Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong rễ cây ngưu tất bằng phương pháp HPLC

Ứng dụng phương pháp trong định lượng saponin tổng trong một số mẫu rễ ngưu tất .... DANH MỤC CÁC BẢNG 1.1 Cấu trúc một số hợp chất saponin triterpenoid trong rễ ngưu 3.3 Sự phụ thuốc củ

PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

1 Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

2 Khoa CNCX – Viện Dược Liệu

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành khóa luận này, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, em còn may mắn nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ của mọi người xung quanh Em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy Ts Nguyễn Tuấn Hiệp, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, dạy bảo

em trong suốt quá trình nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn cô Ts Trần Nguyên Hà, người đã tạo điều kiện, và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị khoa Công Nghệ Chiết Xuất,

Viện Dược Liệu, đặc biệt là chị Đỗ Thị Thùy Linh, người đã luôn theo sát giúp

đỡ em Chân thành cảm ơn ban giám đốc Viện Dược Liệu đã cho em cơ hội thực tập tại viện

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị những người luôn động viên, khích lệ, trợ giúp cho em về mọi mặt để em có được kết quả ngày hôm nay

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Sinh viên

Phạm Ngọc Ánh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1. Tổng quan về loài Achyranthes bidentata 3

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Achyranthes bidentata 3

1.1.2 Bộ phận sử dụng 4

1.1.3 Thành phần hóa học 4

1.1.4 Tác dụng dược lý 7

1.2 Tổng quan về hợp chất Saponin 9

1.2.1 Cấu trúc hóa học và phân loại 9

1.2.2 Tính chất hóa lý của saponin 11

1.2.1.1 Tính chất vật lý 11

1.2.1.2 Tính chất hóa học 11

1.3 Một số phương pháp định tính, định lượng saponin 11

1.3.1 Các phương pháp định tính 12

1.3.1.1 Phản ứng tạo bọt 12

1.3.1.2 Phản ứng màu 12

1.3.1.3 Sắc kí lớp mỏng 12

1.3.2 Các phương pháp định lượng 12

1.3.2.1 Phương pháp khối lượng 12

1.3.2.2 Phương pháp đo quang 13

1.4 Tổng quan về phương pháp HPLC 13

1.4.1 Nguyên tắc hoạt động 13

1.4.2 Cấu tạo HPLC 14

1.4.3 Ứng dụng của phương pháp HPLC trong định lượng saponin 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất 18

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích 19

2.2.2 Xử lí số liệu 21

2.3 Thẩm định phương pháp 21

2.3.1 Tính thích hợp của hệ thống 21

2.3.2 Tính chọn lọc 21

2.3.3 Đường chuẩn 22

2.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) 22

2.3.5 Độ lặp lại 23

2.3.6 Độ đúng 23

2.4 Phân tích mẫu thực 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng 25

3.1.1 Qui trình chiết xuất saponin trong rễ ngưu tất 25

3.1.2 Khảo sát và tìm điều kiện sắc kí 31

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 35

3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống 35

3.2.2 Tính chọn lọc 36

3.2.3 Đường chuẩn 37

3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 39

3.2.5 Độ lặp lại 39

3.2.6 Độ đúng 40

3.3 Ứng dụng phương pháp trong định lượng saponin tổng trong một số mẫu rễ ngưu tất 42

3.4 Bàn luận 44

3.4.1 Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu ngưu tất ở Việt Nam 44 3.4.2 Qui trình chiết xuất saponin trong rễ ngưu tất 44

3.4.3 Phương pháp định lượng và thẩm định phương pháp 45

3.4.4 Hàm lượng saponin ở một số mẫu thực 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AO Acid Oleanolic

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (Association of official

analytical chemists) ACN Acetonitrile

DAD Detector mảng điốt (Diode array detector)

ELSD Detector tán xạ bay hơi (Evaporative light scattering detector) ESI Ion hóa tia điện (Electrospray Ionization)

FLD Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography) HPLC –

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

RRLC Sắc kí lỏng phân giải nhanh (rapid-resolution liquid

chromatography) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

TOF Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight)

UV Tử ngoại (Ultraviolet)

λem Bước sóng phát xạ (emission)

