Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng artesunat và dihydroartemisinin trong huyết tương bằng LC MS MS

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH HÙNG MÃ SINH VIÊN: 1201289 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁPĐỊNH LƯỢNG ARTESUNAT VÀ DIHYDROARTEMISININ TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH HÙNG MÃ SINH VIÊN: 1201289 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁPĐỊNH LƯỢNG ARTESUNAT VÀ DIHYDROARTEMISININ TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn TS: Nguyễn Thị Thuận ThS: Ngô Quang Trung Nơi thực viện Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia Hà Nội-2017 LỜI CẢM ƠN Trước tiên cho phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Thuận- cô giáo trực tiếp hướng dẫn tận tình giúp đỡ suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Ngô Quang Trung, thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên môn Hóa dược viện Công nghệ dược phẩm quốc gia quan tâm tạo điều kiện để hoàn thành tốt khóa luận Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đặc biệt bạn Nguyễn Thị Ngọc, Chu Huy Kiên, Lê Thị Quỳnh Nguyễn Thị Bích Ngọcđã quan tâm giúp đỡ, động viên tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập thực khóa luận Do thời gian thực kiến thức thân có hạn, khóa luận nhiều thiếu sót Tôi mong nhận góp ý thầy cô, bạn bè để khóa luận hoàn thiện Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Lê Đình Hùng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dihydroartemisinin artesunat .2 1.1.1 Công thức cấu tạo tính chất hóa lý DHA ART 1.1.2 Đặc điểm dược động học ART DHA 1.2 Các phương pháp định lượng đồng thời ART DHA huyết tương 1.2.1 Định lượng đồng thời ART DHA huyết tương HPLC 1.2.2 Định lượng đồng thời ART DHA huyết tương LC-MS 1.3 Tổng quan kỹ thuật LC-MS 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Nguyên tắc 1.3.3 Cấu tạo nguyên lý vận hành hệ thống khối phổ [1] 1.3.4 Một số chế độ thu phổ 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .13 2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất 13 2.1.3 Thiết bị dụng cụ: .13 2.2 Nội dung nghiên cứu .14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Chuẩn bị mẫu phân tích 14 2.3.2 Khảo sát xây dựng phương pháp 16 2.3.3 Thẩm định phương pháp 17 2.4 Ứng dụng thực tế 21 2.5 Phương pháp xử lý kết .21 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp 22 3.1.1 Xác định điều kiện khối phổ 22 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng 23 3.2 Thẩm định phương pháp 25 3.2.1 Sự phù hợp hệ thống sắc ký 25 3.2.2 Độ chọn lọc/đặc hiệu 26 3.2.3 Độ nhiễm chéo 27 3.2.4 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 28 3.2.5 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LLOQ) 30 3.2.6 Độ đúng, độ lặp lại 33 3.3 Ứng dụng thực tế 36 3.4 Bàn luận 38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Đề xuất 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ACPI AOAC ART ARN C18 DĐVN IV DHA ESI ESI EtOAc FDA HPLC HQC HT KST IS LC-MS/MS LOD LQC LLOQ MQC MeCN MeOH MS P.A PĐ r R% RSD SD SKD SPE Chú thích Ion hóa học áp suất thường Hiệp hội nhà hoá phân tích thống Artesunat Artemisinin