Xây dựng phương pháp định lượng paracetamol và methionin trong chế phẩm pasafe bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ THỊ PHƢƠNG HUẾ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG PARACETAMOL VÀ METHIONIN TRONG CHẾ PHẨM PASAFE BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ THỊ PHƢƠNG HUẾ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG PARACETAMOL VÀ METHIONIN TRONG CHẾ PHẨM PASAFE BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Phạm Thị Thanh Hà Ths Vũ Ngân Bình Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội hướng dẫn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Vũ Ngân Bình Lời tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Vũ Ngân Bình người thầy trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, ln động viên khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực khóa luận Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ động viên tơi hồn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, người thân gia đình ln tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên suốt q trình học tập, nghiên cứu Cuối xin kính chúc thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc thành công công việc sống Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Vũ Thị Phƣơng Huế MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Đặc điểm paracetamol methionin 1.1.2 Một số phương pháp phân tích acid amin paracetamol 1.2 Tổng quan sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc 1.2.1 Pha tĩnh 1.2.2 Pha động 1.2.3 Cơ chế tách 1.2.4 Ưu điểm 10 1.2.5 Nhược điểm 11 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 12 2.2 Nguyên vật liệu 12 2.2.1 Hóa chất 12 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 12 2.3 Nội dung nghiên cứu 13 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.4.1 Khảo sát bước sóng phát 13 2.4.2 Khảo sát pha tĩnh 13 2.4.3 Khảo sát pha động 14 2.4.4 Khảo sát nồng độ định lượng paracetamol methionin 15 2.4.5 Thẩm định quy trình 15 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1.Quy trình chuẩn bị mẫu 19 3.1.1 Chuẩn bị mẫu thử 19 3.1.2 Chuẩn bị mẫu tự tạo 21 3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 21 3.1.4 Chuẩn bị mẫu thử thêm chuẩn 22 3.1.4.1 Các mẫu thử thêm chuẩn methionin 22 3.1.4.2 Các mẫu thử thêm chuẩn paracetamol 23 3.2 Quy trình chuẩn bị dung mơi pha động 24 3.3 Khảo sát diều kiện sắc ký 25 3.3.1 Lựa chọn bước sóng phát 25 3.3.2 Khảo sát pha tĩnh 26 3.3.3 Khảo sát pha động 29 3.3.3.1 Khảo sát thành phần pha động 29 3.3.3.2 Khảo sát tốc độ dòng 31 3.3.4 Khảo sát nồng độ định lượng methionin paracetamol 32 3.4 Phƣơng pháp phân tích methionin paracetamol 33 3.5 Thẩm định phƣơng pháp 33 3.5.1 Độ thích hợp hệ thống (system suitability) 33 3.5.2 Độ chọn lọc (selectivity) 34 3.5.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính (linearity) 35 3.5.4 Độ xác phương pháp (precision) 36 3.5.5 Độ (accuracy) 37 3.5.6 Độ ổn định phương pháp (robustness) 37 3.6 Ứng dụng phƣơng pháp phân tích chế phẩm viên nang mềm thị trƣờng 42 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ Phụ lục 2: Kết độ ổn định phƣơng pháp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Hydrophilic Interaction Liquid Sắc ký lỏng tương tác thân Chromatography nước PAR Paracetamol Paracetamol MET Methionine Methionin NP - LC Sắc ký lỏng pha thuận UV Normal Phase Liquid Chromatography Reversed Phase Liquid Chromatography Ultraviolet RSD (%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn HILIC RP - LC Sắc ký lỏng pha đảo Tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích acid amin paracetamol Bảng 2.1 Các điều kiện pha động khảo sát 14 Bảng 3.1 Kết độ đồng khối lượng viên nang mềm Pasafe 19 Bảng 3.2 Quy trình pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp 22 Bảng 3.3 Quy trình pha mẫu thêm chuẩn methionin 23 Bảng 3.4 Quy trình pha mẫu thêm chuẩn paracetamol 24 Bảng 3.5 Quy trình pha dung