Xây dựng qui trình định lượng stachyose trong stachys affinis bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng đầu dò khối phổ và phương pháp điện di mao quản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG STACHYOSE TRONG STACHYS AFFINIS BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG STACHYOSE TRONG STACHYS AFFINIS BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHAN THANH DŨNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết cơng trình nghiên cứu tơi Các kết số liệu luận văn trung thực không chép nguồn khác Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm trƣớc nhà trƣờng cam đoan Nguyễn Thị Bích Ngọc iii TÓM TẮT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ- Năm học 2019 – 2021 “XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG STACHYOSE TRONG STACHYS AFFINIS BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN” Nguyễn Thị Bích Ngọc Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS Phan Thanh Dũng Đặt vấn đề Trong củ Sùng thảo (Stachys Affinis Bunge., Lamiacaeae), stachyose hoạt chất có tác dụng dƣợc lý nhƣ hỗ trợ hạ đƣờng huyết, chống oxy hóa prebiotic đƣợc sử dụng phổ biến Ở Việt Nam, chƣa có nghiên cứu liên quan đến việc xác định stachyose Stachys affinis Vì vậy, qui trình định lƣợng stachyose củ Sùng thảo phƣơng pháp điện di mao quản (CE) sắc ký lỏng siêu hiệu đầu dò khối phổ (UPLC-MS) đƣợc xây dựng thẩm định để góp phần vào cơng tác đánh giá chất lƣợng nguồn nguyên liệu đầu vào Mục tiêu đề tài xây dựng thẩm định qui trình định lƣợng stachyose củ Sùng thảo CE UPLC-MS Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu: stachyose củ Sùng thảo Phƣơng pháp nghiên cứu: Khảo sát quy trình xử lý mẫu, điều kiện điện di, khối phổ, sắc ký Thẩm định qui trình xây dựng theo hƣớng dẫn ICH (2005) AOAC (2012) Kết Điện di mao quản Điều kiện điện di: Hệ thống điện di mao quản CE-7100 Agilent, Mỹ, cột mao quản Agilent Bare Silica, độ dài 65 cm, chiều dài hiệu 60 cm, đƣờng kính 75 µm Dung dịch điện ly nền: Na2HPO4 35 mM với pH= 12,4; điện thế: kV; nhiệt độ cột mao quản: 30oC; tiêm mẫu: 50 mbar; giây; bƣớc sóng phát hiện: 270 nm iv Qui trình định lƣợng đạt yêu cầu thẩm định tính tƣơng thích hệ thống, có tính đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính rộng (4,46– 89,18 µg/ml) có độ nhạy cao với LOD LOQ lần lƣợt 5,00 15,00 µg/ml Qui trình có độ xác đạt u cầu với RSD lần lƣợt 1,77 % (n=6) 1,94 % (n=12) tỷ lệ phục hồi cao nằm khoảng 99,02 – 102,10 % Sắc ký lỏng siêu hiệu đầu dò khối phổ Điều kiện sắc ký: hệ thống ACQUITY UPLC-MS, cột pha đảo Phenomenex Gemini NX-C18 (4,6 ⨯ 150 mm; µm), pha động MeOH – HCOOH 0,05 % (15 : 85) với tốc độ dòng 0,5 ml/phút; đầu dò MS/ESI- (665 m/z stachyose; 137 m/z nội chuẩn fosfomycin); cone 40 V; mao quản 0,8 kV Qui trình định lƣợng đạt yêu cầu thẩm định tính tƣơng thích hệ thống, có tính đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính rộng (0,94 – 56,40 µg/ml) có độ nhạy cao với LOD LOQ lần lƣợt 0,05 0,10 µg/ml Qui trình có độ xác đạt u cầu với RSD lần lƣợt 1,06 % (n=6) 1,18 % (n=12) tỷ lệ phục hồi 98,85 – 101,98 % Kết luận Qui trình định lƣợng stachyose củ Sùng thảo phƣơng pháp điện CEDAD UPLC-MS đƣợc xây dựng thẩm định thành công cho phép định lƣợng stachyose số mẫu dƣợc liệu, cao chiết từ Stachys affinis Bunge., Lamiacaea Từ khóa: Stachys affinis; stachyose; UPLC-MS; CE-DAD v ASBTRACT “DEVELOPMENT OF THE DETERMINATION PROCEDURE OF STACHYOSE IN STACHYS AFFINIS BY UPLC-MS AND CE-DAD” Nguyen Thi Bich Ngoc Supervisor: Assoc Prof Phan Thanh Dũng Introduction Stachyose is of the major component of Stachys affinis Bunge which has many important pharmacological effects such as: hypoglycemic, antioxidant effects and also is a commonly used prebiotic It has not been any research related to the determination of stachyose in Stachys affinis in Vietnam This study was carried out with the aim of developing a procedure for the quantification of stachyose by CE-DAD and UPLC-MS methods Objectives and methods Objectives: stachyose in Stachys affinis Methods: Investigation of sample preparation procedure, electrophoresis conditions, MS and chromatographic conditions The CE-DAD and UPLC-MS procedure were validated according to the ICH guideline (2005) and AOAC guideline (2012) Results Capillary electrophoresis - diode array detector (CE-DAD) A simple CE-DAD method was developed for quantitative determination of stachyose