Cột Octadecylsilan Dược điển Việt Nam IV Dihydroartemisinin Ion hóa phun điện tử Ion hóa tia điện Ethyl acetat Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ Sắc ký lỏng hiệu cao Mẫu kiểm tra nồng độ cao Huyết tương Ký sinh trùng Chuẩn nội Sắc ký lỏng khối phổ Giới hạn phát Mẫu kiểm tra nồng độ thấp Giới hạn định lượng Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình Acetonitril Methanol Khối phổ Tinh khiết phân tích Pha động Hệ số tương quan Độ thu hồi Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Sinh khả dụng Chiết pha rắn Spic TB TĐSH TCCS Diện tích pic Trung bình Tương đương sinh học Tiêu chuẩn sở Tltk Tài liệu tham khảo tR Thời gian lưu giữ ULOQ Giới hạn định lượng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số nghiên cứu định lượng ART DHA huyết tương Bảng 2.1: Danh mục chất chuẩn 13 Bảng 2.2: Danh mục thuốc thử 13 Bảng 2.3: Cách pha dung dịch chuẩn hỗn hợp ART DHA 15 Bảng 2.4: Bảng nồng độ mẫu QC 15 Bảng 2.5: Cách pha dung dịch chuẩn QC 16 Bảng 2.6: Cách chuẩn bị mẫu 16 Bảng 3.1: Các thông số detector khối phổ 23 Bảng 3.2: Kết phù hợp hệ thống 26 Bảng 3.3: Kết xác định tính đặc hiệu độ chọn lọc 27 Bảng 3.4: Kết đánh giá độ nhiễm chéo 28 Bảng 3.5: Kết xác định hệ số weighting 28 Bảng 3.6: Kết khảo sát đường chuẩn ART 29 Bảng 3.7: Kết khảo sát đường chuẩn DHA 30 Bảng 3.8: Kết xác định giới hạn định lượng ART 31 Bảng 3.9: Kết xác định giới hạn định lượng DHA 32 Bảng 3.10: Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại ngày ART 33 Bảng 3.11: Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại ngày DHA 33 Bảng 3.12: Kết xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày ART 34 Bảng 3.13: Kết xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày DHA 35 Bảng 3.14: Nồng độ ART huyết tương chó theo đường chuẩn 36 Bảng 3.15: Nồng độ DHA huyết tương chó theo đường chuẩn 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Công thức cấu tạo DHA Hình 1.2: Công thức cấu tạo ART Hình 1.3 Cấu tạo thiết bị khối phổ Hình 3.1 Phổ Scan dung dịch chuẩn đặc ART, DHA, ARN 22 Hình 3.2 Phổ product ion dung dịch chuẩn đặc 22 Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch ART qua cột SB-C18 (2,1 x 50 mm;1,8 µm) 24 Hình 3.4 Cột Rp Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD 24 Hình 3.5 Sắc ký đồ pha động 1: acid acetic 0,1% : MeCN : MeOH (45:15:40) 24 Hình 3.6 Sắc ký đồ pha động 2: acid acetic 0,1% : MeCN : MeOH (45:25:30) 25 Hình 3.7 Sắc ký đồ pha động 3: acid acetic 0,1% : MeCN : MeOH (55:5:40) 25 Hình 3.8 Sắc ký đồ pha động 4: acid acetic 0,1% : MeCN (55:45) 25 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dich ART, DHA, IS/MeOH nồng độ 50,100,100 ng/ml 26 Hình 3.10 Sắc ký đồ huyết tương trắng 27 Hình 3.11 Sắc ký đồ HT trắng pha IS 27 Hình 3.12 Sắc ký đồ HT trắng pha ART, DHA nồng độ LLOQ 27 Hình 3.13 Giới hạn phát ART 31 Hình 3.14 Giới hạn phát DHA 32 Hình 3.15 Đồ thị nồng độ ART HT chó theo thời gian 37 Hình 3.16 Đồ thị nồng độ DHA HT chó theo thời gian 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Artesunate (ART) dẫn xuất bán tổng hợp artemisinin (ARN), thành phần hoạt chất Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua) Cả