Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước HILIC

Một lựa chọn khác là sắc ký tạo cặp ion, các chất phân tích được tạo cặp ion với tác nhân trong pha động giúp giảm độ phân cực của chất phân tích, do đó tăng lưu trên cột pha đảo.. Với c

TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC-HILIC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khoá luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy cô, gia đình cũng như bạn bè Cho đến nay khi khoá luận đã hoàn thiện, tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ

Đầu tiên, tôi xin phép được được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà và ThS Vũ Ngân Bình- Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất -

Trường Đại học Dược Hà Nội, là những người cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, và động viên tôi trong suốt chặng đường khó khăn khi thực hiện khóa luận này Tôi cũng

xin cảm ơn PGS.TS Vũ Đặng Hoàng - Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất vì thầy đã

dành thời gian tra cứu và giúp đỡ tôi trong quá trình tìm tài liệu

Tôi xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất đã tạo điều kiện cung cấp cho tôi các tài liệu cần thiết để giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin được cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và các cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội-những người đã dạy bảo và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng trong suốt 5 năm học qua dưới mái trường

Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương đến ba mẹ, gia đình, bạn bè cũng như cảm ơn tập thể lớp M1K67 đã quan tâm, giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những tình cảm và sự giúp đỡ mà thầy cô, gia đình, bạn bè đã dành tặng cho tôi trong suốt thời gian khó khăn vừa qua

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Đinh Thùy Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 3 1.1 Giới thiệu về sắc ký lỏng tương tác thân nước 3

1.2 Nguyên lý cơ bản của sắc ký lỏng tương tác thân nước 5

1.2.1 Pha động 5

1.2.2 Pha tĩnh 6

1.2.3 Cơ chế tách và các yếu tố ảnh hưởng 15

1.2.4 Hệ thống phát hiện (Detector) 20

1.3 Ưu nhược điểm của HILIC 22

1.3.1 Ưu điểm 22

1.3.2 Nhược điểm 24

CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG THỰC TẾ CỦA SẮC KÝ HILIC 25

2.1 Ứng dụng HILIC trong phân tích các acid amin, peptid và protein 25

2.2 Ứng dụng của HILIC trong phân tích kháng sinh 27

2.3 Ứng dụng của HILIC trong phân tích các nucleotid, nucleosid, nucleobase 28 2.4 Ứng dụng của HILIC trong phân tích phospholipid 29

2.5 Ứng dụng của HILIC trong phân tích carbohydrat 30

2.6 Ứng dụng của HILIC trong phân tích các chất dẫn truyền thần kinh 31

2.7 Ứng dụng của HILIC trên các đối tượng phân tích khác 32

2.8 Thực tế ứng dụng HILIC ở Việt Nam 32

Chương 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34

1 Kết luận 34

2 Đề xuất 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

APCI Atmospheric Pressure

Chemical Ionization

Ion hóa tại áp suất khí quyển

CAD Charged Aerosol Detector Detector Aerosol tích điện DMF Dimethyl Formamide Dimethyl Formamid

ELSD Evaporative Light Scattering

Detector

Detector tán xạ ánh sáng bay hơi

ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử

HILIC Hydrophilic Interaction

Chromatgraphy

Sắc ký lỏng tương tác thân nước

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

NPLC Normal Phase Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng pha thuận

RID Refrective Index Detector Detector chỉ số khúc xạ

RPLC Reversed Phase Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng pha đảo

TFA Trifluoroacetic acid Acid triflouroacetic

THF Tetrahydrofurane Tetrahydrofuran

SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn

UHPLC Utra-High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng siêu cao

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các cấu trúc khác nhau của các pha tĩnh được áp dụng cho việc phân tách trong HILIC 8 Bảng 1.2 Các loại tương tác giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha động 16

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cơ chế phân tách trong một hệ thống HILIC 18 Hình 1.2 Lớp điện tích kép trên bề mặt pha tĩnh liên kết 20

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong nhiều năm gần đây, kỹ thuật sắc ký nói chung và sắc ký lỏng nói riêng được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như hóa sinh, sinh học, phân tích môi trường, phân tích thuốc, lâm sàng Trong số các kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký phân

bố là kỹ thuật thông dụng hơn cả và được chia làm hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thuận - NPLC (normal phase liquid chromatography) và sắc ký pha đảo - RPLC (reverse phase chromatography) Tuy nhiên hiện nay đã có thêm nhiều kỹ thuật sắc ký lỏng khác được nghiên cứu, sử dụng để mở rộng ứng dụng trên nhiều đối tượng phân tích và khắc phục những nhược điểm của các kỹ thuật sắc ký truyền thống Một trong số những kỹ thuật đó là sắc ký lỏng tương tác thân nước - HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography) HILIC lần đầu tiên được đề xuất bởi Alpert vào năm 1990 Kỹ thuật sắc kí này sử dụng pha tĩnh phân cực cùng với dung môi pha động phân cực

So với NPLC, HILIC cải thiện khả năng hòa tan của chất phân tích nhờ sử dụng pha động chứa nước so với pha động hữu cơ của sắc ký pha thuận So với RPLC, HILIC phân tích được các chất phân cực, ít hoặc không lưu giữ trên các cột sắc ký pha đảo Nhờ những ưu điểm này mà HILIC đang ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm

và dần trở nên phổ biến trên thế giới Tuy nhiên đây là một kĩ thuật mới và số lượng nghiên cứu ở trong nước còn ít Vì vậy, việc có những hiểu biết đầy đủ về kỹ thuật này là cần thiết để có thể áp dụng được kĩ thuật HILIC một cách phù hợp và hiệu quả hơn

Vậy nên, khóa luận này được thực hiện với mong muốn đem đến một cái nhìn tổng quan về HILIC, cung cấp những hiểu biết cơ bản cũng như khả năng ứng dụng của nó trong phân tích và đặc biệt là trong nghành Dược, nhằm tạo một nền tảng cơ bản cho việc ứng dụng kỹ thuật sắc ký HILIC trong điều kiện thực tế của Việt Nam

Khóa luận được thực hiên với ba mục tiêu sau:

2 Phân tích ưu và nhược điểm của phương pháp HILIC so với các phương pháp sắc

ký khác

3 Tổng quan về các nghiên cứu ứng dụng HILIC trong ngành Dược

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 1.1 Giới thiệu về sắc ký lỏng tương tác thân nước

Kể từ khi ra đời sắc ký là một công cụ không thể thiếu trong phân tích Dựa vào

sự khác nhau về cơ chế tách người ta chia sắc ký lỏng thành nhiều loại như sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử, sắc ký ái lực-miễn dịch Trong đó, phổ biến nhất là sắc ký phân bố do khả năng ứng dụng rộng rãi trên nhiều đối tượng phân tích Sắc ký phân bố được chia làm hai loại dựa trên sự phân cực tương đối giữa pha động và pha tĩnh là sắc ký pha thuận (NPLC) và sắc ký pha đảo (RPLC) RPLC sử dụng các dung môi pha động phân cực như nước, đệm trong nước an toàn và rẻ tiền nên được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn so với NPLC Tuy nhiên, một trong những vấn đề gặp phải đối với RPLC là sự kém lưu giữ đối với các hợp chất phân tích rất phân cực [17]

Với các chất thân nước và tích điện có thể sử dụng sắc ký trao đổi ion với cơ chế lưu giữ dựa vào tương tác Coulomb Sắc ký trao đổi ion có thể được sử dụng cho hầu hết các chất tan tích điện, từ các ion vô cơ nhỏ đến các protein hay các đại phân

tử sinh học khác Tuy nhiên, việc sử dụng sắc ký trao đổi ion cần dùng đến các cột trao đổi ion khá đắt tiền Một lựa chọn khác là sắc ký tạo cặp ion, các chất phân tích được tạo cặp ion với tác nhân trong pha động giúp giảm độ phân cực của chất phân tích, do đó tăng lưu trên cột pha đảo Phương pháp này sử dụng pha động chứa chất tạo cặp ion và sử dụng các cột RP ít tốn kém hơn và thường có hiệu quả tách tốt hơn

so với trao đổi ion Tuy nhiên, khi thêm các thuốc thử ghép cặp ion ví dụ như TFA hoặc natri heptansulfonat vào pha động thường làm giảm cường độ tín hiệu trong hệ thống phát hiện bằng khối phổ chế độ phun điện tử (MS-ESI)

