Khảo sát tác dụng dược lý thực nghiệm và xây dựng qui trình định lượng đồng thời schaftosid, isoschaftosid bằng uplc pda trong kim tiền thảo (desmodium styracifolium (osb ) merr )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THỊ ÁI NHÂN KHẢO SÁT TÁC DỤNG DƯỢC LÝ THỰC NGHIỆM VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI SCHAFTOSID, ISOSCHAFTOSID BẰNG UPLC-PDA TRONG KIM TIỀN THẢO (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THỊ ÁI NHÂN KHẢO SÁT TÁC DỤNG DƯỢC LÝ THỰC NGHIỆM VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI SCHAFTOSID, ISOSCHAFTOSID BẰNG UPLC-PDA TRONG KIM TIỀN THẢO (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM ĐƠNG PHƯƠNG TP Hồ Chí Minh – 2018 ̉ M ƠN LỜI CA Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Đơng Phương - Người thầy tận tụy, hướng dẫn, động viên giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài Xin chân thành cảm ơn ThS Lê Văn Huấn, chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Tươi, cảm ơn TS Lê Thị Hồng Vân, cảm ơn ThS Huỳnh Lời, cảm ơn DS Lê Đình Phú đồng hành hỗ trợ suốt thời gian thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô anh chị em môn Dược liệu - Khoa Dược - Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Cảm ơn tất bạn lớp Dược liệu – Dược học cổ truyền năm 2016– 2018 thân yêu vượt khó, giúp đỡ sẻ chia suốt hai năm học tập Khoa Dược Xin gửi lời cảm ơn đến Ban đào tạo sau đại học Khoa Dược tạo điều kiện hỗ trợ tơi hồn thành khóa học Tơi xin cám ơn ban lãnh đạo Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu, cảm ơn anh chị em đồng nghiệp động viên hỗ trợ đơn vị để yên tâm hồn thành chương trình học tập Cuối cùng, tơi xin cám ơn gia đình nâng đỡ chăm sóc thời gian học tập, nâng cao trình độ chuyên môn Nguyễn Thị Ái Nhân LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Nguyễn Thị Ái Nhân TÓM TẮT Mu ̣c tiêu nghiên cứu: Kim tiền thảo Desmodium styracifolium (Osb.) Merr., dùng phổ biến điều trị sỏi tiết niệu, sỏi mật Ngoài ra, Kim tiền thảo cịn có tác dụng hạ huyết áp, kháng viêm, chống oxy hoá dùng điề u tri ̣các bê ̣nh thấ p khớp, giảm đau… Hiện thị trường Việt Nam, chế phẩm từ Kim tiền thảo sử dụng phổ biến, nhiên DĐVN V qui định định tính isoschaftosid sắc ký lớp mỏng nước lại qui định định lượng schaftosid HPLC Do đó, đề tài khảo sát số tác dụng dược lý xây dựng qui trình định lượng đồng thời schaftosid, isoschaftosid UPLC-PDA thực Đố i tươ ̣ng-phương pháp nghiên cứu: Kim tiền thảo đạt chuẩn GACP-WHO Công ty Cổ phầ n Dươc̣ phẩ m OPC chiết xuất MeOH 50% 50 ºC dùng cho qui trình định lượng đồng thời schaftosid, isoschaftosid máy UPLC Acquity H-Class, đầu dò PDA (Waters) với cột sắc ký pha đảo UPLC®BEH C18 (2,1 x 50 mm; 1,7 µm), chương trình rửa giải tiệm tiến với pha động acid formic 0.1% - MeOH; thời gian phân tích 35 phút; nhiê ̣t đô ̣ ̣t 40 ºC; tốc độ dịng 0,25 ml/phút; bước sóng phát hiê ̣n 272 nm Ứng dụng qui trình định lượng đánh giá hàm lượng schaftosid isoschaftosid Kim tiền thảo Đồng Nai, Bình Phước, Tây Ninh Chất đối chiếu schaftosid (Tinh khiết hàm lượng 96,3%) isoschaftosid (Tinh khiết hàm lượng 98,2%) nhà sản xuất Extrasynthese cung cấp NNC scientific Cao Kim tiền thảo chiết xuất quy mô công nghiệp Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC cung cấp khảo sát tác động điều trị viêm cấ p gây viêm bàn chân chuột carrageenan, tác động giảm đau ngoại biên mơ hình gây đau quặn bụng acid acetic tác động hạ acid uric mơ hình gây tăng acid uric cấp kali oxonat Kế t quả: Qui trình thẩm định phương pháp định lượng theo hướng dẫn ICH đạt tính tương thích hệ thống; đạt độ đặc hiệu; đạt độ lặp lại với hàm