ARN, ART có khả diệt Plasmodium falciparum P vivax đa kháng thuốc nên trở thành vị cứu tinh hàng ngàn bệnh nhân sốt rét toàn giới Ngoài tác dụng trên, tác dụng tế bào ung thư ART nghiên cứu [10] Kết ban đầu cho thấy, ART có tác dụng lên nhiều dòng tế bào khối u ác tính Để thực nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) tương đương sinh học (TĐSH) thuốc nói chung ART nói riêng, yêu cầu quan trọng phải có quy trình phân tích định lượng thuốc dịch sinh học Quá trình phân tích thuốc dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn nồng độ thuốc mẫu thường thấp có nhiều tạp chất Hệ thống phân tích LC-MS đời bước nhảy vọt kỹ thuật phân tích, tạo điều kiện cho nhà khoa học thực nghiên cứu SKD phức tạp Với ưu điểm vượt trội độ nhạy tính đặc hiệu cao, kỹ thuật phân tích ngày áp dụng nhiều nghiên cứu chế phẩm có hàm lượng thấp Tuy nhiên Việt Nam kỹ thuật mẻ khả ứng dụng hạn chế Nhằm mục đích tạo sở cho việc đánh giá SKD TĐSH thuốc chứa ART tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng artesunat dihydroartemisinin huyết tương LCMS/MS” với nội dung sau: Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời ART DHA huyết tương Đánh giá phương pháp vừa xây dựng Ứng dụng xác định nồng độ ART, DHA số mẫu huyết tương chó giá trị định lượng với giá trị thực có mẫu Xác định độ lặp lại cách tính toán độ lệch RSD% giá trị lần định lượng Kết xác định LLOQ LOD DHA trình bày bảng 3.9 hình 3.14 Bảng 3.9:Kết xác định giới hạn định lượng DHA Mẫu trắng STT S picDHA S picDHA Mẫu chuẩn (≈10 ng/ml) S picIS Nồng độ tìm Độ đúngb Đạt/ thấya (µg/ml) (%) Không đạt 69 9,3 90,0 Đạt 200 215 70 9,7 93,4 Đạt 197 68 9,2 88,8 Đạt 185 210 66 67 9,5 9,4 91,5 90,7 Đạt Đạt 200 65 10,6 102,2 Đạt TB 201 68 RSD (%) Đáp ứng TB mẫu trắng/mẫu LLOQ 9,6 5,3 92,8 5,3 0,5 Đạt Khảo sát mẫu chuẩn DHA nồng độ khoảng 5,0 ng/ml Hình 3.14 Giới hạn phát DHA Dùng phần mềm máy tính tỷ số S/N kết thu LODDHA = 5,0 ng/ml Như với DHA giới hạn xác định 5,0 ng/ml, giới hạn định lượng 10 ng/ml 32 3.2.6 Độ đúng, độ lặp lại Độ đúng, độ lặp lại ngày Kết độ độ lặp lạitrong ngày ART thể bảng 3.10 Bảng 3.10:Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại ngày ART LQC MQC HQC a b a b Nồng độ Độ Nồng độ Độ Nồng độa Độ đúngb (ng/ml) (%) (ng/ml) (%) (ng/ml) (%) 13,7 90,2 507,4 98,3 788,0 105,7 13,3 87,3 486,6 94,3 799,6 107,3 13,9 91,5 535,7 103,8 763,3 102,4 13,0 85,2 457,2 88,6 722,1 96,9 15,0 98,6 478,8 92,8 717,6 96,3 14,9 97,7 470,0 91,1 702,4 94,3 TB 13,9 91,8 489,3 94,8 748,8 100,5 5,9 5,9 5,8 5,8 5,9 5,9 RSD(%) a: tính theo phương trình hồi quy b: % so với nồng độ thực Mẫu ART Bảng 3.10 cho thấy phương pháp định lượng có độ ngày mức nồng độ từ nằm giới hạn cho phép 85-115%; độ lặp lại ngày với giá trị RSD đạt yêu cầu < 15% Như vậy, độ độ lặp lại ngày phù hợp với phương pháp phân tích dịch sinh học Kết độ độ lặp lại ngày DHA thể bảng 3.10 Bảng 3.11:Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại ngày DHA LQC Mẫu DHA Nồng độa (ng/ml) TB 31,3 29,5 31,0 26,8 29,7 31,2 30,0 MQC Độ đúngb (%) 104,1 98,1 103,1 89,2 98,8 103,8 99,5 HQC Nồng độa (ng/ml) Độ đúngb (%) 592,1 592,1 581,6 557,2 520,1 533,9 562,8 114,1 