dịch formic formic thêm DEA 25 Bảng 3.6 Kết độ ổn định hệ thống 33 Bảng 3.7 Kết độ chọn lọc 34 Bảng 3.8 Kết khảo sát đường chuẩn 35 Bảng 3.9 Kết độ xác phương pháp 36 Bảng 3.10 Kết độ paracetamol 37 Bảng 3.11 Kết độ methionin 37 Bảng 3.12 Kết đánh giá độ ổn định phương pháp 39 Bảng 3.13 Kết định lượng paracetamol chế phẩm 43 Bảng 3.14 Kết định lượng methionin chế phẩm 43 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo paracetamol Hình 1.2 Chuyển hóa paracetamol gan Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo methionin Hình 1.4 Chế phẩm viên nang mềm Pasafe Hình 1.5 Cơ chế tách HILIC 10 Hình 3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu thử 21 Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV paracetamol methionin 26 Hình 3.3 Kết khảo sát cột Zorbax CN bước sóng 210 nm 27 Hình 3.4 Kết khảo sát cột silica bước sóng 210 nm 28 Hình 3.5 Kết khảo sát số dung môi thân nước cột Zorbax Rx Silica 29 Hình 3.6 Kết khảo sát nồng độ DEA 30 Hình 3.7 Kết khảo sát tốc độ dòng 31 Hình 3.8 Mối tương quan diện tích píc nồng độ PAR (100 - 300 ppm) Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 33 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích píc nồng độ paracetamol methionin Ảnh hưởng chung yếu tố khảo sát lên đáp ứng 36 40 Mức độ ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên hàm lượng methionin 40 Mức độ ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên thời gian lưu methionin 41 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện có nhiều chế phẩm đa thành phần có chứa acid amin hoạt chất thuộc nhóm khác Trong chế phầm này, acid amin sử dụng với mục đích làm tăng tác dụng điều trị giảm tác dụng không mong muốn hoạt chất khác Một chế phẩm có dạng phối hợp chế phẩm chứa paracetamol methionin Paracetamol có tác dụng giảm đau, hạ sốt, dùng q liều gây độc tính gan Methionin acid amin có chưa lưu huỳnh, có tác dụng làm giảm độc tính paracetamol gan, phòng ngừa tổn thương gan [2] Có nhiều phương pháp định lượng riêng paracetamol methionin, chưa có cơng bố phương pháp định lượng hai hoạt chất chế phẩm Về mặt hóa học, paracetamol methionin có tính chất khác Paracetamol có độ phân cực trung bình, định lượng sắc ký lỏng pha đảo Tuy nhiên methionin có độ phân cực mạnh, lưu giữ khơng phân tích sắc ký lỏng pha đảo Sắc ký lỏng tương tác thân nước sử dụng pha tĩnh pha động phân cực, phân tích chất phân cực acid amin, đồng thời có khả lưu giữ chất có độ phân cực trung bình paracetamol Chính vậy, tơi tiến hành thực đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng acid amin chế phẩm đa thành phần sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc” đối tượng cụ thể viên nang mềm Pasafe có chứa thành phần paracetamol methionin với mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích paracetamol methionin sắc ký lỏng tương tác thân nước - Ứng dụng phương pháp để định lượng paracetamol methionin chế phẩm CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Đặc điểm paracetamol methionin Paracetamol (PAR), gọi acetaminophen, sản xuất lần vào năm 1877 [11] Paracetamol thuốc giảm đau, hạ sốt, khơng có hiệu điều trị viêm [2] Paracetamol tương đối không độc với liều điều trị dùng hướng dẫn thầy thuốc Liều tối đa khuyến nghị cho người trưởng thành từ đến gam ngày Tuy nhiên, dùng liều paracetamol nguyên nhân gây suy gan cấp [2] Paracetamol có cơng thức cấu tạo hình 1.1: Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo paracetamol Danh pháp: N-(4-hydroxyphenyl) acetamid Tên khác: acetaminophen Công thức phân tử: C8H9NO2 Phân tử lượng: 151,2 g/mol Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng, khơng mùi Hơi tan nước, khó tan cloroform, ether, methylen clorid, dễ tan dung dịch kiềm, ethanol 96% [1] Bảo quản: 2ºC - 8ºC, tránh ánh sáng Paracetamol chuyển hóa chủ yếu gan (90%), gắn kết với sunfat glucuronid, thải nước tiểu Một phần (5%) thải nước tiểu dạng không chuyển hóa, 