lượng schaftosid dược liệu 352,67 mg% (RSD=0,94%) hàm lượng isoschaftosid dược liệu 4,20 mg% (RSD=3,08%); khoảng tuyến tính schaftosid isoschaftosid 0,5 – 500 µg/ml; giới hạn phát LOD, LOQ schaftosid 0,125 µg/ml 0,5 µg/ml isoschaftosid 0,0625 µg/ml 0,25 µg/ml; tỷ lệ phục hồi dược liệu schaftosid 91,03 – 100,34% isoschaftosid 87,80 – 102,42% Cao Kim tiề n thảo nước có hoạt tính kháng viêm, giảm đau hạ acid uric cấp tính mơ hình chuột nhắt thử nghiệm Kế t luận: Hàm lượng isoschaftosid thấp so với schaftosid Kim tiền thảo Việt Nam Đây kết định lượng đồng thời hai chất schaftosid isoschaftosid thiết bị UPLC-PDA thực Việt Nam Tác động sinh học kháng viêm, giảm đau hạ acid uric cấp mở hướng tác dụng điều trị hạ acid uric Kim tiền thảo ABSTRACT Introduction Desmodium styracifolium (Osb.) Merr has been used widely for gallstone and urolithiasis treatment Besides, D styracifolium has many other activities as antioxidant, antiinflammation, hypertensive treatment, The aim of this study is to investigate some pharmalogical activities and to develop a UPLC-PDA method for simultaneously quantitative determination of schaftoside and isoschaftoside in D styracifolium Material and method GACP-WHO standardized D styracifolium supplied by OPC Pharmaceutical Joint-Stock Company was extracted by MeOH 50% at 50 ºC The methanol extract then was used for developing a UPLC-PDA method using ACQUITY UPLC system, BEHđC18 (2.1 x 50 mm; 1.7 àm) column; mixture of methanol – water with 0.1% of formic acid as mobile phase in gradient mode; flow rate of 0.25 ml/min with run time of 35 minutes; column temperature of 40 ºC and detective wavelength of 272 nm to simultaneously quantitatively determine of schaftoside and isoschaftoside The developed method was applied to determine the contents of schaftoside and isoschaftoside in crude drugs in Dong Nai, Binh Phuoc, Tay Ninh Chemical reference standard: schaftoside (purity: 96,3%) and isoschaftoside (purity: 98,2%) of Extrasynthese Company, supplied by NNC scientific D styracifolium industrial-scale extracts supplied by OPC Pharmaceutical Joint-Stock Company was used for investigate some pharmalogical activities in vivo as pain-relieving activity, acute inflammation treatment and uric acid reducing activity in some biological activity tests Results The method complied ICH requirements: system suitability, high selectivity, wide linearity range (0 - 500 µg/ml) and high sensitivity with LOD and LOQ of 0.125 and 0.5 µg/ml for schaftoside and of 0.0625 and 0.25 µg/ml for isoschaftoside, respectively The method had high accuracy and precision with intra-day RSD% of schaftoside and isoschaftoside below 5% (0.94 and 3.08%, respectively) and recovery range for schaftoside of 91.03 – 100.34% and for isoschaftoside of 87.80 – 102.42% D styracifolium extracts was demonstrated some pharmalogical activities as pain-relieving activity, acute inflammation treatment and uric acid reducing activity Conclusion Contents of isoschaftoside was very low in D styracifolium in Vietnam This is the first report about separation and simultaneous determination of schaftoside and isoschaftoside by UPLC-PDA method in Vietnam Some demonstrated pharmalogical activities show that D styracifolium can be applied as an uric acid reducer in future i MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Mô tả thực vâ ̣t chi Desmodium 1.1.3 Cây Kim tiền thảo 1.1.4 Sinh thái phân bố TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Thành phần hóa học chi Desmodium 1.2.2 Thành phần hóa học Kim tiền thảo TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ, CÔNG