114,1 112,1 107,4 100,3 102,9 108,5 33 Nồng độa Độ đúngb (ng/ml) (%) 755,8 668,8 701,3 699,2 755,9 696,0 712,8 100,9 89,3 93,6 93,3 100,9 92,9 95,1 RSD(%) 5,7 5,7 5,5 5,5 5,0 a: tính theo phương trình hồi quy b: % so với nồng độ thực 5,0 Bảng 3.11 cho thấy phương pháp định lượng có độ ngày mức nồng độ từ nằm giới hạn cho phép 85-115%; độ lặp lại ngày với giá trị RSD đạt yêu cầu < 15% Như vậy, độ độ lặp lại ngày phù hợp với phương pháp phân tích dịch sinh học Độ đúng, độ lặp lại khác ngày Kết độ độ lặp lạikhác ngày ART thể bảng 3.12 Bảng 3.12:Kết xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày ART LQC MQC HQC a b a b a Ngày Nồng độ Độ Nồng độ Độ Nồng độ Độ đúngb (ng/ml) (%) (ng/ml) (%) (ng/ml) (%) 13,7 90,2 507,4 98,3 788,0 105,7 13,3 87,3 486,6 94,3 799,6 107,3 13,9 91,5 535,7 103,8 763,3 102,4 I 13,0 85,2 457,2 88,6 722,1 96,9 15,0 98,6 478,8 92,8 717,6 96,3 14,9 97,7 470,0 91,1 702,4 94,3 15,8 103,2 472,3 91,5 666,0 89,4 15,7 102,4 452,8 87,8 698,8 93,8 14,0 91,8 451,3 87,5 698,0 93,7 II 17,4 113,9 456,3 88,4 698,3 93,7 15,2 99,3 459,6 89,1 657,1 88,2 14,1 92,4 504,9 97,9 655,0 87,9 15,7 103,4 468,5 109,0 744,2 108,2 17,5 115,4 453,7 105,6 739,8 107,6 17,2 113,3 455,1 105,9 751,2 109,2 III 17,3 114,0 492,5 114,6 760,3 110,6 17,0 112,1 439,2 102,2 744,2 108,2 16,7 109,8 431,2 100,3 564,5 82,1 TB 101,2 97,2 98,6 9,9 8,5 9,0 RSD% 34 Kết cho thấy ba nồng độ 15,0; 500,0 750,0 ng/ml, phương pháp cho độ khoảng 85 -115 %với giá trị RSD < 15% chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có độ độ lặp lại cao, đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học Kết độ độ lặp lại khác ngày DHA thể bảng 3.13 Bảng 3.13:Kết xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày DHA LQC MQC HQC a b a b Nồng độ Độ Nồng độ Độ Nồng độa Độ đúngb Ngày (ng/ml) (%) (ng/ml) (%) (ng/ml) (%) 31,3 104,1 592,1 114,1 755,8 100,9 29,5 98,1 592,1 114,1 668,8 89,3 31,0 103,1 581,6 112,1 701,3 93,6 I 26,8 89,2 557,2 107,4 699,2 93,3 29,7 98,8 520,1 100,3 755,9 100,9 31,2 103,8 533,9 102,9 696,0 92,9 30,0 99,0 530,4 102,2 661,9 88,3 36,1 119,2 545,1 105,1 652,8 87,1 30,8 101,6 529,7 102,1 654,8 87,4 II 32,2 106,2 527,8 101,7 693,4 92,5 32,0 105,6 521,4 100,5 640,2 85,4 31,1 102,7 499,5 96,3 665,5 88,8 28,1 93,2 375,7 98,3 706,7 95,2 28,2 93,5 393,5 103,0 713,2 96,3 34,9 115,7 392,5 102,7 731,1 99,1 III 30,6 101,4 368,8 96,5 729,7 98,9 30,8 102,1 383,1 100,2 722,7 97,8 33,8 111,8 383,1 100,2 780,2 91,1 TB 102,7 103,3 93,3 7,3 5,2 5,3 RSD% Kết trình bày bảng 3.13 cho thấy ba nồng độ 30,0; 500,0 750,0 ng/ml, phương pháp cho độ khoảng 85 -115 %với giá trị RSD 35 < 15% chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có độ độ lặp lại cao, đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học 3.3 Ứng dụng thực tế Dùng phương pháp định lượng vừa xây dựng để xác định hàm lượng ART DHA số mẫu huyết tương chó chuẩn bị mục 2.4 Nồng độ ART huyết tương chó thể bảng 3.14 Bảng 3.14: Nồng độ ART huyết tương chó theo đường chuẩn Dung dịch Thời điểm lấy SpicART SpicIS Tỷ số mẫu* (giờ) Spic_ART/SpicIS 160 76 2,1053 C1 157 70 2,2429 C2 183 74 2,4730 C3 332 73 4,5479 C4 235 72 3,2639 C5 360 67 5,3731 