Với các chất thân nước và không tích điện, để tăng lưu giữ trong RPLC, người ta biến đổi một hoặc nhiều nhóm chức phân cực của chất phân tích thành các nhóm ít phân cực hơn bằng phản ứng hóa học, được gọi là kỹ thuật tạo dẫn xuất Dẫn xuất hoá làm tăng khả năng lưu giữ chất phân tích trên cột pha đảo và đôi khi cải thiện

khả năng phát hiện Ví dụ formaldehyd, trong dung dịch nước chủ yếu tồn tại dạng hydrat dihydroxymethan rất thân nước và khó phân tích bằng sắc ký pha đảo Formaldehyd phản ứng với 2,4-phenyl hydrazin trong môi trường acid chuyển thành hydrazon, kém phân cực hơn thuận tiện cho phân tích bằng RPLC Dẫn xuất hóa thường là lựa chọn tốt khi phản ứng tạo dẫn xuất đơn giản và chỉ tạo thành một sản phẩm duy nhất Đối với các chất có chứa nhiều nhóm chức phân cực, các phản ứng thường tạo các sản phẩm phụ, có khuynh hướng khó tách được sau khi tạo dẫn xuất do các sản phẩm tạo thành có thể khó tách ra khỏi nhau Tạo dẫn xuất cũng tốn nhiều thời gian và làm tăng độ không đảm bảo đo trong phân tích định lượng [17] Một hướng giải quyết khác để phân tích các chất phân cực mạnh và không tích điện là dùng cách “đảo ngược RP”, một chế độ tách có pha tĩnh phân cực được làm giàu bởi một phần pha động phân cực Sắc ký tương tác thân nước (HILIC) là một

kỹ thuật như vậy HILIC đã được biết đến vào những năm 1970 và được định nghĩa bởi Alpert vào năm 1990 [53] HILIC là một biến thể của sắc ký thông thường, sử dụng pha tĩnh phân cực, pha động phân cực với các thành phần chính thường là 5-40% nước hoặc đệm trong acetonitril (ACN) Các chất phân tích được lưu giữ và tách bằng cách tạo cân bằng tại phân vùng giữa pha động và lớp nước hấp phụ trên

bề mặt pha tĩnh Việc sử dụng nước trong pha động mang lại cho HILIC một số lợi thế so với NPLC Với NPLC, việc chuẩn bị mẫu phức tạp hơn vì yêu cầu kiểm soát hoàn toàn lượng dung môi nước Dung môi dùng trong NPLC không phân cực và các chất phân tích phân cực thường có độ hòa tan thấp trong dung môi này Khi phân tích bằng NPLC ta còn gặp khó khăn khi kết nối với detector MS-ESI vì dung môi kém phân cực của NPLC làm giảm hiệu suất ion hóa Trình tự rửa giải trong HILIC ngược lại với sắc ký pha đảo, thứ tự rửa giải từ kém phân cực nhất đến rất phân cực, điều này giúp HILIC trở thành kỹ thuật bổ sung và giải quyết các vấn đề của RP trong phân tích các chất phân cực Khi HILIC được sử dụng kết hợp với RP-SPE, dung môi dùng để rửa giải các chất phân tích từ thiết bị SPE có thể được tiêm trực tiếp lên cột HILIC giúp tiết kiệm thời gian và ngăn ngừa sự mất mẫu Nồng độ ACN cao cũng mang lại cho HILIC hai ưu điểm khác là: độ nhạy cao trong ESI-MS

và tách nhanh hơn do độ nhớt thấp của các chất rửa giải HILIC so với RPLC Như vậy, HILIC khắc phục tốt các nhược điểm của các kỹ thuật sắc ký trước đó nên ngày càng thu hút được nhiều sự chú ý và được áp dụng rộng rãi trong những năm gần đây

1.2 Nguyên lý cơ bản của sắc ký lỏng tương tác thân nước

có thể được sử dụng làm pha động cho HILIC (ví dụ tetrahydrofuran-THF hay dioxan) Alcol cũng có thể được sử dụng tuy nhiên cần dùng ở nồng độ cao để đạt được cùng một mức độ lưu giữ các chất phân tích so với các dung môi khác [88] Dưới đây là danh sách các dung môi theo chiều tăng lực rửa giải:

Aceton < isopropanol ~ propanol <acetonitril < ethanol < dioxan < dimethyl formamid (DMF) ~ methanol[4]

Một số đệm như amoni acetat và amoni format thường được sử dụng để kiểm soát pH pha động và lực ion Trong HILIC, chúng làm thay đổi sự phân cực của chất phân tích, dẫn đến những thay đổi khác biệt trong việc lưu giữ, thay đổi thời gian lưu Đối với chất phân tích ion, như thuốc kháng sinh aminoglycosid, pH phải được điều chỉnh để đảm bảo rằng các chất phân tích chỉ tồn tại một dạng ion duy nhất Nếu trong cơ chế kiểm soát việc lưu giữ có sự đóng góp của tương tác ion,

ảnh hưởng đến việc lưu giữ, tăng nồng độ đệm sẽ làm tăng thời gian lưu, ảnh hưởng đến solvat hóa cũng như hình dạng pic sắc ký (pic kéo đuôi, khả năng phục hồi pha tĩnh kém) Đối với các chất phân tích trung tính (ví dụ carbohydrat) không cần sử dụng đệm trong pha động Việc sử dụng các muối khác (chẳng hạn như 100-300

mM natri perclorat) được hòa tan trong hỗn hợp dung môi hữu cơ cao (khoảng 70% acetonitril) có thể được sử dụng để tăng sự phân cực của pha động nhằm đạt được rửa giải mong muốn Tuy nhiên do muối không dễ bay hơi nên việc này không thuận lợi để sử dụng cùng một detector khối phổ

HILIC có thể được thực hiện ở chế độ đẳng dòng hoặc chế độ gradient HILIC có điểm tương đồng với NPLC là lưu giữ tăng lên khi độ phân cực của pha động giảm,

do đó các hợp chất giữ lại trên cột HILIC có thể được tách rửa bằng cách tăng sự phân cực của pha động, nghĩa là tăng tỷ lệ nước hay tăng nồng độ muối trong pha động, hai lựa chọn này được áp dụng trong chế độ rửa giải gradient

1.2.2 Pha tĩnh

Pha tĩnh sử dụng trong phân tích HILIC là những bề mặt phân cực, phổ biến nhất

là silica không dẫn xuất hoặc silica gel cổ điển được thay đổi với nhiều nhóm chức phân cực khác nhau Ngoài ra, các pha tĩnh polyme cũng có thể được sử dụng trong HILIC Tuy nhiên, có thể do giá thành đắt và độ phân giải thấp hơn so với các cột silica nên số lượng các cột trên thị trường cũng như các ứng dụng HILIC được tìm thấy sử dụng cột polymer là không nhiều

Thế hệ đầu tiên của pha tĩnh HILIC bắt đầu vào năm 1975 Linden và Lawhead tách carbohydrat bằng việc sử dụng pha tĩnh amino-silica, Bondapak (Waters, Milford, MA, USA) sử dụng pha động là hỗn hợp acetonitril và nước (75:25 tt/tt) Thế hệ tiếp theo của pha tĩnh HILIC sử dụng silica diol và silica amid Cột silica diol chủ yếu được sử dụng để tách các protein Theo Tosoh, nhà sản xuất TSKgel Amide-80, các cột amid silica có sẵn từ ít nhất năm 1985 Pha tĩnh này có các nhóm carbamoyl không ion được liên kết hóa học với silica gel Sau đó các pha này được Yoshida áp dụng để tách các peptid Các pha tĩnh liên kết hóa học với các đặc tính

cấu trúc đặc trưng đã được chuẩn bị bởi Buszewski và các cộng sự Một trong số chúng chứa các phối tử aminopropyl liên kết với silica; một số khác là pha alkylamid và pha hỗn hợp có chứa nhiều loại phối tử liên kết [88]

Trong 15 năm qua, HILIC đã phát triển các pha tĩnh thế hệ thứ hai và thứ ba Một

số vật liệu tách mới cho HILIC thu hút ngày càng nhiều sự chú ý trong những năm gần đây Những biến đổi cấu trúc của pha tĩnh dành cho HILIC rộng hơn so với pha tĩnh sử dụng trong sắc ký pha đảo Những pha tĩnh này cho thấy tính chọn lọc tốt và khả năng lặp lại cao của việc tách các hợp chất phân cực Mặc dù số lượng cột thương mại có sẵn cho HILIC chưa có nhiều và đang phát triển, chưa có những pha tĩnh linh hoạt, đa năng như C18 trong RP-LC nhưng các loại vật liệu tách khác nhau cho HILIC cũng có những đặc điểm lưu giữ và phân tách chọn lọc khác nhau và rất