DỤNG 1.3.1 Tác dụng trị sỏi thận 1.3.2 Tác dụng gan, mật tim mạch 1.3.3 Tác dụng khác 10 1.3.4 Công du ̣ng 10 1.3.5 Một số chế phẩm có chứa Kim tiền thảo 12 TỔNG QUAN VỀ CÁC BỆNH LÝ VIÊM, ĐAU VÀ GOUT 13 1.4.1 Tổng quan viêm số mơ hình nghiên cứu tác động kháng viêm 13 1.4.2 Tổng quan đau số mơ hình nghiên cứu tác động giảm đau 15 1.4.3 Tổng quan gout số mô hình nghiên cứu tác động hạ acid uric 17 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM KIM TIỀN THẢO TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 19 1.5.1 Phương pháp định lượng schaftosid isoschatosid HPLC 19 ii 1.5.2 Phương pháp kiểm nghiệm Dược điển Việt Nam V 23 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24 2.1.1 Nguyên liê ̣u 24 2.1.2 Thú vật thí nghiệm 25 DUNG MÔI HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25 2.2.1 Dung mơi, hố chất 25 2.2.2 Trang thiết bị, dụng cụ 25 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Xây dựng qui trình định lượng đồng thời schaftosid isoschaftosid Kim tiền thảo UPLC-PDA 26 2.3.2 Thẩ m đinh ̣ qui trình định lượng đồng thời schaftosid isoschaftosid Kim tiền thảo 29 2.3.3 Ứng dụng qui trình để định lượng schaftosid isoschaftosid dược liệu 32 2.3.4 Khảo sát tác dụng sinh học 33 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI SCHAFTOSID VÀ ISOSCHAFTOSID TRONG CÂY KIM TIỀN THẢO BẰNG UPLC-PDA 39 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 39 3.1.2 Khảo sát qui trình chiết xuất schaftosid isoschaftosid Kim tiền thảo50 THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 56 3.2.1 Tính tương thích hệ thống 56 3.2.2 Độ đặc hiệu 59 3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính 63 3.2.4 Độ lặp lại 65 3.2.5 Khảo sát độ phương pháp 67 3.2.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 69 3.2.7 Kết luận thẩm định qui trình định lượng 69 QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI SCHAFTOSID VÀ ISOSCHAFTOSID TRONG CÂY KIM TIỀN THẢO BẰNG UPLC-PDA 70 iii ỨNG DỤNG QUI TRÌNH ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG SCHAFTOSID VÀ ISOSCHAFTOSID TRONG DƯỢC LIỆU 71 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG SINH HỌC 73 3.5.1 Tác đô ̣ng điều trị viêm cấp cao Kim tiền thảo 73 3.5.2 Tác đô ̣ng giảm đau ngoa ̣i biên cao Kim tiền thảo 75 3.5.3 Tác đô ̣ng ̣ acid uric cấ p cao Kim tiền thảo 76 Chương BÀN LUẬN 79 Xây dựng qui trình định lượng đồng thời schaftosid isoschaftosid Kim tiền thảo UPLC-PDA 79 Khảo sát tác dụng sinh học cao Kim tiền thảo 80 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 86 PHỤ LỤC 92 iv DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên mẫu Ý nghĩa DĐVN Dược điển Việt Nam EtOH Ethanol GACP Good Agricultural and Collection Practices Thực hành trồng trọt thu hái tốt HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao ICH International Conference on Harmonization Hội nghị hài hoà Quốc tế LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MeOH Methanol PDA Photodiode Array Dãy diod quang psi Pound per Square Một đơn vị áp suất RSD Relative Standard Deviation Độ lêch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn TNF Tumor necrosis factor Tác nhân hoại tử khối u TT Thuốc thử UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu UV-Vis Ultraviolet-Visible Tử ngoại – khả kiến WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.40 Phụ lục 23 Độ 120 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.41 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.42 Phụ lục 24 Sắc ký đồ mẫu khảo sát vùng miền khác Schaftosid - 19.052 0.070 0.060 0.010 18.022 16.069 0.020 15.346 13.180 0.030 Isoschaftosid - 17.171 0.040 