C6 560 69 8,1159 C7 1800 73 24,6575 C8 1150 66 17,4242 C9 2395 66 36,2879 C10 0,00 72 0,0000 Zero 0,25 339 71 4,7746 T1 0,50 249 67 3,7164 T2 0,75 233 66 3,5303 T3 1,00 234 74 3,1622 T4 1,50 189 73 2,5890 T5 2,00 72 0,0000 T6 4,00 70 0,0143 T7 * Thời điểm lấy mẫu tính từ khi chó uống thuốc Nồng độ (ng/ml) 5,1 10,1 20,3 81,0 50,7 101,3 202,6 810,4 506,5 1013,0 0,0 93,5 58,8 52,6 40,5 20,7 0,0 0,0 Từ kết phân tích dung dịch chuẩn (C1-C10) xác định đường chuẩn ART y = 0,0302x + 1,9444 với r = 0,9943 hệ số weighting 1/x2 Sự biến đổ nồng độ ART huyết tương theo thời gian biễu diễn đồ thị 3.15 36 Lưu ý: T0 thời điểm lấy mẫu sau chó uống chế phẩm chứa ART Theo lý thuyết chưa có hấp thu nên nồng độ ART thời điểm với đường uống ng/ml Nồng độ ART/HT (ng/ml) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0.5 1.5 2.5 Thời3.5gian (h)4 Hình 3.15 Đồ thị nồng độ ART HT chó theo thời gian Nồng độ DHA huyết tương chó thể bảng 3.15 Bảng3.15: Nồng độ DHA huyết tương chó theo đường chuẩn Dung dịch Thời điểm lấy SpicDHA SpicIS Tỷ số mẫu* (giờ) Spic_DHA/SpicIS 250 76 3,2895 C1 421 74 5,6892 C2 255 73 3,4932 C3 420 72 5,8333 C4 286 67 4,2687 C5 2000 69 28,986 C6 715 73 9,7945 C7 2097 66 31,7727 C8 1058 66 16,0303 C9 0,00 72 0,0000 Zero 0,25 278 71 3,9155 T1 0,50 256 67 3,8209 T2 0,75 241 66 3,6515 T3 1,00 266 74 3,5946 T4 1,50 240 73 3,2877 T5 2,00 229 72 3,1806 T6 4,00 70 0,0000 T7 * Thời điểm lấy mẫu tính từ chó uống thuốc 37 Nồng độ (ng/ml) 10,5 84,2 21,0 108,4 52,6 841,6 210,4 1052,0 526,0 0,0 33,3 30,4 24,0 21,8 11,2 6,8 0,0 Từ kết phân tích dung dịch chuẩn (C1-C9) xác định đường chuẩn DHA y = 0,0282x + 2,9726 với r = 0,9910và hệ số weighting 1/x2 Sự biến đổ nồng độ DHA huyết tươngtheo thời gian biễu diễn đồ thị 3.16 Lưu ý: T0 thời điểm lấy mẫu sau chó uống chế phẩm chứa ART Do chưa có hấp thu ART nên chưa có chuyển hóa ART thành DHA nên nồng độ Nồng độ DHA/HT (ng/ml) DHA thời điểm với đường uống ng/ml 40 35 30 25 20 15 10 0 0.5 1.5 2.5 3.5 Thời gian (h) Hình 3.16 Đồ thị nồng độ DHA HT chó theo thời gian Nhận xét: Sau kể từ lúc uống chế phẩm chứa ART ART DHA máu gần thải trừ hoàn toàn Cmax = 93,5 ng/ml vào thời điểm 0,25 với ART 33,3 ng/ml với DHA vào thời điểm 0,25 3.4 Bàn luận Phương pháp xử lý mẫu Có hai phương pháp áp dụng để xử lý mẫu tài liệu tham khảo: Phương pháp chiết pha rắn nhìn chung có giới hạn định lượng thấp Tuy nhiên phương pháp tốn kém, quy trình xử lý mẫu phức tạp nên chọn phương pháp chiết lỏng lỏng Khi chiết lỏng lỏng, thời gian chiết dài, thành phần huyết tương phức tạp dễ dẫn tới phá hủy cấu trúc ART DHA 38 (cầu nối peroxid) nên dùng dung dịch K2Cr2O7 nước (0,4M) để hạn chế phá hủy cấu trúc theo hướng dẫn tài liệu tham khảo [22] Phương pháp phân tích Trong phân tích LC-MS không thiết phải tách hoàn toàn chất sắc ký lỏng hiệu cao, nhiên điều kiện (MS) phân tích DHA ART cho đáp ứng hệ sắc ký lỏng hiệu cao phải tách DHA ART Điều kiện sắc ký hiệu cao đảm bảo tách hai thành phần với thời gian lưu khác Do đặc điểm phân tích dịch sinh học, chất phân tích thường có nồng độ nhỏ, yêu cầu đặt phải xây dựng phương pháp định lượng đồng thời ART DHA có giới hạn định lượng thấp, đảm bảo áp dụng