đa dạng [88]

Số lượng các cột trên thị trường cũng như các ứng dụng được tìm thấy chủ yếu

sử dụng silica không dẫn xuất và silica pha liên kết Dưới đây là bảng cấu trúc một

số pha tĩnh thường gặp (bảng 1.1)

phân tách trong HILIC

Cấu trúc của pha tĩnh

u trúc khác nhau của các pha tĩnh được áp d phân tách trong HILIC

c áp dụng cho việc

[113],[25]

1.2.2.1 Silica không dẫn xuất

Trên cột silica không dẫn xuất, chất phân tích được giữ lại mạnh mẽ bởi liên kết hydro và tương tác trao đổi với nhóm silanol Trong đó nhóm silanol (-SiOH) đóng vai trò thiết yếu tạo nên bề mặt phân cực của silica

Sử dụng pha tĩnh là silica không dẫn xuất có nhiều ưu điểm: pha tĩnh này không bị pha động pH thấp thủy phân, cắt các liên kết và rửa trôi như các pha tĩnh pha liên kết Về

độ nhạy các pha tĩnh silica không dẫn xuất cải thiện độ nhạy 2 đến 10 lần so với RPLC khi tách các hợp chất phân cực [8]

Tuy nhiên, nhược điểm của pha tĩnh này là có thể xảy ra sự quá tải của cột silica không dẫn xuất Quá tải có thể dễ dàng xảy ra khi cơ chế tách chủ yếu dựa trên sự hấp phụ hơn là trên sự phân bố Cơ chế này xảy ra khi sử dụng pha động có hàm lượng nước thấp Ngoài ra, có thể xảy ra sự hấp phụ không thuận nghịch trên các pha này Hấp phụ không thuận nghịch phụ thuộc rất nhiều vào pH pha động và xảy

ra khi sử dụng các pha động trung tính hoặc tính acid yếu Tăng lực ion không khắc phục được nhược điểm này Thay ACN bằng nước hoặc methanol (MeOH) có thể làm giảm sự hấp phụ không thuận nghịch [8]

Silica bao gồm loại silica gel A, được kết tủa từ các dung dịch silicat, có tính acid Do bị nhiễm các kim loại nên khi sử dụng pha tĩnh này có thể tạo phức chelat với mẫu phân tích, gây lưu giữ mạnh hoặc pic không đối xứng Loại silica gel B chứa ít kim loại hơn loại A, ổn định ở giá trị pH trung bình và cao (ít nhất là pH 9) Vật liệu này cho thấy sự phân tách tốt đặc biệt là đối với các mẫu base do sự tinh khiết Tại giá trị pH cao hơn, nhóm silanol được ion hóa và sự trao đổi ion đóng một vai trò quan trọng trong việc lưu giữ, đặc biệt là đối với các hợp chất base tích điện dương Bổ sung TFA có thể hạn chế được hiện tượng ion hóa các nhóm silanol Silica gel loại C là loại pha tĩnh có bề mặt được dehydroxyl hóa Các nhóm silanol Si-OH được thay thế bằng các nhóm Si-H không phân cực Có thể có đến 95% silanol ban đầu bị loại bỏ, làm cho chúng ít phân cực hơn các silica có mật độ các nhóm silanol cao Nó có thể được sử dụng để tách acid hoặc các chất base sử dụng pha động đệm có chứa hơn 50-70% dung môi hữu cơ

Pha tĩnh silica có thể là dạng hạt hoàn toàn xốp, bề ngoài xốp, hoặc cột silica nguyên khối [17] Các hạt silica hoàn toàn xốp (totally porous particles - TPP) có đường kính 1,5-5,0 μm được sử dụng rộng rãi nhờ dung tích cột lớn do đó cho phép tiêm khối lượng mẫu lớn hơn và có nhiều lựa chọn có sẵn Các hạt xốp bề mặt (superficially porous particles - SPP) bao gồm một lõi rắn (1,5-5 μm) tráng lớp vỏ silica ngoài có lỗ xốp (0,25-0,5 μm) Các pha này đặc trưng bởi giá trị số đĩa lý thuyết cao Diện tích bề mặt của SPP bằng khoảng 3/4 so với TPP, nhưng lớn hơn nhiều so với silica nguyên khối Silica nguyên khối (monolithic) có độ xốp và độ thấm cao, do đó có thể phân tích ở tốc độ cao và áp suất thấp, cho phép tách nhanh các chất phân tích Tuy nhiên, các cột này có hệ số phân bố pha thấp, tức là dung lượng mẫu thấp hơn và do đó độ lưu giữ thấp hơn các cột dạng hạt Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu trên cột silica nguyên khối nhưng các ứng dụng HILIC sử dụng cột này không nhiều

Mặc dù vật liệu silica ổn định cơ học và có hiệu quả sắc ký tốt nhưng các pha tĩnh silica không dẫn xuất không ổn định về mặt hóa học ở giá trị pH cao hơn 8 (do

sự hòa tan của silica) Điều này làm giảm hiệu lực cột, tăng áp suất cột và làm hỏng lớp vật liệu silica Ngoài ra, nhóm silanol tự do gây ra hiện tượng kéo đuôi, đặc biệt

là khi phân tích các chất phân tích có tính base Một trong những cách khắc phục những vấn đề này là việc phát minh cột silica không dẫn xuất có chứa các cầu liên kết ethylen (Ethylene Bridged Hybrids - BEH), giảm lượng silanol tự do và giảm tính acid của nhóm silanol Các hạt nhồi này có kích thước từ 1,7 đến 10 μm, ổn định ở các giá trị pH cao (đến pH 10) Vật liệu này có hình cầu và độ bền cơ học cao nên thường được sử dụng trong sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UHPLC) Ngoài ra,

do làm giảm tính acid của silanol nên pha tĩnh này đã hạn chế hiện tượng kéo đuôi cho các chất phân tích base Neue và các đồng nghiệp đã nghiên cứu cơ chế HILIC của BEH 1,7 μm không dẫn xuất và so sánh với các pha silica không dẫn xuất khác

Họ kết luận rằng cơ chế lưu giữ của BEH bao gồm phân bố, hấp phụ và các tương tác tương tự như các cột silica không dẫn xuất [34]

1.2.2.2 Silica pha liên kết

Các pha tĩnh pha liên kết thu được thông qua việc biến đổi hóa học bề mặt silica Các pha liên kết hóa học đã được áp dụng trong HILIC có thể chia thành các nhóm theo trạng thái tích điện của chúng, bao gồm: các pha trung tính (amid, diol, cyanopropyl, cyclodextrin silica); các pha tích điện dương (như amino silica); các pha tích điện âm (như poly(succinimid) silica) và các pha lưỡng cực như zwitterionic (ZIC-HILIC) [34] Một số pha liên kết thường gặp trong thực tế được trình bày dưới đây

a Amid silica

Amid silica là pha liên kết thân nước có chứa nhóm carbomoyl (amid) Nhóm amid ít phản ứng hơn amin và thiếu tính base do đó sự lưu giữ trên các cột này ít nhạy cảm hơn với pH và ít xảy ra sự hấp phụ không thuận nghịch Đồng thời sự

vắng mặt của các nhóm amin cũng giúp loại trừ sự hình thành của base Schiff Cột amid cũng có khả năng phục hồi và ổn định tốt [8]

b Pha liên kết diol

Pha diol là một trong số các pha liên kết đầu tiên được phát triển, mục đích là để giải quyết vấn đề hấp phụ của silica không dẫn xuất Các pha diol liên kết hóa học

có chứa nhóm dihydroxypropyl liên kết với silica, thể hiện tính phân cực cao và đặc tính liên kết hydro, không chứa các nhóm ion khác ngoài các silanol còn lại chưa phản ứng [17] Vì vậy, chúng gần như là lý tưởng cho các ứng dụng HILIC

e Cyanopropyl silica

Cyano propyl silica đã có từ những ngày đầu tiên của sắc ký pha thuận, tuy nhiên

số lượng các ứng dụng của nó trong HILIC được tìm thấy là rất ít Mặc dù chúng được xem là pha phân cực nhưng do không có liên kết hydro nên sự lưu giữ chất phân tích trên pha này rất thấp khi áp dụng trong sắc ký pha thuận cũng như HILIC Một hạn chế khác của pha tĩnh này là sự mất ổn định cơ học khi hoạt động trong điều kiện dung môi phân cực hoặc rất phân cực

d Cột cyclodextrin

Pha liên kết cyclodextrin (CD) dựa trên silica chứa vòng oligosaccharid gồm năm hoặc nhiều cạnh liên kết với các đơn vị α-D-glucopyranosid Vì được hình thành từ các đường có hoạt tính quang học, nên đặc điểm nổi bật của pha CD là có khả năng tách các đồng phân đối quang Và do đó được sử dụng hữu ích cho việc tách các đồng phân quang học trong HILIC

e Amino silica

Các cột amino silica có chứa các aminopropyl liên kết với silica là pha liên kết đầu tiên được sử dụng để tách carbohydrat trong kỹ thuật HILIC Lợi thế của nó so với các pha silica không dẫn xuất là ngăn sự chẻ pic do sự phân hủy anome Các chất phân tích được lưu giữ bởi liên kết hydro và tương tác trao đổi ion với các nhóm silanol Các hợp chất có tính acid cho thấy ái lực tăng mạnh với các cột amino silica, đôi khi có thể dẫn