λex Bước sóng kích thích (exitation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Cấu trúc một số hợp chất saponin triterpenoid trong rễ ngưu

3.3 Sự phụ thuốc của diện tích pic theo nồng độ AO 38

3.6 Hàm lượng saponin toàn phần trong một số dược liệu ngưu

tất

43

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

phần

28

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rễ cây ngưu tất (Radix Achyranthis Bidentatae) là một thảo dược quý, từ

lâu đã được ông cha ta sử dụng như một vị thuốc hành huyết, tán ứ, tiêu ung lợi thấp, bổ can, ích thân, cường gân tráng cốt [5] Ngày nay, ngoài việc sử dụng

rễ ngưu tất trong các thang thuốc sắc, ngày càng có nhiều chế phẩm đông dược được sản xuất từ vị thuốc này như: sản phẩm hỗ trợ điều trị cholesterol máu cao: Cholestin, an mạch Ích Nhân, Hạ hồi đơn, điều trị phong tê thấp: Bà Giằng, viêm khớp Tâm Bình, hoạt huyết dưỡng não: hoạt huyết Minh Não Khang, hoạt huyết thông mạch PH,… Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy các tác dụng kể trên là nhờ vào các hoạt chất có trong rễ cây như: saponin triterpen, phytoecdysone, polysaccharid, đặc biệt là saponin [3], [38] Hiện nay, ở nước ta việc đánh giá hàm lượng saponin trong ngưu tất còn chưa được tiêu chuẩn hóa Đã có những qui trình định tính thành phần saponin trong rễ ngưu tất, tuy nhiên chuyên luận “ngưu tất” trong dược điển Việt Nam IV chưa có qui trình chuẩn để xác định hàm lượng saponin trong dược liệu này Vì vậy việc tiêu chuẩn hóa chất lượng saponin trong rễ cây ngưu tất là rất cần thiết

Các nghiên cứu trước đây cho thấy các saponin trong rễ cây ngưu tất khi thủy phân cho thành phần chính là acid oleanolic (AO) Năm 2009, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược”, trong đó đã tiến hành xây dựng “dấu vân tay” của một số dược liệu bằng phương pháp TLC và HPLC, đối với dược liệu ngưu tất chất đối chiếu là acid oleanolic [1] Vì vậy chúng tôi lựa chọn acid oleanolic làm chất chuẩn, và thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong rễ cây ngưu tất bằng phương pháp HPLC” với

2 mục tiêu chính như sau:

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về loài Achyranthes bidentata

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Achyranthes bidentata

Vị trí của loài Achyranthes bidentata trong

Loài : Achyranthes bidentata

Cây thảo, sống nhiều năm, cao đến 2 m

Thân mềm, có 4 cạnh, phình lên ở những đốt,

màu lục hoặc nâu tía, cành thường mọc lên thẳng đứng Lá đối, hình bầu dục hoặc mác, dài 5- 10 cm, rộng 1- 4 cm, gốc thuôn hẹp, đầu nhọn, 2 mặt nhẵn, mép nguyên hoặc uốn lượn, gân lá mặt trên màu nâu tía, cuống dài 1- 1,5cm [5], [6], [10]

Hoa lưỡng tính, hoa mọc ở ngọn thân hay kẽ lá đầu cành thành bông, cánh nhọn, tiền diệp thành gai móc, cọng dài 4- 5 mm, lá đài 5 xanh, nhị 5, chỉ nhị dính với nhau và dính với cả nhị lép, nhị lép có răng rất nhỏ tiểu nhụy 7, bao phấn hình mắt chim, bầu hình trứng Bế quả rụng với lá đài, lá hoa và tiền diệp Quả hình bầu dục, 1 hạt [5], [6], [10] Ngưu tất là cây ưa sáng và ưa ẩm, cây ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt

Phân bố: Cây được trồng nhiều ở Lai Châu, Hưng Yên, Tây Nguyên, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Sa Pa [5]

Hình 1.1: Ngưu tất-

Achyranthes Bidentata [10]

đường kính 0,5- 1,0 cm Đầu trên mang vết tích

của gốc thân, đầu dưới thuôn nhỏ Mặt ngoài

màu vàng nâu, có nhiều nếp nhăn dọc nhỏ và vết

tích của rễ con [3]