phương pháp vào thực tế Phương pháp xây dựng có LLOQART = ng/ml LLOQDHA = 10 ng/ml đáp ứng yêu cầu Ngoài kết tiêu thẩm định trình bày trên, FDA yêu cầu tiêu độ ổn định huyết tương sau chu kỳ đông rã, độ ổn định huyết tương điều kiện bảo quản -30oC dài ngày, độ ổn định huyết tương sau điều kiện phòng, độ ổn định mẫu xử lý autosampler 24 Chúng tiến hành thẩm định tất tiêu Kết tiêu đạt yêu cầu, chứng tỏ phương pháp vừa xây dựng sử dụng thực tế cho phương pháp định lượng hoạt chất huyết tương Về ứng dụng phương pháp Phương pháp phù hợp để xác định hàm lượng ART DHA huyết tương phù hợp với tài liệu tham khảo [7,13] DHAvà ART đạt nồng độ Cmaxsau 0,25 (Cmax_DHA= 33,3 ng/ml Cmax_ART = 93,5 ng/ml).Điều ART chuyển hóa nhanh thành DHA ART loại khỏi huyết tương vòng DHA tồn huyết tương lâu ART DHA bị chuyển hóa tiếp thành chất khác loại bỏ khỏi thể ART tiếp tục chuyển hóa thành DHA Mặc dù nồng độ đỉnh 39 ART cao so với DHA DHA có hoạt tính cao ART nên tác dụng dược lý chế phẩm bị ảnh hưởng nhiều nồng độ DHA máu Tuy nhiên, việc tiến hành thí nghiệm chó chưa đủ chứng để kết luận yếu tố sinh khả dụng cần có nghiên cứu khác với quy mô lớn 40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Trong khóa luận này, qua trình nghiên cứu thực nghiệm, hoàn thành mục tiêu đề ra:  Đã xây dựng phương pháp định tính, định lượng ART DHA huyết tương LC-MS/MS sau:  Chất chuẩn nội ARN  Điều kiện xác định: Nguồn ion hóa ESI+, phương pháp khối phổ MS/MS, mảnh xác định 407,1 → 261,0(163,0) với ART 307,0 → 261,0(163,0) với DHA 305,2 → 151,0(263,0) với ARN  Điều kiện sắc ký: Cột Rp Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD (2,1x50 mm; 1,8 µm) Pha động acid acetic 0,1%:MeCN (55:45) Tốc độ dòng 0,3 ml/phút, thể tích tiêm mẫu µl  Đã tiến hành thẩm định theo hướng dẫn FDA thẩm định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học.Phương pháp vừa xây dựng có độ chọn lọc cao, khoảng tuyến tính tốt (r = 0,9989 cho ART 0,9972 với DHA), độ lặp lại tốt (RSDART = 5,7% RSDDHA =5,4%), độ tốt (85,2107,3 ART 89,3-114,1% DHA), đạt yêu cầu cho phương pháp định lượng dịch sinh học FDA  Đã ứng dụng phương pháp vừa xây dựngxác định nồng độ ART DHA số mẫu huyết tương chó uống chế phẩm chứa ART với liều 2,5mg/kg thể trọng 4.2 Đề xuất Phương pháp vừa xây dựng có độ tin cậy cao, phù hợp với điều kiện có số sở kiểm nghiệm Việt Nam Vì đề nghị áp dụng phương pháp vào thực tế nhằm nghiên cứu thông số dược động học sinh khả dụng thuốc 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, Tập 2, NXB Y Học, tr.107-117 Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học Bộ Y tế (2002), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất Y học Nguyễn Đức Tào cộng (1994),Những kết ban đầu đánh giá tác dụng dược lý lâm sàng artesunat công ty Dược liệu TW I sản xuất, Tạp chí dược học số 2, tr11 Mai Tất Tố, Dược lý, Tập 2, Nhà xuất Y học, tr.78 Tiếng Anh A.M Almeida, M.M Castel-Branco, A.C Falcao(2002), “Linear regression for calibration lines revisited: weighting schemes for bioanalytical methods” Journal of Chromatography B, 774 (2002), pp 215–22 Association of Official Analytical Chemists (2002), "Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals” Carrie