đến sự hấp phụ không thuận nghịch Một điều đáng lưu ý nữa đối với aminopropyl silica là nó kém ổn định khi dung môi rửa giải là nước, dẫn đến tốc độ giải phóng nhanh các phối tử và hình dáng pic bị xấu đi [17]

f Silica liên kết poly(succinimid) và dẫn xuất

Một số pha tĩnh silica liên kết phân cực được tạo thành dựa trên phản ứng cộng hoá trị của poly (succinimid) với aminopropyl silica Phản ứng tạo ra một lớp bề mặt polyamid/imid liên kết ở nhiều vị trí Một phần vòng poly (succinimid) được

mở ra để tạo thành các liên kết amid với aminopropyl Phần còn lại của vòng dễ phản ứng với tác nhân ái nhân và được sử dụng để sản xuất một loạt các pha tĩnh silica khác nhau Ví dụ, pha tĩnh tích điện âm poly(acid aspartic) hình thành bằng quá trình thủy phân kiềm, pha tĩnh poly (2-sulfoethyl aspartamid) được hình thành bằng phản ứng với taurin Nhiều pha tĩnh poly (succinimid) đã được ứng dụng trong phân tách HILIC nhưng ngày càng ít được sử dụng do hiệu quả tách thấp hơn nhiều

so với các pha tĩnh HILIC gần đây [17]

g Sulfoalkylbetain silica

Một loại pha liên kết đáng chú ý trong HILIC là pha lưỡng cực sulfoalkylbetain zwitterionic Trong pha tĩnh này nhóm chức sulfobetain được cố định lên silica gel xốp hoặc giá đỡ polymer, chứa cả acid sulfonic mạnh và các nhóm amoni bậc bốn được phân cách bởi một đoạn alkyl ngắn Pha liên kết này có khả năng hấp phụ nước mạnh bằng liên kết hydro tạo một lớp nước trên bề mặt pha tĩnh, kiểm soát cơ chế lưu giữ tương tự cơ chế chung của HILIC Các cột zwitterionic được thương mại hóa dưới tên thương mại ZIC-HILIC (liên kết trên silica gel) và ZIC-pHILIC (gắn trên chất mang polyme) Tính chọn lọc phân tách của cột ZIC-HILIC thu được

do sự cân bằng điện tích lưỡng cực 1:1, làm cho cột trung tính và có tương tác ion yếu Tính thân nước mạnh của cấu trúc sufobetain rất thích hợp cho việc tạo lớp nước vô hình trên pha tĩnh ZIC-HILIC cho thấy hiệu quả tách cao và phù hợp với hầu hết các ứng dụng HILIC Cột ZIC-pHILIC dựa trên polymer chứa nhóm chức lưỡng cực sulfobetain giống như ZIC-HILIC và cung cấp các kết quả chọn lọc

tương tự các cột HILIC Một pha liên kết lưỡng cực nữa được biết đến là cHILIC chứa nhóm phosphorylcholin liên kết với silica Cột ZIC-cHILIC được thiết

ZIC-kế cho HPLC và LC-MS của các hợp chất thân nước phân cực và có tính chọn lọc

bổ sung cho RPLC và các cột HILIC khác Sự chọn lọc của ZIC-cHILIC so với ZIC-HILIC: ZIC-cHILIC và ZIC-HILIC có các nhóm chức lưỡng cực định hướng khác nhau, cho thấy sự chọn lọc khác nhau đối với các hợp chất thân nước phân cực Các hợp chất trung tính thường cho thấy sự lưu giữ tương tự trên hai cột

1.2.3 Cơ chế tách và các yếu tố ảnh hưởng

1.2.3.1 Cơ chế tách

Về cơ bản có ba cách để mô phỏng các cơ chế tách Đầu tiên là sự phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh; thứ hai là sự hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt của chất hấp phụ là pha tĩnh; thứ ba sự hấp phụ ưu tiên của pha động hữu cơ lên

bề mặt chất hấp phụ, tiếp theo các chất phân tích phân bố lên lớp hấp phụ này [4] Hiện tượng lưu giữ trong HPLC đồng thời phụ thuộc vào các loại tương tác khác nhau giữa phân tử các chất tan với pha tĩnh, chất tan với pha động và pha động với pha tĩnh Các loại tương tác giữa các phân tử đã được biết đến được cho trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Các loại tương tác giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha động

có thể hình thành giữa cùng một phân tử cũng như giữa hai phân tử khác nhau

- (4 – 17)

Lưỡng cực-lưỡng

cực

Lực xuất hiện giữa hai phân tử

trung hòa điện - (4 – 17) Lưỡng cực-lưỡng

cực cảm ứng

Lực xuất hiện giữa một phân tử phân cực hoàn toàn và một phân tử không phân cực

- (4 – 17)

Lưỡng cực tạm thời và lưỡng cực cảm ứng

Xuất hiện giữa hai phân tử trung hòa điện, nếu đến gần nhau sẽ tạo ra lực tĩnh điện

- (4 – 17)

Tương tác trong phân tử

(Lực Van der Waals)

Lực tương tác yếu giữa các phần của các phân tử riêng biệt, giảm nhanh khi tăng khoảng cách các phân tử, không tạo liên kết bền vững

- (2 – 4)

Tương tác kị nước Lực tương tác xuất hiện trong

môi trường nước giữa các phân

tử sơ nước

-4

Lý thuyết hiện tại cho rằng HILIC lưu giữ do sự phân bố chất phân tích vào hai lớp chất lỏng Pha động là một phần không thể thiếu của pha tĩnh được hấp phụ và tạo nên lớp chất lỏng giàu nước trên bề mặt pha tĩnh phân cực Việc phân tách được thực hiện thông qua việc phân bố các chất tan từ dung dịch rửa giải vào lớp chất lỏng thân nước này Dung môi thường được sử dụng trong pha động HILIC là acetonitril Cơ chế phân tách dựa vào sự phân bố khác nhau của các phân tử chất phân tích giữa pha động acetonitril và một lớp giàu nước hấp phụ trên các pha tĩnh thân nước (xem hình 1.1) Các chất phân tích càng thân nước, càng được phân bố nhiều sang lớp nước cố định trên pha tĩnh và do đó càng có nhiều chất phân tích được giữ lại, thời gian lưu càng dài Nói cách khác, sự phân tách dựa trên sự phân cực của các hợp chất và mức độ solvat hóa Các chất càng phân cực sẽ có thời gian lưu giữ trên cột càng lâu

Khi nồng độ acetonitril (hoặc một số dung môi hữu cơ khác) tăng lên, nước tương tác mạnh hơn với bề mặt của pha tĩnh phân cực (ví dụ, silica không dẫn

xuất) Trong trường hợp này, acetonitril không thể tương tác với silanol còn lại trên các pha tĩnh, do đó, các nhóm silanol sẽ không được che chắn và các phân tử nước

có thể được hấp phụ lên chúng

Khi phân tích với nồng độ acetonitril là từ 30 đến 70%, pha hấp phụ bao gồm ít nhất ba lớp hấp phụ của acetonitril và hỗn hợp nước Điều này tương đồng với các nghiên cứu trước đây đã chứng minh sự hình thành của lớp đa hấp phụ nước trên silica không dẫn xuất Số lượng các đơn lớp hấp phụ của acetonitril tinh khiết là khoảng 2, trong khi đó nước tinh khiết gần 3 Cơ chế tách trong một hệ thống HILIC sử dụng pha tĩnh silica được mô tả trong hình 1.1