1.1.3 Thành phần hóa học

Có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của ngưu tất Trong đó một số thành phần chính trong rễ ngưu tất như: saponin triterpenoid, phytoecdysone, polysaccharide,…[6], [10], [23]

a Saponin triterpenoid

Thành phần saponin trong rễ ngưu tất chủ yếu là lớp saponin triterpenoid

mà phần sapogenin có khung oleanan Hợp chất đầu tiên acid oleanolic (1) được Tang & Eisenbrand mô tả đầu tiên năm 1992 Từ đó đến nay, bằng việc sử dụng

kĩ thuật phân tích hiện đại như LC-MS, HPLC…đã có tổng cộng trên 20 hợp chất saponin trong rễ cây ngưu tất được phát hiện [27] Trong đó có một số

saponin triterpenoid điển hình như: oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside (2), chikusetsusaponin V (3), 3-O-β-D-glucopyranosyl-oleanolic acid-28-O-β-

D-glucopyranoside (4) [31], bidentatoside I (5) [34], bidentatoside II (6),

chikusetsusaponin V methyl ester (7) [33]

Hình 1.2: Rễ ngưu tất- Radix

Achyranthis bidentatae

Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất phytoecdysone trong rễ ngưu tất

7

Sáng chế [WO/2001/037844] công bố năm 2001 đã xác định cấu trúc hóa học của polysaccharid trong rễ ngưu tất (Hình 1.5) [23], cấu trúc này cũng được Chen XM và cộng sự vào năm 2005 xác định là một fructan mạch ngắn [18] Hàm lượng của polysaccharid trong rễ ngưu tất trong nghiên cứu của Jiang Yan năm 2015 khoảng 11,7 % [21]

1.1.4 Tác dụng dược lý

a Theo y học cổ truyền

Ngưu tất có vị đắng chua, tính bình, không độc, tác dụng vào 2 kinh can

và thận Dạng sống có tác dụng hành huyết, tán ứ, tiêu ung lợi thấp Dạng chín

có tác dụng bổ can, ích thân, cường gân tráng cốt [5] Ngưu tất dạng sống chữa

cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đái rát buốt, đái ra máu hoặc sỏi, bế kinh, bụng dưới kết hòn cục, đẻ khó hoặc khi đẻ rau thai không ra, sau khi đẻ ứ huyết gây đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm, đầu gối nhức mỏi Ngưu tất sao ẩm chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối, tay chân co quắp [5]

b Theo y học hiện đại

Theo các nghiên cứu trên thế giới, rễ cây ngưu tất có một số tác dụng dược lý chính như sau:

 Giảm đau, kháng khuẩn, chống viêm: Saponin trong dịch chiết của ngưu

tất và các sản phẩm chế biến của ngưu tất có tác dụng làm giảm đau, chống viêm tai giữa trên chuột được gây viêm bởi tinh dầu Croton, tác dụng chống viêm này tăng lên khi ngưu tất được chế biến với rượu vang [30], tác dụng giảm đau chống viêm cũng được chứng minh trong thử nghiệm của GAO Chang Kun

và cộng sự [20]

 Điều hòa miễn dịch: Qinghua Chen và cộng sự thử nghiệm trên lợn con

cai sữa cho thấy bổ sung chế độ ăn với polysaccharide có trong ngưu tất giúp chúng tăng cường đáp ứng miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể [16] Tác dụng này cũng được chứng minh trong thử nghiệm của Lu T và cộng sự, cho

8

thấy polysaccharide trong ngưu tất ở nồng độ cao có hiệu quả tăng cường đáng

kể hiệu giá kháng thể, thúc đẩy sự phát triển của các tế bào lympho T ngoại vi

và tăng cường khả năng miễn dịch của vaccine ND-IB trên gà [39] Polysaccharid trong rễ ngưu tất còn có tác dụng ức chế sự phát triển và di căn của tế bào ung thư, bảo vệ, phục hồi chức năng gan trên chuột nhắt [23]

 Trợ lực tử cung: Dịch chiết ngưu tất có tác dụng tăng cường hoạt động

các cơ trơn tử cung trên chuột đã được chứng minh trong thử nghiệm của YJ Yuan và cộng sự [46]