A Morris, Stephan Duparc, Isabelle Borghini-Fuhrer, Donald Jung, Chang-Sik Shin and Lawrence Fleckenstein, (2011), “Review of the clinical pharmacokinetics of artesunate and its active metabolite dihydroartemisinin following intravenous, intramuscular, oral or rectal administration”, Malaria journal, 11(132) pp 123-126 Crespo-Ortiz M.P , Wei M.Q (2011), “Antitumor activity of artemisinin and its derivatives : from a well-known antimanarial agent to a potential anticancer drug”, Journal of biomedicine & biotechnology, 2012, pp 1-18 10 Eferth T et al (2001) “ The anti-malarial artesunate is also active against cancer”, International Journal on Oncology, 18 pp 767-733 11 Europian Union Reference Laboratory (2002), “Commission Decision 2002/657/EC - Validation of Methods Fundamentals”, Freiburg 12 Food and Drug Administration(2001),“Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation” 13 Himanshu Naik, Daryl J Murry, L.E Kirsch, Lawrence Fleckenstein,(2005) “Development and validation of a high-performance liquid chromatography–mass spectroscopy assay for determination of artesunate and dihydroartemisinin in human plasma”, Journal of Chromatography B, 816, pp- 233–242 14.IUPAC Analytical Chemistry Division (2013), “Definitions of terms relating to massspectrometry (IUPAC Recommendations 2013)” pp 46 15 Joanne Gartland, Thermo Fisher Scientific, Runcorn, Cheshire,(2011) “Analysis of Artesunate and Dihydroartemisinin Using a Core Enhanced Technology Accucore HPLC Column”, Thermal scientific, 1011, pp-1-2 16 Koning Lee O (2007), “Progress in Malaria Research”, Nova Sciences Publishers, vol.1, pp 72 17.Liu, J.M.; Ni, M.Y.; Fan, J.F.; Tu, Y.Y (1979), "Structure and reaction of arteannuin", Acta Chimica Sinica, 37, pp 129–140 18 Melissa M.Kiser and John W.Dolan (2004), “ Selecting the Best Curve Fit”, LCGC NORTH AMERICAL, vol.22(2), pp112-117 19 Michaelis M,et al.(2010),“Anti-cancer effects of artesunate in a panel of chemoresistant neuroblastoma cell lines”, Biochemical Pharmacology,79, pp130136 20 Mike Sargent, (2013) “Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements”, RSC Analytical Methods Committee, pp-4 21 Natalija Nakov*, Jasmina Tonic-Ribarska, Aneta Dimitrovska, Rumenka Petkovska (2014), “Statistical approach for selection of regression model during validation of bioanalytical method”, Макед фарм билт, Vol 60(1), pp19 – 25 22 Niklas Lindegardh,Warunee Hanpithakpong,Benjamas Kamanikom,Janhom Pattayaso,Pratap Singhasivanon,Nicholas J White &Nicholas PJ Day (2011), “Quantifiation of dihydroartemisinin, artesunate and artemisinin in human blood: overcoming the technical challenge of protecting the peroxide bridge”, Bioanalysis , 3(14), pp-1613-1624 23 Nosten François, White Nicholas J (2007), “Artemisinin-Based Combination Treatment of Falciparum Malaria”, American Society of Tropical Medicine and Hygiene, vol 77(6) ,pp 132 24 Paktiya Teja-Isavadharm, Duangsuda Siriyanonda, Nitima Chanarat, Raveewan Siripokasupkul ,Roongnapa Apinan, Apassorn Lim, Srisombat Wannaying, David Saunders, Mark M Fukuda, Robert S Miller, Peter J Weina and Victor