Hình 1.1 Cơ chế tách trong một hệ thống HILIC

Tóm lại, khi nồng độ của nước trong pha động thấp hơn 20%, hấp phụ nước có thể là nhiều lớp, và lượng nước hấp phụ có thể cao hơn nhiều so với lượng nước trong dung môi McCalley và Neue kết luận rằng khoảng 4-13% khối lượng lỗ trống của silica được chiếm bởi một lớp giàu nước khi có 75-90% acetonitril trong dung môi Sự hấp phụ dung môi, khi chịu một số tương tác cụ thể, có thể ảnh hưởng lớn đến khả năng chọn lọc của hệ thống HILIC

Lý thuyết phân bố HILIC chỉ được dựa trên bằng chứng gián tiếp Cơ chế của HILIC ngoài phân bố còn có thể chịu sự ảnh hưởng của một số tương tác khác như liên kết hydro, tương tác lưỡng cực, tương tác tĩnh điện yếu, tùy theo các điều kiện dung môi hữu cơ, pha tĩnh được sử dụng để rửa giải và bản chất của chất phân tích

mà mức độ đóng góp của mỗi cơ chế là khác nhau Điều này chỉ ra rằng cơ chế của HILIC là khác biệt so với các phương pháp sắc ký khác Alpert coi tương tác lưỡng cực và liên kết hydro cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng phân bố vào lớp pha tĩnh Yoshida tương tự coi rằng cơ chế lưu giữ của HILIC bao trùm cả liên kết hydro và tương tác lưỡng cực (phụ thuộc vào sự lưỡng cực và phân cực của các phân tử) [4]

Các tương tác tĩnh điện có thể đóng một vai trò quan trọng trong HILIC, do một trong hai nhóm ion đã có mặt trong pha tĩnh Những nhóm silanol còn lại trên bề mặt silica mà không thể được loại bỏ hoặc bị ngăn chặn do hiệu ứng về không gian của các ligand liên kết, được ion hóa một phần Silanol còn lại có thể ảnh hưởng đến khả năng tách các chất phân tích phân cực, đặc biệt là các hợp chất base và các polymer sinh học, vì sự tương tác mạnh (liên kết hydro và lưỡng cực) giữa các nhóm base của chúng với silanol dư được ion hóa Phân tử nước hấp phụ ngăn chặn

sự ion hóa của silanol bề mặt, dẫn đến sự tích điện âm trên bề mặt silica gel Lớp điện tích âm trên bề mặt silica gel này tạo ra một điện trường âm tại bề mặt tiếp xúc với pha động Điện tích dương thu hút bởi điện trường này tạo ra lớp thứ hai của lớp điện kép (Hình 1.2)

Hình 1.2 Lớp điện tích kép trên bề mặt pha tĩnh liên kết

Cơ chế tách cuối cùng của quá trình rửa giải có lẽ là một sự kết hợp giữa tương tác phân bố, tương tác tĩnh điện hoặc liên kết hydro với pha tĩnh

Mức độ mà mỗi cơ chế ảnh hưởng, chi phối đến cơ chế tách chung của HILIC phụ thuộc vào loại pha tĩnh thực tế được sử dụng và các điều kiện pha động như đệm, nồng độ và loại dung môi hữu cơ, loại và nồng độ muối, độ pH và bản chất chất cần phân tích

1.2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng

a, Tỷ lệ nước và dung môi hữu cơ trong pha động

Trong HILIC, khi tăng nồng độ của nước trong pha động sẽ làm giảm lưu giữ, giảm thời gian lưu của chất phân tích Tỷ lệ dung môi hữu cơ sử dụng trong HILIC tác động đến tương tác của dung môi và chất phân tích.Thông thường, khi sử dụng

tỷ lệ cao chất hữu cơ trong pha động (ví dụ acetonitril), hằng số điện môi tương đối của pha động sẽ giảm Giảm hằng số điện môi tương đối sẽ dẫn đến giảm sự ổn

định của ion, tăng pKa của các chất tan

Pha tĩnh

Phối tử hữu cơ

Lớp khuyếch tán

Lớp điện tích dương Silanol dư bị ion hóa

b, Nồng độ đệm

Sự có mặt của muối đệm trong pha động có thể làm giảm tương tác tĩnh điện giữa chất phân tích và pha tĩnh, làm giảm sự lưu giữ của chất phân tích Tuy nhiên trong một số trường hợp, nồng độ muối cao lại đẩy các ion muối hòa tan nhiều hơn vào các lớp nước hình thành trên các hạt pha tĩnh, làm tăng thể tích lớp nước này và

do đó tăng lưu giữ Sự dày lên của lớp nước trên pha tĩnh thông qua hydrat hóa diễn

ra cùng lúc

c, pH đệm

pH đệm quyết định trạng thái tích điện, tính thân nước của chất phân tích và ảnh hưởng đến sự tương tác của chất phân tích với pha tĩnh Ví dụ, các acid ít bị lưu giữ khi sử dụngđệm amoni format Khi sử dụng hệ đệm acid trifluoroacetic (TFA), sự lưu giữ được tăng lên Điều này có thể giải thích là ở pH thấp của đệm TFA, các acid tồn tại ở dạng phân tử, do đó sẽ không chịu lực đẩy của các anion tạo thành từ các nhóm silanol như trường hợp dùng đệm amoni format [4] Như đã trình bày trên phần cơ chế, một tương tác tĩnh điện yếu của các anion và cation trên với các nhóm silinol trên pha tĩnh cũng đóng góp một phần vào cơ chế phân tách của HILIC

d, Nhiệt độ

Ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến phân tách HILIC phụ thuộc vào tính chất của phân tử được lưu giữ, tuy nhiên ảnh hưởng này thường khá nhỏ (ít đáng kể hơn so với trong RP-LC) Với HILIC các yếu tố lưu giữ gần như độc lập với nhiệt độ

1.2.4 Hệ thống phát hiện (Detector)

Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn các loại detector phù hợp Tín hiệu thu được có thể

là độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện…

Detector UV được sử dụng rộng rãi nhất trong sắc kí lỏng Trong HILIC, detector này cũng được sử dụng phổ biến do phạm vi tuyến tính rộng, chi phí tương đối thấp, dễ sử dụng và khả năng tương thích với hầu hết các dung môi pha động trong cả chế độ đẳng dòng và gradient Đối với các chất phân tích hấp thụ UV-VIS yếu thì detector khối phổ (MS) và detector aerosol tích điện (CAD) là những lựa chọn thay thế thích hợp Đây là một trong những ưu điểm lớn của HILIC sẽ được trình bày trong phần ưu nhược điểm (phần 1.3) Các detector khác dựa trên sự bay hơi dung môi như detector tán xạ bay hơi (ELSD) và detector phát hiện chất phân tích khối lượng nano (NQAD) cũng có thể được lựa chọn Các detector ít được sử dụng phổ biến hơn như chỉ số khúc xạ (RID), điện hóa và huỳnh quang (FLD) cũng

có thể phù hợp với các điều kiện của HILIC trong các ứng dụng cụ thể Tuy nhiên, ELSD và RID có những hạn chế nhất định về độ chính xác, độ nhạy, phạm vi phát hiện và RID cũng không tương thích với chế độ gradient Hai detector MS và CAD

sẽ được trình bày cụ thể ở dưới đây

1.2.4.1 Detector MS

Hai chế độ ion hoá hay dùng trong MS là chế độ ion hóa phun điện tử (ESI) hoặc ion hoá tại áp suất khí quyển (APCI) Cả hai chế độ này đều yêu cầu pha động dễ bay hơi Pha động giàu chất hữu cơ kết hợp với đệm dễ bay hơi của HILIC đặc biệt phù hợp với cả hai chế độ này Pha động nhiều chất hữu cơ nên dễ bay hơi, tăng hiệu quả ion hóa, cải thiện độ nhạy khi sử dụng ESI-MS Nồng độ của đệm dễ bay hơi cần được kiểm soát, thông thường từ 5-20 mM, do nồng độ đệm cao làm giảm tín hiệu ESI Để tăng tín hiệu của ESI, ta có thể bổ sung các dung môi không proton hoặc các alcol mạch dài sau cột, mặc dù việc pha loãng này có thể làm giảm độ nhạy Nguồn APCI ít bị ảnh hưởng bởi các hiệu ứng ức chế ion hơn nguồn ESI, và thời gian phục hồi cho đáp ứng APCI cũng ngắn hơn [34]