 Chống loãng xương: Thử nghiệm trên chuột đã chứng minh dịch chiết rễ

ngưu tất giúp cải thiện mật độ xương, giúp điều trị loãng xương, và có thể là một loại thuốc thay thế tiềm năng cho điều trị loãng xương sau mãn kinh [15], [49]

 Hạ đường huyết: Theo nghiên cứu của Shengxia Xue và cộng sự năm

2008, cho kết quả các hợp chất polysaccharide biến đổi từ ngưu tất có tác dụng làm giảm đáng kể mức đường huyết và malondialdehyde ở chuột bị tiểu đường [43]

 Tác dụng trên hệ thần kinh: Ying Yuan và cộng sự đã chứng minh các

polypeptide chiết được từ ngưu tất có tác dụng thúc đẩy tái tạo mô và phục hồi chức năng của dây thần kinh không bị thương ở chuột [43] Ngoài ra còn giúp ngăn ngừa tổn thương tế bào glutamate gây ra trên tế bào thần kinh [51]

Ức chế sự phát triển khối u: Hợp chất polysaccharide trong dịch chiết rễ

ngưu tất đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển khối u trong thử nghiệm của Yu S, Zhang Y [45]

 Hạ cholesterol: Dịch chiết nước của rễ ngưu tất có tác dụng ức chế tạo

mạch và kiểm soát trọng lượng cơ thể ở chuột được cho ăn với chế độ giàu chất béo [37]

9

Hình 1.4: Phân loại saponin theo khung sapogenin

1.2 Tổng quan về hợp chất Saponin

1.2.1 Cấu trúc hóa học và phân loại [4]

Saponin có cấu trúc gồm 2 phần: phần đường và phần sapogenin

 Phần sapogenin: có cấu trúc triterpen với khung 30 carbon hoặc steroid với

27 carbon dẫn xuất từ khung cholestan Nhóm thế trong sapogenin thường chỉ

là nhóm hydroxyl đôi khi gặp nhóm oxo hay sulfat

 Phần đường: Đa số saponin có từ 1- 2 mạch đường Tổng số đơn vị đường trong saponin thường là 1- 4 đường, tối đa có thể lên đến 11 đơn vị Đường

trong saponin là các đường thông thường như β-D-glucose, β-D-xylose, rhamnose và α-L-arabinose…

Phân loại saponin:

Nhóm Dammaran Nhóm Lanostan

Nhóm Tirucallan

Nhóm Cucurbitan

Saponin steroid

Saponin steroid

Nhóm Spirostan Nhóm Furostan

Saponin steroid alkaloid

Nhóm aminofurostan

Nhóm Spirosolan

Nhóm Solanidan

Các nhóm khác

10

Cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm saponin:

Nhóm Oleanan:

Hình 1.5: Khung oleanan và cấu trúc acid oleanolic

Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này Saponin trong rễ ngưu tất phần lớn có khung cơ bản là oleanan, đặc biệt là acid oleanolic

Đôi nét về acid Oleanolic:

 Tính chất vật lý [14], [35]: Bột kết tinh màu trắng; công thức phân tử: C30H48O3; khối lượng phân tử: 456,71 g/mol; nhiệt độ nóng chảy: > 300oC (572oF; 573 K); góc quay cực: +83,3o; pKa= 4,59

 Tính tan: Không tan trong nước, tan trong 65 phần ether, 108 phần cồn

95 %, 35 phần cồn 95 % sôi, 118 phần chloroform, 118 phần aceton, 235 phần MeOH

 Một số tác dụng dược lý: Tác dụng chống tác nhân gây khối u và kháng

virus [28]; tác dụng chống HIV và HCV in vitro [44]; góp phần bảo vệ tế bào

11

Hình 1.6: Cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm saponin

1.2.2 Tính chất hóa lý của saponin

 Saponin có cấu trúc lưỡng cực nên có tính chất hoạt động bề mặt

 Khối lượng phân tử lớn nên saponin khó bị thẩm tích

1.2.1.2 Tính chất hóa học [4]

 Khả năng làm vỡ hồng cầu

 Độc với cá, các động vật thân mềm vì làm tăng tính thấm biểu mô đường

hô hấp nên làm mất điện giải cần thiết của các động vật này

 Tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-β-hydroxysteroid khác

 Tùy nhóm thế mà saponin có tính acid hoặc kiềm

1.3 Một số phương pháp định tính, định lượng saponin

12

1.3.1 Các phương pháp định tính

1.3.1.1 Phản ứng tạo bọt [3]

Lấy 2,0 g bột dược liệu, thêm 50 ml dung dịch natri cloride 1 % (kl/ tt)