Meléndez (2010),“A Simplified Liquid Chromatography -Mass Spectrometry Assay for Artesunate and Dihydroartemisinin, Its Metabolite, in Human Plasma”, Molecules, 15, pp-8747-8768 25 Piero Olliaro,Surash Ramanathan,Michel Vaillant, Stephanie E Reuter, Allan M Evans, Srivicha Krudsood, Sornchai Looareesuwan, Jean-René Kiechel ( 2010),” Pharmacokinetics and Comparative Bioavailability of Artesunate and Mefloquine Administered Separately or as a Fixed Combination Product to Healthy Volunteers and Patients with Uncomplicated Plasmodium falciparum Malaria”, Journal of Bioequivalence & Bioavailability, Volume 2(3): pp-59-66 26 R.B Taylor , M.I Awad , R.G Reid , R.R Moody, (2000),” Determination of sodium artesunate in plasma using ion pairing high-performance liquid chromatography” Journal of Chromatography B, 744, pp-415–421 27 Richard K Haynes, (2006) “From Artemisinin to New Artemisinin Antimalarials: Biosynthesis, Extraction, Old and New Derivatives, Stereochemistry and Medicinal Chemistry Requirements”, Current Topics in Medicinal Chemistry, Vol 6, pp 509-537 28 Singh N P., Panwar V K (2006), “Case report of a pituitary macroadenosma treated with artemehter” , Integrative cancer therapies ,5(4), pp 391-394 29 Stijn A.A Van Quekelberghel, Shahid A Soomro, Jan A Cordonnier and F Herwig Jansen.(2008), “Optimization of an LC-MS Method for the Determination of Artesunate and Dihydroartemisinin Plasma Levels using Liquid-Liquid Extraction”, Journal ofanalytical toxicology, Vol 32, pp 133-139 30 Timothy M.E.D, et al (2001), “Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of intravenous artesunat in Severe Falcifarum Malaria”, Antimicrobial Agents and Themotherapy, 45)(1), pp.181-186 31 Le Thi Diem Thuy, Le Ngoc Hung, Phan Thong Danh, Kesara Na-Bangchang (2008 ), “Delelopment and validationof a liquid chromatography- mass spectrometry method for the simultaneous quantification of artesuanat and dihydroartemisinin in human plasma”, SOUTHEAST ASIAN J TROP MED PUBLIC H EALTH, Vol 39 No 6, pp-93-977 32 World Organization Health (2010), “Guidelines for treatment of malaria” Vol Độ PHỤ LỤC CC1 115 CC2 CC3 CC4 CC5 CC6 110 105 100 00 200 400 600 800 1,000 95 90 85 Nồng độ (ng/ml) Độ Hình P1: Đồ thị phần dư đường thực nghiệm ART theo mô hình weighting 1/x2 CC1 CC2 CC3 CC4 CC5 CC6 115 110 105 100 200 400 600 800 1000 95 90 85 Nồng độ (ng/ml) Hình P2: Đồ thị phần dư đường thực nghiệm DHA theo mô hình weighting 1/x2 ... xây dựng phương pháp định lượng artesunat dihydroartemisinin huyết tương LCMS /MS với nội dung sau: Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời ART DHA huyết tương Đánh giá phương pháp. .. DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH HÙNG MÃ SINH VIÊN: 1201289 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁPĐỊNH LƯỢNG ARTESUNAT VÀ DIHYDROARTEMISININ TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG LC- MS/ MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng... phương pháp định lượng đồng thời ART DHA huyết tương 1.2.1 Định lượng đồng thời ART DHA huyết tương HPLC Do DHA chất chuyển hóa có hoạt tính ART nên để nghiên cứu SKD ART cần phải có phương pháp