1.2.4.2 Detector CAD

Trong CAD, chất từ cột sắc ký được khí hóa với một dòng khí dẫn nitơ (hoặc không khí) để tạo ra các giọt sau đó được sấy khô để loại bỏ các thành phần dễ bay

hơi và dung môi pha động, tạo ra các hạt phân tử chất phân tích Các hạt này được

va chạm với các khí mang điện, tích điện và chuyển sang bộ phận thu nhận tín hiệu Phân tử càng lớn thì càng tích nhiều điện và tín hiệu thu được sẽ càng mạnh Như vậy, CAD là detector phụ thuộc vào khối lượng và tương tác của nó không phụ thuộc vào tính chất quang phổ hay tính chất lý hoá của các chất phân tích Theo lý thuyết, CAD có thể tạo đáp ứng như nhau cho các lượng chất phân tích giống nhau CAD có độ nhạy cao hơn ELSD, tín hiệu tạo ra bởi CAD ít bị ảnh hưởng bởi kích thước giọt hoặc sự phân bố kích thước của nó Tuy nhiên, tính tuyến tính của CAD chỉ duy trì được ở một khoảng nồng độ hẹp Ngoài ra, do đường kính của giọt liên quan đến một số yếu tố như mật độ và độ nhớt của pha động, phản ứng trong CAD cũng phụ thuộc vào thành phần pha động Lượng dung môi hữu cơ cao trong pha động dẫn đến hiệu quả bay hơi tốt hơn, do đó lượng chất phân tích đến được detector nhiều và thu được tín hiệu cao hơn Như vậy, yếu tố đáp ứng sẽ thay đổi đáng kể với thành phần pha động trong chế độ gradient Điều này có thể giải quyết bằng một gradient nghịch đảo sau cột

1.3 Ưu nhược điểm của HILIC

1.3.1 Ưu điểm

1.3.1.1 Ưu điểm chung

- Tương tự các kĩ thuật sắc ký khác, việc sử dụng HILIC cho phép phân tích đồng thời nhiều hợp chất Điều này thực sự hiệu quả khi cần phân tích các mẫu có thành phần phức tạp hay hỗn hợp nhiều chất

- Kỹ thuật HILIC được tiến hành thuận lợi, cho kết quả tương đối nhanh, kết quả thu được có độ chính xác và độ nhạy tốt

- Việc HILIC sử dụng pha động có nồng độ dung môi hữu cơ cao giúp pha động có

độ nhớt thấp do đó có thể tiến hành được ở áp lực thấp hơn, độ nhớt thấp cũng cho phép cột có khả năng làm việc ở tốc độ dòng cao, giảm thời gian phân tích Pha động giàu hữu cơ cũng làm tăng tốc độ khuếch tán chất tan trong pha động, tăng khối lượng chất tan được vận chuyển

- HILIC cho thấy sự tương thích và phù hợp với hệ thống phát hiện khối phổ MS,

bộ nguồn ESI

- HILIC có tương thích dung môi tốt khi sử dụng cùng với SPE sử dụng hạt nhồi C8, C18…(PR/SPE) Các dung môi rửa giải dùng trong RP/SPE thường là các dung môi dùng trong sắc ký pha đảo, tương thích với HILIC Thông thường các dung dịch rửa giải từ SPE này sẽ ít bị lưu giữ trên hệ sắc ký RPLC Với NPLC, cần bay hơi dung môi và hoà tan lại trong dung môi phù hợp với sắc ký pha thuận

1.3.1.2 Ưu điểm so với sắc ký pha đảo và pha thuận

Sắc ký phân bố pha đảo được sử dụng khá phổ biến do sử dụng dung môi thân nước và phù hợp với nhiều đối tượng chất phân tích Tuy nhiên, một trong những nhược điểm chính của RPLC là khả năng lưu giữ kém với các chất rất phân cực HILIC khắc phục được nhược điểm này của RPLC

Đối với NPLC việc sử dụng các dung môi pha động đắt tiền, độc hại và không thân thiện với môi trường như heptan, hexan, pentan, cyclohexan là một nhược điểm chính của kỹ thuật này Sử dụng HILIC giúp giải quyết nhược điểm đó khi pha động được thay thế bằng các dung môi an toàn và thân thiện hơn như acetonitril, methanol Bên cạnh đó, các chất phân tích phân cực khó tan trong dung môi pha động của NPLC Hạn chế này được khắc phục khi sử dụng pha động chứa nước và dung môi hữu cơ đồng tan với nước trong HILIC

Bên cạnh đó HILIC thể hiện ưu điểm so với sắc ký truyền thống trong việc kết hợp detector khối phổ với bộ nguồn ESI Việc kết nối dịch rửa giải từ NPLC với ESI bị hạn chế do hiệu quả ion hóa từ dung môi hoàn toàn hữu cơ, không phân cực của NP kém và độ nhạy giảm Vấn đề này có thể được giải quyết bằng cách điều chỉnh các điều kiện ion hóa thông qua việc bổ sung trực tiếp hoặc thêm vào sau cột các dung môi phân cực và các chất bổ trợ ở đầu vào của nguồn ion hóa Tuy nhiên, những cải tiến kỹ thuật này lại cần được lắp đặt thêm các thiết bị như máy bơm hoặc bộ trộn sẽ không thuận tiện cho phân tích thông thường Để tách các hợp chất

nhất [18],[121] Ưu điểm của sự kết hợp này bao gồm: tăng độ nhạy trong ESI-MS; tiết kiệm thời gian đáng kể do có thể sử dụng tốc độ dòng cao hơn [31]

1.3.2 Nhược điểm

Bên cạnh những ưu điểm và lợi thế của mình kỹ thuật HILIC vẫn còn một số những nhược điểm và hạn chế như:

- Thời gian đạt được cân bằng lâu hơn RPLC

- Pha tĩnh silica kém lưu giữ các anion

- Những nghiên cứu và hiểu biết về cơ chế còn hạn chế, chưa thống nhất, ảnh hưởng bởi nhiều loại tương tác khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích, pha tĩnh và pha động

- Chưa có những cột pha tĩnh đa năng và tối ưu như cột C18 trong RPLC

- Phụ thuộc quá nhiều vào dung môi acetonitril, khó tìm lựa chọn thay thế

CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG THỰC TẾ CỦA SẮC KÝ HILIC

Việc thể hiện rõ được ưu điểm của mình trong phân tích các hợp chất phân cực, thân nước đã khiến HILIC nhận được nhiều sự quan tâm gần đây Cùng với đó số lượng các ứng dụng của HILIC cũng ngày một tăng lên, các ứng dụng của HILIC đa dạng cả về đối tượng phân tích và đối tượng mẫu, như sử dụng HILIC để phân tích các kháng sinh, acid amin hay carbohydrat,…trong cả chế phẩm cũng như các mẫu sinh học như máu, huyết tương, huyết thanh

Có nhiều ví dụ về việc áp dụng HILIC vào phân tích các phân tử nhỏ phân cực như nucleosid, nucleotid, acid amin hay peptid ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Khi thực hiện tổng quan này chúng tôi mong muốn có một thống kê về những ứng dụng của HILIC trên thế giới áp dụng trên các đối tượng khác nhau

Để có được danh sách những ứng dụng của HILIC từ trước đến nay chúng tôi sử dụng phương pháp tìm kiếm sau:

Tìm kiếm trên trang chủ của Web of Science với các từ khóa: “Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography” (Sắc ký lỏng tương tác thân nước), “HILIC”,

“Pharmaceutical analysis” (Phân tích dược phẩm), “Drug analysis” (Phân tích thuốc), “Lactam Antibiotics” (Kháng sinh nhóm β-lactam), “Aminoglycoside” (aminoglycosid), “Amino acid” (acid amin) chúng tôi tìm được tất cả 1421 bài báo Lọc bằng tiêu đề các bài viết có liên quan đến ứng dụng được 572 bài Sau đó, tiếp tục lọc bằng phần tóm tắt và toàn bộ bài báo còn lại 414 bài Tất cả được chúng tôi tổng hợp, chia thành các nhóm theo đối tượng phân tích và những nhóm đối tượng

có nhiều ứng dụng được tìm thấy nhất được chúng tôi liệt kê trong các phần dưới đây để dễ theo dõi, bao gồm 6 nhóm đối tượng với 110 ứng dụng