5% lại oxy hóa thành N – acetyl – p – benzoquinone imine (NAPQI) qua cytochrome P450 gan NAPQI chất độc cho tế bào gan Với liều paracetamol thích hợp tạo lượng nhỏ NAPQI, lượng nhanh chóng kết hợp với glutathion gan, tạo thành chất không độc thải nước tiểu Tuy nhiên sử dụng paracetamol liều cao, đường gắn kết với sulfat glucuronid bị bão hòa, lượng paracetamol bị chuyển thành NAPQI tăng lên Đến lượng dự trữ glutathion gan giảm xuống khoảng 70%, NAPQI bắt đầu phản ứng với cấu trúc tế bào gan gây tổn thương tế bào gan [2] Hình 1.2 miêu tả q trình chuyển hóa paracetamol gan CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích methionin paracetamol sau: - Quy trình chuẩn bị mẫu: Cân xác khoảng 1,03 g thuốc nang (tương ứng với 100 mg methionin 500 mg paracetamol) vào bình định mức 50 mL.Thêm 30 mL NaOH 0,01%, lắc định mức vừa đủ NaOH 0,01% Trộn hỗn hợp bình định mức, sau cho vào ống ly tâm Đem ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút vòng 10 phút Hút dịch xylanh, sau lọc qua màng lọc 0,45 µm vào cốc có mỏ Hút xác 0,50 mL dịch lọc trên, cho vào bình định mức 25,0 mL, định mức vừa đủ MP, thu dung dịch mẫu thử định lượng methionin Hút xác 2,00 mL dung dịch A vào bình định mức 10,0 mL, định mức vừa đủ MP, thu dung dịch mẫu thử định lượng paracetamol - Điều kiện sắc ký: Pha tĩnh: Cột Zorbax Rx Silica 150 x 4,6 mm; 5µm Pha động: hỗn hợp ACN : (acid formic 10 mM, DEA mM) = 60 : 40 (v/v) Tốc độ dòng: 0,6 mL/phút Bước sóng phát hiện: 210 nm methionin 254 nm paracetamol Thể tích tiêm mẫu: 20 µL - Thẩm định quy trình theo hướng dẫn ICH mơ hình Plackett Burman – linear thu kết đạt tiêu chí sau: + Độ ổn định hệ thống + Độ chọn lọc + Đường chuẩn + Độ xác phương pháp + Độ + Độ ổn định phương pháp - Định lượng chế phẩm viên nang mềm Pasafe hàm lượng 500 mg paracetamol methionin: đạt hàm lượng theo tiêu chuẩn chung viên nang mềm Dược điển Việt Nam V 45 4.2 Kiến nghị Dựa kết nghiên cứu, xin đưa vài đề xuất sau: - Áp dụng phương pháp để định lượng lô khác chế phẩm viên nang mầm Pasafe - Có thể áp dụng phương pháp với chế phẩm có acid amin khác nhiều acid amin - Trong trình khảo sát, thực tế phương pháp tách thêm số acid amin khác, methionin cystein chế phẩm Lobamine - Cysteine có lưu hành thị trường Việt Nam Do vậy, tiến hành thẩm định phương pháp với methionin cystein để ứng dụng định lượng, mà không cần khảo sát thay đổi điều kiện sắc ký thêm - Sử dụng diethylamin để khắc phục tình trạng kéo píc cột silica nghiên cứu khác 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học, Hà Nội, tr 626 – 729 Bộ Y Tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam 4, Y học, Hà Nội, tr 754 - 1120 Nguyễn Văn Rư Nguyễn Xuân Thắng (2015), Hoá sinh học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Tiếng Anh Bernard A Olsen Brian W Pack (2013), Hydrophilic Interaction Chromatography Mark F.Vitha, ed, Tập 177, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, pp 102 Bogusław Buszewski Sylwia Noga (2012), "Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) — a powerful separation technique", Analytical and bioanalytical chemistry 402(1), pp 231-247 Buszewski B., Noga S (2012), ―Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) – a powerful separation technique‖, Anal Bioanal Chem, 402, pp 231247 D Fekkes, Van Dalen A Edelman M (1995), "Validation of thedetermination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography using automated pre-column derivatization with o-phthaldialdehyde", Journal of chromatography B, pp 177 -186 Hemström P and Irgum K (2006), ―Hydrophilic interaction chromatography‖, Journal of Separation Science, 29(12), pp 1784-1821 Iulia Varzaru, Arabela Elena Untea, Teodor Martura, Margareta Olteanu, Tatiana Dumitra Panaite, Maria Schitea, Ilie Van (2013), ―Development and Validation of an RP-HPLC Method for Methionine, Cystine and Lysine Separation and Determination in Corn Samples‖, Revista