following electrophoresis conditions: CE-DAD Agilent system – made in US, Agilent Bare silica capillary (65 cm ⨯ 75 μm i.d., 60 cm effective length), a 35 mM sodium hydro phosphate buffer at pH 12,4; the samples were injected hydrodynamically at 50 mbar for second, the temperature is 30oC, and the applied voltage was +8 kV; detection wavelength was set at 270 nm The procedure complied with AOAC (2012) requirements: system suitability, high selectivity, wide linearity range (4.46 – 89.18 µg/ml) and high sensitivity with LOD and LOQ of 5.00 and 15.00 µg/ml, respectively The procedure achieved repeatability precision, intermediate precision with RSD 1.77 % (n=6) and 1.94 % vi (n=12), respectively, and recovery of 99.01 – 102.1 % according to AOAC guidelines (2012) Ultra Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometer (UPLC-MS) A simple UPLC-MS method was developed for quantitative determination of stachyose following chromatographic conditions: ACQUITY UPLC system, Phenomenex Gemini NX – C18 (15 cm x 4,6 mm; µm); MeOH – HCOOH 0,05 % (15:85) as mobile phase; flow rate of 0.5 ml/min; detector MS/ESI- (665 m/z); cone voltage 40 V; capilary voltage 0.8 kV The method complied with AOAC requirements: system suitability, high selectivity, wide linearity range (0.94 – 56.4 µg/ml) and high sensitivity with LOD and LOQ of 0.05 and 0.1 µg/ml, respectively The procedure achieved repeatability, intermediate accuracy with RSD 1.06 % (n=6) and 1.18 % (n=12), respectively, and recovery of 98.85 – 101.98 % according to AOAC guidelines (2012) Conclusions The quantitation procedures of stachyose by CE-DAD and UPLC-MS method from the Stachys affinis were successfully developed and validated Keywords: Stachys affinis, stachyose, UPLC-MS, CE-DAD vii MỤC LỤC Lời cam đoan iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt x Danh mục hình xi Danh mục bảng xiv MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Giới thiệu Sùng thảo (Stachys affinis Bunge., Lamiacaea) 1.2.Stachyose 1.3.Một số nghiên cứu stachyose 11 1.4.Phƣơng pháp phân tích định lƣợng 12 1.5.Nội chuẩn (Internal standard: IS) 19 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.2.Hóa chất, dung mơi, thiết bị 24 2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu 26 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 3.1.Xây dựng thẩm định qui trình định lƣợng stachyose Stachys affinis Bunge., Lamiac 3.2.Xây dựng thẩm định qui trình định lƣợng stachyose Stachys affinis Bunge., Lamiac 3.3.Ứng dụng qui trình 85 3.4.Bàn luận 86 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC 100 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT  Ký hiệu Từ nguyên x Tiếng Việt AD Amperometric Detection AOAC Official Methods of Analysis DAD Diode array detector BGE CE Background electrolyte Capillary electrophoresis Capillary zone electrophoresis Chronic Obstructive Pulmonary Disease Electroosmotic flow High performance liquid chormatography – Infrared detector CZE COPD EOP HPLC-IR Đầu dò đo ampe Các phƣơng pháp phân tích thức Đầu dò dãy diod quang Dung dịch điện ly Điện di mao quản Điện di mao quản vùng Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính Dịng điện thẩm Sắc ký lỏng hiệu cao - đầu dò hồng ngoại High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chormatography – Refractive cao - Đầu dò khúc xạ index Detector HPLC–RID High performance liquid chormatography Evaporative light scattering detector Liquid Chromatography with tandem mass spectrometry HPLC-ELSD Sắc ký lỏng hiệu cao – đầu dò tán xạ ánh sáng bay Sắc ký lỏng - Khối phổ hai lần Hội nghị quốc tế International Conference on thủ tục thuốc sử dụng Harmonization cho ngƣời Nuclear magnetic resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân Mass - Spectrometer Máy khối phổ Ultra Performance Liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu Chromatography LC–MS/MS ICH NMR MS UPLC DANH MỤC HÌNH Hình 1 Stachys affinis Hình Stachys affinis củ xi Hình Cơng thức cấu tạo stachyose .7 Hình Phổ MS stachyose [34] .9 Hình Củ Stachys affinis 24 Hình Kết điện di đồ khảo sát loại đệm 39 Hình Kết điện di đồ khảo sát nồng độ dung dịch đệm 40 Hình 3 Kết điện di đồ khảo sát nồng độ Na2HPO4 .42 Hình Kết điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng điện .43 Hình Kết điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ .44 Hình Kết điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng thời gian tiêm mẫu .45 Hình Biểu đồ biểu diễn dự đoán vùng tối ƣu 47 Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng điều kiện điện di 48 Hình Điện di đồ phân tích stachyose điều kiện tối ƣu 49 Hình 10 Hiệu suất phƣơng pháp chiết 50 Hình 11 Hiệu suất chiết dung môi 51 Hình 12 Hiệu suất chiết thời gian chiết khác 52 Hình 13 Hiệu suất chiết tỷ lệ dung môi chiết 52 Hình 14 Điện di đồ khảo sát chiết lần 53 Hình 15 Kết điện di đồ khảo sát độ đặc hiệu (A: Mẫu trắng, B: Chuẩn Stachyose, C: Nội chuẩn lactose, D: Thử, E: Thử + IS, F: Thử + Chuẩn + IS) .57 Hình 16 Phổ UV-Vis độ tinh khiết stachyose lactose 58 Hình 17 Đƣờng tuyến tính chuẩn stachyose định lƣợng .59 Hình 18 Kết điện di đồ khảo sát LOD LOQ 64 Hình 19 Phổ khối stachyose chế độ ion dƣơng 65 Hình 20 Phổ khối stachyose chế độ ion âm .65 Hình 21 Sắc ký đồ khảo sát pha động 68 Hình 22 Sắc ký đồ khảo sát nồng độ acid formic 69 Hình 23 Kết săc ký đồ khảo sát nội chuẩn 70 Hình 24 Hiệu suất chiết phƣơng pháp 71 Hình 25 Hiệu suất chiết dung môi 72 xii Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Thử + Nội chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL54 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Thử + Chuẩn + Nội chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL55 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL56 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Thử Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL57 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Nội chuẩn Fosfomycin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL58 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 2.5.3 Kết khảo sát tính tuyến tính Mẫu Nồng độ thực tế (ppm) Tỉ số Diện tích pic C/IS Chuẩn Chuẩn Chuẩn Chuẩn Chuẩn Chuẩn 0,9 2,3 4,7 9,4 18,8 37,6 0,030 0,096 0,190 0,377 0,727 1,334 Chuẩn 56,4 1,906 Kết y = 0,0338x + 0,0373 R= 0,998768484 a = 0,033799718 b = 0,037302414 P-valuea= P-valueb= a = 0,05 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL59 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Regression Statistics Multiple R R Square Adjusted R Square Standard Error Observations 0,99876848 0,99753848 0,99704618 0,03860542 ANOVA df SS MS Regression 3,01990666 3,019906662 Residual 0,00745189 0,001490378 Total 3,02735855 Coefficients Standard Error t Stat F Significance F 2026,268419 1,02157E-07 P-value Lower 95% Upper 95% Lower 95,0% Upper 95,0% Intercept 0,03730241 0,02019697 1,846931287 0,124037136 -0,01461554 0,0892204 -0,014615548 0,0892203 X Variable 0,03379972 0,00075087 45,01409133 1,02157E-07 0,031869545 0,0357299 0,031869545 0,03572989 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL60 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 2.5.4 Kết khảo sát độ xác Diện tích pic IS Tỉ số Stachyose/IS Hàm lƣợng (mg/mg) Hàm lƣợng % tính nguyên trạng 1248555 1246996 1261655 1240913 1259520 1262563 0,434 0,432 0,425 0,434 0,424 0,428 0,47282 0,46945 0,46189 0,47186 0,46152 0,46530 47,28 46,94 46,19 47,19 46,15 46,53 Hàm lƣợng trung bình 0,430 0,467140 46,71 e 0,00 0,01 0,52 RSD (%) 1,05 1,06 1,06 Mẫu Lƣợng cân (mg) Diện tích pic Stachyose Mẫu thử Mẫu thử Mẫu thử Mẫu thử Mẫu thử Mẫu thử 99,9 100,0 100,0 100,0 99,9 100,1 542355 538354 535918 538475 534048 540801 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL61 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 2.5.5 Kết khảo sát độ xác trung gian Mẫu Lƣợng cân (mg) Mẫu thử Mẫu thử Mẫu thử Mẫu thử Mẫu thử Mẫu thử Diện tích pic Stachyose 100,0 545303 99,9 532574 100,1 537398 100,0 538060 100,0 541440 99,9 536188 Hàm lƣợng trung bình e Diện tích pic IS Tỉ số Stachyose/IS Hàm lƣợng (mg/mg) Hàm lƣợng % tính nguyên trạng 0,442 0,425 0,428 0,433 0,434 0,430 0,432 0,01 0,48018 0,46259 0,46530 0,47074 0,47217 0,46813 0,4699 0,01 48,02 46,26 46,53 47,07 47,22 46,81 46,99 0,65 1,33 1,31 1,31 1234854 1253153 1254624 1242903 1246909 1246727 RSD (%) Hàm lƣợng % trung bình hai kiểm nghiệm viên (%) 46,85 Độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) hai kiểm nghiệm viên (n=12)(%) 1,18 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL62 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Xử lý số liệu so sánh hàm lƣợng (%) stachyose định lƣợng hai ngày khác phƣơng pháp UPLC-MS F-Test Two-Sample for Variances Variable Variable Mean 46,98514 46,71404 Variance 0,378691 0,244502 Observations 6 df 5 F 1,548826 P(F