(TT), đun sôi nhẹ, lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm, lắc, xuất hiện nhiều bọt bền vững chứng tỏ có saponin trong dược liệu

 Chuẩn: Dung dịch acid oleanolic chuẩn 0,1 % (kl/ tt) trong EtOH

 Hiện màu: Dung dịch acid phosphomolypdic 5 % (kl/tt) trong EtOH (TT) Sấy ở 100oC trong 10 phút

1.3.2 Các phương pháp định lượng

1.3.2.1 Phương pháp khối lượng

Chiết saponin rồi cân Có thể thủy phân saponin, phần sapogenin rất ít tan trong nước được lọc hoặc được hoà tan trong dung môi hữu cơ rồi đem bốc hơi dung môi hữu cơ, sấy, cân Từ lượng dược liệu và lượng sapogenin cân được tính ra hàm lượng saponin trong dược liệu [4] Tuy nhiên phương pháp này cho kết quả kém chính xác và không đánh giá được hết lượng saponin trong dược liệu, vì vậy ngày nay phương pháp này ít được sử dụng

13

1.3.2.2 Phương pháp đo quang

Định lượng bằng phương pháp đo quang có nhiều ưu điểm là tiến hành nhanh, đơn giản, được sử dụng phổ biến trong phân tích các hoạt chất của dược liệu Đối với saponin, cần tiến hành làm phản ứng màu với thuốc thử, sản phẩm tạo thành có khả năng hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và so sánh với chuẩn, tính được hàm lượng saponin toàn phần Đối với nhóm triterpenoid có thể dùng thuốc thử vanillin- sulfuric hoặc acid percloric, các saponin cho màu tím với thuốc thử này Zhuohong và cộng

sự [42] xác định hàm lượng saponin tổng trong bột giảo cổ lam bằng cách chiết Soxhlet với EtOH Sử dụng thuốc thử là Vanilin trong acid acetic băng 5 % và acid percloric 70 % Ủ hỗn hợp ở 60ºC trong 15 phút Làm lạnh nhanh bằng nước đá Đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm Tính kết quả saponin toàn phần dựa vào chuẩn gypenoside Thuốc thử này cũng được sử dụng để xác định hàm lượng saponin trong nghiên cứu cây giảo cổ lam của Nguyễn Thu Hương [9]

1.4 Tổng quan về phương pháp HPLC

1.4.1 Nguyên tắc hoạt động [2], [8], [19]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): là một phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của chất tan với 2 pha: pha tĩnh và pha động Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích Khi ta bơm dung môi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện và chuyển qua bộ phận xử lí số liệu

Có 2 chế độ pha động rửa giải:

 Đẳng dòng (isocratic): Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc kí

 Chương trình dung môi (gradient): pha động là hỗn hợp của nhiều dung

môi Tỷ lệ các thành phần dung môi thay đổi theo chương trình rửa giải

1.4.2.2 Hệ thống bơm

Dùng để bơm pha động vào cột Yêu cầu của hệ thống bơm:

 Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên

 Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01- 5,0 ml/phút

1.4.2.3 Hệ tiêm mẫu

Mẫu được tiêm thẳng vào pha động cao áp ở ngay đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu

1.4.2.4 Cột

Hình 1.7: Sơ đồ khối của một máy sắc kí

lỏng hiệu năng cao [32]

cơ liên kết với bề mặt

 Cột bảo vệ: được đặt trước cột sắc kí để loại bớt tạp

 Điều nhiệt cột: đảm bảo nhiệt độ ổn định cho cột

 Detector chỉ số khúc xạ (RI): thường dùng để định lượng hợp chất đường

 Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hóa

Ngoài ra còn có: detector tán xạ bay hơi (ELSD), detector điện hóa (ED), detector độ dẫn (IC), detector khối phổ (MS),…

