trifluoroacetic acid Saccharid Galactooligosaccharid acetonitril: nước với 0,1% ammoni hydroxit PL-24 ACQUITY ELSD BEH (Ethylene Bridged Hybrid) amid HILIC (2,1 150 mm, 1,7 mm, (XBridge MS (BEH); 150 mm × 4,6 mm, 3,5 µm, 135A˚ pore size id acid 5,0 đến 8,0 13,0 đến 18,0 ng [12] [122] [77] 10 Tế bào thực vật Oligosaccharide ACN/Nước 11 Mô Arabidopsi s thaliana Acetonitril / nước (95: 5, v/v) 12 Các chất chuyển hóa liên quan đến carbohydrat: hợp chất có chứa glucose (gluc), sucrose (Suc), raffinose, verbascose, mannitol, maltitol, glucose-6-phosphate (Glc6P) trehalose6-phosphate (Tre6P ) Disaccharid Heparan sulfate (HS) chondroitin sulfate / dermatan sulfate (CS / DS) glycosamin oglyACNs (GAGs) Chất làm aspartam (ASP), nhân alitame (ALI), neotam 13 n Acquity UPLC BEH Amid (1µm, 2,1 mm × 150 mm) zwitterionic ZIC-HILIC (3,5 μm, 150 mm 2,1 mm) ELSD-MS ESI-MS A: amoni format, pH 4,4 B: A trong90% acetonitril Amid (150 mm MS × 2,1 mm, 1,9 μm) amoni format pH 3,5methanol-acetonitril silica PL-25 [93] (LODs) từ 0,2 μM cho đường trung tính, 1,0 μM rượu đường 2,0 μM cho đường phosphates tích điện âm [2] [72] [22] tạo 14 Bia (NEO), acesulfam (ACS), saccharin (SAC), cyclamat (CYC), sucralos (SCL) Neohesperidin dihydrochalcon (NHDC) carbohydrat ethanol, isopropanol aceton PL-26 cột Asahipak NH2P-504E CAD [81] Bảng 2,6 Ứng dụng HILIC phân tích chất dẫn truyền thần kinh STT Nền mẫu Đối tượng phân tích Pha động Pha tĩnh Detector LOD, LOQ Nước tiểu người MS Mô não chuột TSKgel Amid80 (2,0 μm, 2,0 × 150 mm) MS [20] Não chuột BEH Amid APCIMS Dịch ốc sên Lymnaea stagnalis A: 10 mM đệm amoni format nước pH 3,0 B: 10 mM đệm amoni format acetonitril A: 0,1% acid formic/nước B: 0,1% acid formic/ACN A: 0,1% acid formic nước–acetonitril (95:5, v/v) với mM NH4OAC B: 0,1% acid formic 95% acetonitril–nước (95:5, v/v) với1 mM NH4OAC ACN : H2O (90:10 v/v) 10 mM NH4COOH XBridge Amid™ BEH (3,0 × 100 mm, 3,5 μm) Chất dẫn truyền thần kinh monoamin (dopamin, norepinephrin, epinephrin serotonin) với tiền chất chất chuyển hóa tương ứng chúng Acid glutamic, glutamin, acid pyroglutamic, GABA theanin Chất dẫn truyền thần kinh monoamin nội sinh serotonin, dopamin, epinephrin norepinephrin Tham khảo [92] ZIC-cHILIC MS 20 hợp chất bao gồm chất dẫn truyền thần kinh, tiền chất chất chuyển PL-27 LOD: 0,3 nM đến 3,0 nM [148] [33] Mẫu sinh học hóa Acetylcholin, serotonin, dopamin, norepinephrin, glutamat, GABA glycin Các chất dẫn truyền thần kinh monoamin Não chuột Thực phẩm Mô người methanol nước (55:45, v/v, 20 mM ammoni format điều chỉnh pH 3,0 acid formic) Merck ZICHILIC (2,1 mm 100 mm, 3μm) MS nước: acetonitril đệm amoni format XBridge BEH Amid XP MS Acetylcholin nội sinh 20 mM ammoni format nước–acetonitril (30:70, v/v) acetylcholin, betain, cholin, A: acetonitril glycerophosphocholin, B:10 mM lysophosphatidylethanolam ammoni format in, phosphatidylcholin, pH 3,0 điều chỉnh phosphatidylethanolamin, acid formic phosphatidylinositol, phosphocholin sphingomyelin Acetylcholine, cholin A:20 mM PL-28 Atlantis HILIC MS Silica (2,1 mm × 150 mm, μm) Ascentis MS Express (150 × 2,1 mm HILIC , 2,7 μm) Polyhydroxethy MS LOD: pg acetylcholin, serotonin, and glutamat, 10 pg dopamin, norepinephrin, GABA glycin [132] [63] LLOD 0,2 ng / mL [116] [145] [142] butyrobetain, (3carboxypropyl) trimethylammoni) 10 Microdialys ate mô da Acetylcholine 11 Tế bào nuôi cấy Acetylcholine 12 Dịc ngoại bào từ nao khỉ chất dẫn truyền thần kinh: acetylcholin, serotonin, dopamin, acid γaminobutyric (GABA), glutamat aspartat ammoni format với 0,1% acid formic (v/v) B: ACN 10 mM dd ammoni format nước (điều chỉnh pH 4.0 acid formic) /ACN (30:70, v/v) (10 mM) ammoni format/ACN (35/75, v/v) A: 10 mM ammoni acetat/ACN (10 + 90) pH 7,3 B: 30 mM ammoni acetat/ACN (80 + 20) pH 7,3 PL-29 l ZIC-HILIC (150 2,1 mm, 3,5 µm) ESI-MS 0,075 fmol 0,25 fmol [13] zwitterionic ZIC-HILIC MS [125] ZIC-HILIC (150 mm × 1.0 mm I.D.) MS (LOD) 1,5 fmol (0,3 nmol / L) LOD acetylcholin, serotonin, dopamin, GABA, glutamat aspartat tương ứng 0,015, 0,15, 0,3, 1,2, 15 femtomoles, [142] PL-30 ... VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 1.1 Giới thiệu sắc ký lỏng tương tác thân nước 1.2 Nguyên lý sắc ký lỏng tương tác thân nước 1.2.1 Pha động ... pháp sắc ký khác Tổng quan nghiên cứu ứng dụng HILIC ngành Dược CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 1.1 Giới thiệu sắc ký lỏng tương tác thân nước Kể từ đời sắc ký công cụ thiếu... Dựa vào khác chế tách người ta chia sắc ký lỏng thành nhiều loại sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử, sắc ký lực-miễn dịch Trong đó, phổ biến sắc ký phân bố khả ứng