2.1 Ứng dụng HILIC trong phân tích các acid amin, peptid và protein

Phân tích các acid amin (AA) từ trước đến nay chủ yếu sử dụng RPLC với phương pháp tạo dẫn xuất hoặc sắc ký tạo cặp ion Kỹ thuật tạo dẫn xuất cho phép

phát hiện bằng huỳnh quang nên có thế được ứng dụng tốt cho phân tích acid amin Tuy nhiên hiệu suất tạo dẫn xuất có thể khó lặp lại Thêm vào đó kỹ thuật tạo dẫn xuất rất tốn kém chi phí và thời gian AA có thể là hợp chất thân nước hay không thân nước, tồn tại ở dạng ion hay phân tử tùy từng trường hợp Các AA là các phân

tử lưỡng tính, tương tự peptid và protein, chúng có thể tồn tại dưới dạng một acid yếu hoặc một base yếu, tùy thuộc vào pH Và mỗi AA sẽ tồn tại ở các dạng khác nhau trong các điều kiện pH và pha động khác nhau, do vậy khi lựa chọn các pha động, pha tĩnh, pH và gradient phù hợp, có thể tách đồng thời nhiều AA cùng một lúc [5],[9],[14],[15],[32],[43],[71],[90],[119],[129],[135]

Các peptid được thủy phân bằng các enzym từ protein HILIC hiện đại có thể thực hiện với rất nhiều phần mềm và phần cứng tự động hóa để giảm tổng thời gian phân tích Với các cơ chế tương tác phân bố, liên kết hydro hoặc trao đổi ion, HILIC có khả năng tách rất tốt Điều này cũng đúng trong trường hợp các peptid và protein tuy liên kết hydro hay trao đổi ion có ảnh hưởng ít hơn với các chất này Lợi ích của HILIC so với RPLC không chỉ liên quan đến khả năng lưu giữ các hợp chất thân nước, mà còn ở độ nhớt thấp và khả năng bay hơi tốt của pha động do tỷ lệ dung môi hữu cơ cao Nhiều nghiên cứu ứng dụng HILIC trong tách và định lượng các peptid [6],[22],[28],[37],[45],[49],[78],[80],[86],[96],[104],[103],[128], [137], [150]

Đối với các protein chưa thủy phân số lượng ứng dụng tìm thấy là không nhiều

do tương tác của chúng với pha tĩnh lớn Các chất phân tích chủ yếu được lưu giữ trong HILIC nhờ liên kết hydro và tương tác ion Trong cấu trúc của protein, có nhiều nhóm cho nhận hydro và các nhóm tích điện do đó, các protein có khuynh hướng dính vào bề mặt của pha tĩnh HILIC nên rất khó rửa giải với pha động có tỷ

lệ nước nhỏ Dựa trên sự suy đoán này, HILIC có thể không thích ứng với tất cả các loại protein Đến nay, HILIC đã được sử dụng thành công cho các protein khó giải quyết bằng phương pháp HPLC khác [28],[150]

Trong HILIC, các hợp chất này được phân tích trên các nền mẫu rất đa dạng như

từ đất [71], thực vật [14], động vật [135], dịch sinh học và mô của động vật [5],[28],[49],[84],[104] và người [43],[96],[119],[131],[133] và các mô tuyến giáp [119], thuốc [126] hay thực phẩm [3],[37],[137]

Pha tĩnh thường sử dụng trong các ứng dụng này là các cột amid [3],[5],[9],[14],[32],[49],[71],[103],[119],[129],[131],[135],[150] ngoài ra có thể sử dụng các pha tĩnh lưỡng cực ZIC-HILIC [28],[45],[78],[84],[86],[90],[104],[133] hay pha tĩnh silica [6],[15],[37],[43],[80],[126],[137] hoặc amin [96],[128] Thành phần pha động chủ yếu sử dụng ACN cùng với đệm amoni format Việc sử dụng thành phần pha động này giúp cho ứng dụng HILIC trở nên tương thích với detector khối phổ MS, đó là lí do tại sao MS được sử dụng phổ biến với nhóm ứng dụng này Bảng 2.1 trong phần phụ lục trích dẫn tóm tắt các nghiên cứu trên acid amin, peptid và protein với các thông số cụ thể hơn cho từng phương pháp được xây dựng

và đối tượng mẫu

2.2 Ứng dụng của HILIC trong phân tích kháng sinh

Kháng sinh là nhóm đối tượng cũng được ứng dụng nhiều trong HILIC đặc biệt đối với nhóm kháng sinh aminoglycosid Các aminoglycosid (AG) rất phân cực và thiếu các nhóm mang màu trong phân tử do đó rất khó để phân tách chúng trong RPLC với detector UV Để giải quyết vấn đề, các kháng sinh này thường được tạo dẫn xuất hay sử dụng trao đổi ion Tuy nhiên việc tạo dẫn xuất khiến quá trình phân tích tốn nhiều thời gian và có thể gặp các vấn đề đối với định lượng Việc sử dụng HILIC-MS trong các ứng dụng này thuận lợi hơn do không cần đến quá trình tạo dẫn xuất cũng như các cột trao đổi ion đắt tiền Lợi thế rõ rệt cũng thấy được trong ứng dụng trên các nhóm kháng sinh khác Một số ứng trên đối tượng này như [24],[33],[66],[74],[92],[101],[114],[117]

Penicillin và cephalosporin là các phân tử nhỏ và phân cực nên khó được phân

chất phân cực này [13],[21],[36],[85] Các ứng dụng chủ yếu sử dụng pha tĩnh là các cột silica [19],[21],[74],[85],[95],[105],[111],[117] hoặc pha lưỡng cực ZIC-HILIC [24],[30],[36],[62],[92],[101],[114] một số ít dùng cột amid [108] hoặc amin [26],[47] Thành phần pha động đơn giản với ACN, nước và có thể có thêm amoni format là tương thích để sử dụng cùng một detector khối phổ MS [19, [24],[33],[66],[85],[88],[92],[105],[108],[117]

Đối với nhóm kháng sinh tetracyclin (TC) sử dụng các cột silica có độ tinh khiết cao trong HILIC có thể ngăn chặn được các tương tác không chọn lọc như tạo phức chelat với ion kim loại hay tác động ion dẫn đến sự phân tách không thuận lợi [26],[47],[95]

Bên cạnh β-lactams, AG và TC, HILIC đã được sử dụng rộng rãi để phân tích các nhóm kháng sinh khác như nhóm carbapenem [19],[105],[111],[115], colistin [108], aminoglycosid [24],[33],[66],[88],và quinolon [30],[85],[117]

Bảng 2.2 trong phần phụ lục tóm tắt lại các nghiên cứu ứng dụng của HILIC trong phân tích kháng sinh

2.3 Ứng dụng của HILIC trong phân tích các nucleotid, nucleosid, nucleobase

Nucleobase, nucleosid, nucleotid là những thành phần cơ bản của tất cả các tế bào, tạo nên những acid nucleic khác nhau và có vai trò quan trọng nhiều phản ứng enzym, quá trình trao đổi chất hay chỉ thị sinh học Vì vậy, việc phân tích các đối tượng này là vô cùng quan trọng Đối với các chất chuyển hóa phân cực như nhóm này, HILIC là một giải pháp tốt cải thiện sự lưu giữ mà tương thích được tốt với

MS HILIC đã được quan tâm và phát triển gần đây, rất nhiều các ấn phẩm nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả phân tách tốt các nucleosid và nucleotid

Bảng 2.3 trong phần phụ lục tóm tắt một số ứng dụng trong phân tích nucleosid, nucleotid, nucleobase được thực hiện trên HILIC

Có thể thấy việc phân tích được tiến hành trên các nền mẫu rất đa dạng từ thực vật [16],[35],[60],[75], động vật [100], dịch sinh học của người như huyết tương [50],[110], nước tiểu [118], mô [38], dịch chiết vi sinh vật [52], trong thực phẩm [82] và nhiều các hỗn hợp khác [29],[38],[50] Pha tĩnh được sử dụng thường là các cột amid [16],[35],[55],[60],[75],[100],[107],[110],[118],[136] ngoài ra còn có pha tĩnh lưỡng cực ZIC-HILIC [29],[109],[120], amonipropyl [38], silica [50],[52], amin [82] hay cột titan dioxid [147] [147] Pha động được sử dụng cũng rất đa dạng trong đó được hay dùng nhất vẫn là acetonitril để tương thích với detector MS [10],[16],[29],[38],[50],[52],[75],[82],[94],[100],[107],[109],[110], chỉ có một số ít nghiên cứu sử dụng detector UV [118],[147]