1.4.3 Ứng dụng của phương pháp HPLC trong định lượng saponin

Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC trong định lượng saponin

Bảng 1.3 Các nghiên cứu định lượng saponin bằng HPLC

 Pha động: ACN và dd H3PO4 0,1 % (70: 30, v/v)

17

Chế độ SIM: lựa chọn mảnh có m/z = 455 [M -H]-

Li Guoliang et al

(2011) [24]

Cột: Hypersil BDS C8 (200⨯4,6 mm, 5 μm), nhiệt độ cột: 30oC

Pha động: A: ACN và H2O (20:80, v/v), B:

100 % MeCN - Chương trình gradient: 0 phút: 25 % A-75 % B, 15 phút: 15 % A- 85

 Detector: DAD (220 nm)

10

18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Các mẫu dược liệu ngưu tất (Radix Achyranthes bidentata) sử dụng trong

nghiên cứu được thu hái từ các khu vực khác nhau của Việt Nam bao gồm: Hà Nội, Tây Nguyên, Thái Bình, Hưng Yên, và một số mẫu ngưu tất trên thị trường, các mẫu này đều được giám định tên khoa học tại khoa tài nguyên của Viện Dược Liệu lưu giữ tại khoa Công Nghệ Chiết Xuất

Bảng 2.1: Các mẫu Ngưu tất dùng trong nghiên cứu

 Dung môi, hóa chất:

Acetonitril (≥ 99,9 %), loại HPLC, Fisher, Mỹ

Methanol (≥ 99,8 %), loại HPLC, Merck, Đức

Acid formic (≥ 98,0 %), loại HPLC, Merck, Đức

Methanol, acid clohydric, ethanol, cloroform, vanilin, acid sulfuric đạt tiêu chuẩn phân tích (P.A), Trung Quốc

Nước cất 2 lần

19

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị

 Máy siêu âm Daihan, Hàn Quốc

 Cân hàm ẩm OHAUS, Switzerland

 Tủ sấy Memmert, Đức

 Cân phân tích 4 số AND, Nhật Bản

 Máy chiết béo Soxhlet 148 Velp, Italy

 Máy HPLC UFLC Shimadzu, Nhật Bản

 Các dụng cụ khác: Nồi cách thủy, bình định mức, Micropipet 1-200µl, 100-1000µl, ống đong,

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích

Dựa trên các tài liệu tham khảo là Dược điển Việt Nam IV (2009), Dược điển Hồng Kông (2010), theo các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

về điều kiện chiết saponin trong ngưu tất:

Bảng 2.2: Qui trình chiết và thủy phân saponin trong các nghiên cứu Phương pháp

Cân chính xác 0,2 g bột rễ ngưu tất đưa vào ống ly tâm 50

ml, thêm 10 ml EtOH 70o Hòa tan bằng sóng siêu âm (560 W) hỗn hợp trong 30 phút Ly tâm 3000 vòng/ phút, trong

8 phút Lọc qua bộ lọc RC 0,45 µm Lặp lại hai lần mỗi lần 10 ml ethanol 70o Tập trung dịch lọc vào bình định mức 50 ml Thêm ethanol 70o đến vạch Hút 10 ml dung dịch trên vào ống nghiệm Thêm 1 ml HCl 6 M Lắc đều, ủ

ở 75oC trong 22 h Làm nguội đến nhiệt độ phòng Chuyển dung dịch vào bình cầu 50 ml và tráng ống nghiệm ba lần, mỗi lần với 5 ml ethanol 70o Làm bay hơi dung môi đến

cắn ở áp suất thấp Hòa tan trong MeOH Chuyển dung dịch

20

vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH đến vạch Lọc qua

bộ lọc RC 0,45 µm và tiến hành chạy mẫu

Hồ Thị Thu

Hương (2012)

[7]

Rễ ngưu tất loại chất béo bằng n-hexan Sau đó chiết ngấm

kiệt với EtOH 70o và cho bay hơi bớt cồn Cao cồn sau đó hòa nước nóng, thủy phần bằng HCl 15% ở 100o, trong 2

h Chiết với CH2Cl2, bay hơi dung môi tới cắn thu được sapogenin

Dịch chiết n-BuOH được hòa thêm 1 lượng nhỏ MeOH và

kết tủa bởi diethyl ether Tủa này chính là saponin toàn phần

Khảo sát điều kiện chiết mẫu:

 Dung môi chiết: Khảo sát các dung môi: MeOH, EtOH, nước, hoặc hỗn hợp dung môi tại các nồng độ khác nhau Lựa chọn dung môi và nồng độ tại đó cho hiệu suất chiết cao nhất

 Thời gian chiết và số lần chiết: Chiết mẫu với các thời gian, số lần khác nhau Lựa chọn thời gian chiết và số lần chiết tại đó cho hàm lượng cao và tiết kiệm thời gian nhất

Khảo sát điều kiện thủy phân

 Lựa chọn môi trường thủy phân là acid: HCl, H2SO4

 Nồng độ acid dùng để thủy phân:10 %, 20%, 36,5 %

 Nhiệt độ thủy phân: 70o, 90o

21

 Thời gian thủy phân: 1h, 2h, 3h

 Tỷ lệ acid: dịch chiết trong thủy phân (v/v): 2:1, 1:1, 1:2

Lựa chọn điều kiện sắc ký

 Cột sắc ký: Sử dụng cột sắc ký pha đảo có sẵn tại phòng thí nghiệm: Shim- pack GIST C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm)

 Bước sóng phát hiện: Khảo sát bước sóng tối ưu với điều kiện phân tích

 Thể tích tiêm, tốc độ dòng, nhiệt độ cột: Khảo sát thể tích tiêm và tốc độ dòng tối ưu cho pic sắc kí rõ nét, thời gian lưu hợp lí

 Pha động: Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động

Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng

một mẫu biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD không lớn hơn 2%

2.3.2 Tính chọn lọc

Tính chọn lọc cho biết sự có mặt của chất phân tích có thể phân biệt được với các chất khác trong mẫu phân tích Đánh giá tính chọn lọc bằng cách tiến hành so sánh sắc ký đồ của 3 mẫu: Mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không được xuất hiện pic có cùng

thời gian lưu với pic của AO Trên hình ảnh chồng phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn: Thời gian lưu của 2 mẫu tương đương Phổ tại các điểm trên 2 pic giống nhau về hình dạng và số đỉnh hấp phụ cực đại

22

2.3.3 Đường chuẩn

Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn acid oleanolic pha trong MeOH: 12,5,

25, 50, 100, 200, 300, 400 µg/ml, từ chuẩn AO 1 mg/ml Tiến hành đo các mẫu dung dịch chuẩn đã chuẩn bị Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ (trục hoành x) Tính các hệ số hồi quy a, b trong

phương trình hồi quy tuyến tính (y= ax + b) và hệ số tương quan R

Xác định hệ số tương quan R theo công thức:

20%

2.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn

hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được Xác định LOD dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Tiến hành phân tích dãy mẫu chuẩn có nồng độ thấp dần cho đến khi còn có thể xuất hiện tín hiệu của AO Sau đó xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N= signal to noise ratio)

Trong đó, S là chiều cao tín hiệu AO, N là nhiều đường nền

Lấy giá trị LOD là nồng độ AO tại đó cho S/N=3

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong

mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có

độ chụm mong muốn

23

Tương tự như LOD, xác định LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) Lấy giá trị LOQ là nồng độ AO tại đó cho S/N=10 Có thể tính LOQ theo LOD theo công thức: LOQ = 10/3 * LOD

2.3.5 Độ lặp lại

Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu Tiến hành phân tích 1 mẫu thử 6 lần song song ( bắt đầu từ giai đoạn cân mẫu) Xác định kết quả định lượng theo đường chuẩn đã xây dựng Xác định độ lặp lại thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD giữa giá trị của các lần định lượng

Công thức tính độ lệch chuẩn tương đối:

SD = √∑(xi-x̅)

2n-1

RSD%=CV%=SD

x̅ ×100

Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn

n: Số lần thí nghiệm

xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ i

x̅: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm

RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối

CV%: Hệ số biến thiên

Yêu cầu: Theo AOAC, các mẫu phân tích có hàm lượng chất phân tích từ 1- 10

% độ lệch chuẩn tương đối RSD không vượt quá 2.7%

2.3.6 Độ đúng

Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực hoặc được chấp nhận thực Đánh giá độ đúng thông qua độ thu hồi