14.635 AU 0.050 0.000 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 Minutes 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 Mẫu thử 0.040 0.010 15.923 13.084 0.020 14.509 0.030 18.391 AU 0.050 Isoschaftosid - 17.058 0.060 20.198 Schaftosid - 18.911 0.070 0.000 8.00 9.00 10.00 11.00 Bình Phước Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 12.00 13.00 14.00 Minutes 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.43 Schaftosid - 18.909 0.070 0.010 17.859 0.020 15.184 13.094 0.030 15.909 0.040 14.514 AU 0.050 Isoschaftosid - 17.026 0.060 0.000 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 Minutes 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 Đồng Nai 15.029 0.030 0.020 0.010 17.739 14.383 AU 0.040 15.773 0.050 Isoschaftosid - 16.931 0.060 Schaftosid - 18.823 0.070 0.000 9.00 10.00 11.00 12.00 Tây Ninh Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 13.00 14.00 15.00 Minutes 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.44 Schaftosid - 18.699 0.060 0.050 17.583 0.010 Isoschaftosid - 16.757 14.912 0.020 15.654 0.030 14.258 AU 0.040 0.000 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 Minutes 0.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 Dũ Hưng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 13.00 14.00 15.00 Minutes 16.00 17.00 17.836 15.867 15.124 0.02 14.480 0.04 13.055 AU 0.06 Isoschaftosid - 17.012 0.08 18.00 Schaftosid - 18.904 Dược Phát 19.00 20.00 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.45 Schaftosid - 18.731 0.010 0.008 AU 0.006 15.709 0.002 17.621 14.336 0.004 0.000 -0.002 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 Minutes 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 Thân mẫu thử Schaftosid - 18.793 0.10 0.02 17.719 14.987 0.04 15.768 AU 14.358 0.06 Isoschaftosid - 16.884 0.08 0.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 Lá mẫu thử Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 13.00 14.00 15.00 Minutes 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.46 Phụ lục 25 Số liệu khảo sát tác động điều trị viêm cấ p gây viêm bàn chân chuột carrageenan cao Kim tiền thảo Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.47 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.48 Phụ lục 26 Số liệu khảo sát tác động giảm đau ngoại biên mơ hình gây đau quặn bụng acid acetic cao Kim tiền thảo Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.49 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.50 Phụ lục 27 Số liệu khảo sát tác động hạ acid uric mơ hình gây tăng acid uric cấp kali oxonat cao Kim tiền thảo Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.51 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.52 Phụ lục 28 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Kim tiền thảo OPC Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.53 Phụ lục 29 Phiếu kiểm nghiệm cao Kim tiền thảo chiết xuất qui mô công nghiệp Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.54 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 69 3.2.7 Kết luận thẩm định qui trình định lượng 69 QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI SCHAFTOSID VÀ ISOSCHAFTOSID TRONG CÂY KIM TIỀN THẢO BẰNG UPLC- PDA. .. VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THỊ ÁI NHÂN KHẢO SÁT TÁC DỤNG DƯỢC LÝ THỰC NGHIỆM VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI SCHAFTOSID, ISOSCHAFTOSID BẰNG UPLC- PDA. .. (Osb. ) Merr Fabaceae)” thực với các mu ̣c tiêu sau: - Xây dựng thẩm định qui trình định lượng đồng thời schaftosid isoschaftosid có Kim tiền thảo phương pháp UPLC- PDA - Ứng dụng qui trình định lượng