2.4 Ứng dụng của HILIC trong phân tích phospholipid

Lipid đóng một vai trò quan trọng trong việc dự trữ năng lượng, là chỉ thị sinh học cho các tình trạng sinh lý và bệnh lý như ung thư, nhiễm trùng, tiểu đường Những tiến bộ trong LC/MS đã cho phép lipid được nghiên cứu với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Phân tích MS thông thường của lipid thường được thực hiện bằng cách bơm trực tiếp hoặc sử dụng RPLC hoặc NPLC Tuy nhiên, cả RPLC và NPLC đều có những nhược điểm nhất định RPLC lưu giữ lipid tốt, tuy nhiên không tách được hoàn toàn các lipid theo nhóm Điều này là do cơ chế tương tác trong sắc ký đảo của lipid là dựa trên mức độ thân lipid của chúng, được điều chỉnh bởi độ dài chuỗi cacbon và số lượng liên kết đôi Kết quả là, hiện tượng các lipid trong cùng nhóm rửa giải đồng thời trong RP là khá phổ biến NPLC cho phép tách và định tính các nhóm lipid khác nhau nhưng thời gian tách và cân bằng kéo dài Hơn nữa, các pha động thường sử dụng cho NP như cloroform hoặc hexan rất khó xử lý do tính

dễ bay hơi và độc tính của chúng, đồng thời cũng không tương thích với ESI-MS, là detector hay sử dụng trong phân tích sinh học để đạt được độ nhạy mong muốn

Sử dụng HILIC trong phân tích lipid có một số ưu thế: tiến hành nhanh hơn, tăng

độ phân giải, độ nhạy, độ lặp lại, tách các lipid phân cực tốt hơn so với RPLC và

tiến hành nhanh hơn NPLC Chính vì những ưu điểm có được nên HILIC ngày càng được sử dụng nhiều trong phân tích lipid

Bảng 2.4 trong phần phụ lục tóm tắt một số ứng dụng của HILIC trong phân tích các phospholipid

HILIC được sử dụng cho phân tích phospholipid trong các nền mẫu đa dạng như

từ thực vật [54],[102],[138] từ cơ thể người [62], động vật [127] hay trong sữa [40],[67] Cũng giống như với các đối tượng khác phân tích phospholipid bằng HILIC thường sử dụng pha động ACN/Nước cùng với đệm amoni acetat [54],[62],[102], hay đệm amoni format [40],[150] Pha tĩnh được sử dụng rất đa dạng từ các cột silica không dẫn xuất [11],[40],[62],[73],[102],[127], cột ZIC-HILIC [138], pha liên kết diol [54],[150] MS là detector ứng dụng cho hầu hết nhóm đối tượng này [11],[40],[54],[62],[67],[102],[127],[138],[150] Ngoài ra có một ứng dụng tìm được sử dụng detector ELSD [73]

2.5 Ứng dụng của HILIC trong phân tích carbohydrat

Việc phân tích carbohydrat là một thử thách đối với các nhà nghiên cứu vì những khó khăn trong việc tách và phát hiện Do chúng có đồng phân lập thể ở nhiều nguyên tử cacbon, sự tồn tại của các cấu trúc phân nhánh, liên kết chéo, và một vài

sự khác biệt trong cấu trúc ba chiều nên số lượng các đồng phân carbohydrat là rất lớn làm cho việc tách chúng rất khó khăn Các nhóm hydroxyl của carbohydrat là những acid rất yếu, và có thể bị ion hoá dưới điều kiện kiềm mạnh (pH > 12) nên chúng được tách ra bằng sắc ký trao đổi anion trong điều kiện base

Gần đây, việc sử dụng các phương pháp HILIC trong phân tích carbohydrat không tạo dẫn xuất đã được nghiên cứu do sự phát triển số lượng cột đa dạng cho các chế độ tách khác nhau Trong số đó có thể thấy một số lượng lớn ứng dụng sử dụng cột liên kết silica amid [12],[48],[57],[70],[77],[81],[93],[106],[122],[177] ; cột diol [72]; cột amin [58],[81]; silica [22] được sử dụng cùng với nhiều loại detector: MS [2],[48],[57],[70],[72],[93],[106],[122]; IR [58]; CAD [81]; Huỳnh

quang [70]; ELSD [93], …Pha động được yêu thích vẫn là acetonitril cùng với nước

và một lượng đệm amoni acetat [48],[57],[122] Ngoài ra, một số đệm như amoni hydroxid [77],[106] hay amoni format [22],[72] cũng được sử dụng

Bảng 2.5 trong phần phụ lục tóm tắt các ứng dụng HILIC trong phân tích carbohydrat

2.6 Ứng dụng của HILIC trong phân tích các chất dẫn truyền thần kinh

Các chất dẫn truyền thần kinh monoamin là những amin sinh học quan trọng kiểm soát nhiều quá trình sinh lý và nhận thức, tham gia kiểm soát và điều chỉnh các chức năng não khác nhau Phân tích các chất dẫn truyền thần kinh này cùng với tiền chất và các chất chuyển hóa của chúng có ý nghĩa quan trọng trong đánh giá hoạt động của hệ thần kinh, chúng cũng là những chỉ thị sinh học trong chẩn đoán

và điều trị một số bệnh liên quan đến chức năng thần kinh như bệnh Parkinson [1], bệnh Alzheimer [27]…Vì vậy việc phân tích đồng thời nhiều monoamin khác nhau trong các mẫu sinh học phức tạp có giá trị lâm sàng cho chẩn đoán và giám sát nhiều rối loạn Tuy nhiên, do nồng độ thấp trong dịch sinh học và bản chất phân cực của các hợp chất này, nên việc phân tích các chất dẫn truyền thần kinh, tiền chất và chất chuyển hóa của chúng là một thách thức lớn, yêu cầu một công cụ phân tích nhạy cảm, nhanh và hiệu quả

Hiện nay, nhiều phương pháp tách được phát triển cho phân tích sinh học của các chất dẫn truyền thần kinh: điện di mao quản (CE), sắc ký khí cùng với quang phổ khối (GC-MS), sắc ký lỏng (LC) kết hợp với detector huỳnh quang (FLD) và detector điện hóa (ECD) đã được báo cáo để xác định các monoamin trong các mẫu khác nhau Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn mẫu, việc sử dụng cột trao đổi ion đắt tiền và việc tạo dẫn xuất làm kéo dài thời gian phân tích HILIC là phương pháp thay thế thích hợp để giải quyết các vấn đề trên

mà vẫn đảm bảo lưu giữ để tách tốt và tương thích với MS cho độ nhạy cao HILIC

sử dụng để phân tích các chất dẫn truyền thần kinh trong các mẫu khác nhau như

nước tiểu người [92], mô người [13],[142],[132], não chuột [20],[116],[148], não khỉ [142] hay các tế bào nuôi cấy [125], mẫu thực phẩm [145] Các ứng dụng được liệt kê trong bảng 2.6 trong phần phụ lục Pha tĩnh thường được sử dụng có thể là pha lưỡng cực ZIC-HILIC [13],[33],[125],[132],[142], pha liên kết amid [20],[63],[92], ngoài ra là các pha tĩnh silica không dẫn xuất [116] hoặc pha liên kết polyhydroxethyl [142] Pha động chính được sử dụng là ACN/nước cùng với đệm amoni format [13],[63],[92],[116],[132] , thích hợp sử dụng cùng detector MS [20],[33],[92],[132],[145]

2.7 Ứng dụng của HILIC trên các đối tượng phân tích khác

Phần trên chỉ là một số lượng nhất định các ứng dụng của HILIC đã được tìm thấy Số lượng bài báo tìm được về ứng dụng của HILIC là 414 bài, đủ để cho thấy ứng dụng rộng rãi của nó Bên cạnh các đối tượng được trình bày ở trên, HILIC còn được tìm thấy ứng dụng trong các đối tượng khác như: các thuốc thân nước[16],[39],[51],[64],[89],[97] flavonoid và các chất có nguồn gốc thiên nhiên [41],[59],[112],[149], các chất chuyển hóa [11],[46],[61],[91],[134], ADN và các thành phần tế bào [42],[68],[79],[110], các chỉ thị sinh học trong chẩn đoán và theo dõi một số bệnh [7],[44],[83],[142],[146] và nhiều các hợp chất phân tử nhỏ phân cực và hợp chất ion khác Nhờ vậy, HILIC trở thành một công cụ phân tích hiệu quả trong các ngành khoa học: hóa dược, nghiên cứu chuyển hóa, proteomics, glycomics, y học, nông nghiệp và hóa học thực phẩm

2.8 Thực tế ứng dụng HILIC ở Việt Nam

Một số lượng lớn ứng dụng của HILIC trên thế giới chứng tỏ đây là một phương pháp phân tích hiệu quả và ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm Tuy nhiên, ở Việt Nam phương pháp này chưa được biết đến nhiều Chúng tôi tìm được hai ứng dụng HILIC được tiến hành ở Việt Nam Cả hai ứng dụng được tiến hành tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh trên đối