24

Tiến hành thêm 1 lượng xác định chất chuẩn vào mẫu thực sao cho nồng

độ acid oleanolic vẫn nằm trong khoảng tuyến tính

Tiến hành đo các dung dịch sau:

Trong đó: R%: Độ thu hồi, %

Cc: nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Ct+c: nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

Ct: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Yêu cầu: Theo AOAC, mẫu phân tích có hàm lượng chất phân tích ≥ 1% độ thu

hồi yêu cầu nằm trong khoảng 97 -103 %

2.4 Phân tích mẫu thực

Xây dựng đường chuẩn Các mẫu thực được xác định hàm ẩm và định lượng theo qui trình xây dựng Mỗi mẫu làm lại 2 lần Tính kết quả dựa trên phương pháp xây dựng đường chuẩn

 Pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần

 Tiêm sắc ký và đo tín hiệu của AO, ghi lại kết quả diện tích pic

 Sử dụng công cụ tính toán để biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak

Ao vào nồng độ chất phân tích: Sx=aCx+b, Trong đó, Sx là diện tích pic của nồng độ chuẩn C

 Xác định hàm lượng saponin trong mẫu dược liệu khô tuyệt đối

25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng

3.1.1 Qui trình chiết xuất saponin trong rễ ngưu tất

Dựa trên các tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện chiết và thủy phân như sau:

a Khảo sát điều kiện chiết saponin toàn phần:

 Phương pháp chiết: Chiết Soxhlet Sử dụng thiết bị chiết Soxhlet có sẵn ở phòng thí nghiệm cho thấy hiệu suất chiết cao

 Dung môi chiết: Saponin là các hợp chất phân cực, hòa tan tốt trong các dung môi MeOH, EtOH, nước và hỗn hợp các dung môi này Với dung môi là nước

có ưu điểm là rẻ, an toàn với môi trường và sức khỏe con người, tuy nhiên, khi chiết ngưu tất với nước lượng saponin giải phóng thấp và thời gian chiết kéo dài, đối với một qui trình mục đích là định lương hoạt chất trong dược liệu như vậy là không phù hợp, vì vậy chúng tôi không lựa chọn nước MeOH và EtOH

là 2 dung môi thường được sử dụng để chiết saponin nhất So với MeOH, EtOH

có nhiều ưu điểm hơn, là dung môi thân thiện với môi trường, dễ kiếm và giá thành rẻ, hơn nữa dựa trên các tài liệu tham khảo cho thấy chiết ngưu tất với EtOH cho hiệu suất cao Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát chiết dược liệu tại các nồng độ EtOH: 30 o, 40 o, 50 o, 60 o, 70 o, 80 o, 90 o, 96o

Sau khi chiết dược liệu bằng dung môi cồn có nồng độ khác nhau, dịch chiết được phân tích và đánh giá hàm lượng, kết quả hàm lượng saponin được trình bày ở hình 3.1

26

Hình 3.1: Kết quả khảo sát nồng độ cồn Nhận xét: Khi chiết dược liệu với cồn 50o và các mức cồn cao độ đều cho hàm lượng saponin cao, ưu tiên sử dụng cồn 50o vừa đảm bảo lượng saponin được giải phòng cao nhất và tiết kiệm lượng cồn sử dụng, vì vậy lựa chọn cồn 50olàm dung môi chiết

 Thời gian chiết và số lần chiết: Với phương pháp chiết Soxhlet, khảo sát số lần chiết dược liệu, mỗi lần với 50 ml cồn 50o trong 1h ở nhiệt độ sôi của dung môi là 90oC Dịch chiết từ lần 4 sau khi chấm thử sắc ký lớp mỏng cho thấy không còn vết AO, vì vậy lựa chọn số lần chiết là 3 lần đảm bảo saponin được chiết kiệt khỏi dược liệu và rút ngắn thời gian chiết

Tóm lại: Điều kiện chiết trong khuôn khổ khóa luận này là:

 Phương pháp chiết Soxhlet

 Dung môi chiết: cồn 50o

 Thời gian chiết và số lần chiết: chiết 3 lần, mỗi lần 50ml cồn 50o trong 1h ở 90oC