de chimie, 64 7, pp 673 – 680 10 Malerod H., Rogeberg M., Tanaka N et al (2013), ―Large volume injection of aqueous peptide samples on a monolithic silica based zwitterionic-hydrophilic interaction liquid chromatography system for characterization of posttranslational modifications‖, Journal of Chromatography A, 1317, pp 129-137 11 Mangus, Brent C., Miller, Michael G (2005), Pharmacology application in athletic training, Philadelphia, pp 39 12 NV Komarova, JS Kamentsev Solomonova (2004), "Determination of amino acids in fodders and raw materials using capillary zone electrophoresis", Journal of chromatography B 800(1), pp 135-143 13 Palled Mahes, Karagane Swapnalee, Mane Aruna, Bhat Anilchandra, Shinde Prashanti (2013), ―Analytical Method Development And Validation Of Acetaminophen, Caffeine ,Phenylephrine Hydrochloride And Dextromethorphan Hydrobromide In Tablet Dosage Form By Rp - Hplc‖, International Journal of Pharmaceutical Science Invention, pp – 15 14 Praveen Kumar, Antoni Rubies Ramon Companyó (2012), "Hydrophilic interaction chromatography for the analysis of aminoglycosides", Journal of separation science 35(4), pp 498-504 15 Raymond C R., Paul J S., Marian E Q (2009), Handbook of pharmaceutical excipients, Pharmaceutical Press, USA 16 Ruiping Li, Yi Zhang Lee (2010), "Development and validation of a hydrophilic interaction liquid chromatographic method for determination of aromatic amines in environmental water", Journal of chromatography A 1217(11), pp 1799-1805 17 SeQuant A (2008), Practical Guide to HILIC: A Tutorial and Application Book, Umea Sweden 18 Shane M Rutherfurdand G Sarwar Gilani (2009), ―Amino acid analysis‖, Current Protocols in Science, 11.9.1 – 11.9.37 19 Thermo Scientific, ―HILIC Seperations Technical Guide: A Practiceal Guide to HILIC Mechanisms, Method Development and Troubleshooting‖ 20 USP 38 (2015), Imipenem and Cilastatin forinjection 21 Y Vander Heyden, A Nijhuis, J Smeyers-Verbeke, B G.M Vandeginste, D L Massart (2001), ―Guidance for robustness/ruggedness tests in method validation‖, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 24(5-6), 723–753 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ Sắc ký đồ độ ổn định hệ thống bước sóng 210 nm Sắc ký đồ độ ổn định hệ thống bước sóng 254 nm Sắc ký đồ độ chọn lọc bước sóng 210 nm Sắc ký đồ độ đặc hiệu bước sóng 254 nm Sắc ký đồ đường chuẩn MET bước sóng 210 nm Sắc ký đồ đường chuẩn PARA bước sóng 254 nm Phụ lục 2: Kết độ ổn định phƣơng pháp Ảnh hưởng yếu tố nồng độ acid formic, nồng độ DEA, tốc độ dòng, tỷ lệ ACN, bước sóng phát hiện, loại cột lên hàm lượng methionin Ảnh hưởng yếu tố nồng độ acid formic, nồng độ DEA, tốc độ dòng, tỷ lệ ACN, bước sóng phát hiện, loại cột lên hàm lượng paracetamol Ảnh hưởng yếu tố nồng độ acid formic, nồng độ DEA, tốc độ dòng, tỷ lệ ACN, loại cột lên thời gian lưu methionin Ảnh hưởng yếu tố nồng độ acid formic, nồng độ DEA, tốc độ dòng, tỷ lệ ACN, loại cột lên thời gian lưu paracetamol Ảnh hưởng yếu tố nồng độ acid formic, nồng độ DEA, tốc độ dòng, tỷ lệ ACN, bước sóng phát hiện, loại cột lên độ cân xứng píc methionin Ảnh hưởng yếu tố nồng độ acid formic, nồng độ DEA, tốc độ dòng, tỷ lệ ACN, bước sóng phát hiện, loại cột lên độ cân xứng píc paracetamol ... mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích paracetamol methionin sắc ký lỏng tương tác thân nước - Ứng dụng phương pháp để định lượng paracetamol methionin chế phẩm CHƢƠNG 1: TỔNG...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ THỊ PHƢƠNG HUẾ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG PARACETAMOL VÀ METHIONIN TRONG CHẾ PHẨM PASAFE BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC KHÓA... 1.2 Tổng quan sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc Sắc ký lỏng tương tác thân nước (hydrophilic interaction liquid chromatography – HILIC) biến thể sắc ký lỏng thơng thường, có hiệu việc tách chất phân