Xây dựng quy trình định lượng đồng thời allopurinol và chất chuyển hóa oxypurinol trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGƠ THỊ MINH TÂM XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ALLOPURINOL VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA OXYPURINOL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGƠ THỊ MINH TÂM XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ALLOPURINOL VÀ CHẤT CHUYỂN HĨA OXYPURINOL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ THU CÚC GS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Ngơ Thị Minh Tâm ii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ALLOPURINOL VÀ OXYPURINOL 1.2 CHUẨN NỘI TRONG PHÂN TÍCH DỊCH SINH HỌC 1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU HUYẾT TƯƠNG 10 1.4 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC THEO HƯỚNG DẪN CỦA CƠ QUAN QUẢN LÝ THUỐC VÀ THỰC PHẨM HOA KỲ VÀ CƠ QUAN QUẢN LÝ THUỐC CHÂU ÂU 12 1.5 MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ALLOPURINOL VÀ OXYPURINOL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG .14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU- NGUYÊN VẬT LIỆU –TRANG THIẾT BỊ 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 28 3.2 KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU 31 iii 3.3 KHẢO SÁT CHẤT CHUẨN NỘI 33 3.4 XÁC ĐỊNH KHOẢNG NỒNG ĐỘ ĐỊNH LƯỢNG 36 3.5 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG ALLOPURINOL, OXYPURINOL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 36 3.6 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ALLOPURINOL VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA OXYPURINOL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT HPLC .46 3.7 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG TRÊN PHÂN TÍCH MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BỆNH GÚT 49 CHƯƠNG BÀN LUẬN 56 4.1 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ALLOPURINOL , OXYPURINOL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT HPLC .56 4.2 BÀN LUẬN KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ALLOPURINOL, OXYPURINOL TRÊN MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BỆNH GÚT 58 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 5.1 KẾT LUẬN .61 5.2 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………….……….………63 PHỤ LỤC iv v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Chữ viết tắt ALO Từ nguyên Ý nghĩa Allopurinol Allopurinol AUC Area under curve Diện tích đường cong BLK Blank Mẫu trắng Cmax Maximum concentration Nồng độ đỉnh CR Carry over Mẫu tồn dư CV Coefficient of variation Hệ số phân tán EC Electrical conductivity Độ dẫn điện EMA HQC European Medicines Agency High Quality Control Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu Mẫu kiểm tra nồng độ cao IS Internal standard Chuẩn nội IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Hiệp hội Quốc tế Hóa học túy ứng dụng HT HPLC Huyết tương Sắc ký lỏng hiệu cao OXY High Performance Liquid Chromatography Oxypurinol PPE Protein precipitation Tủa protein LC-MS/MS Liquid chromatography Tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LLE LLOQ Chiết lỏng – lỏng Giới hạn định lượng LQC MIN MAX MQC Liquid-liquid extraction Lower Limit of Quantification Low Quality Control Minimum Maximum Medium Quality Control MS Mass Spectrometry vi Oxypurinol Mẫu kiểm tra nồng độ thấp Giá trị nhỏ Giá trị lớn Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình Khối phổ PPT Protein Precipitation Tủa protein RSD S/N SPE T1/2 TB Tmax Relative standard deviation Signal/noise Solid phase extraction Half-life Độ lệch chuẩn tương đối Tỉ lệ tín hiệu/nhiễu Chiết pha rắn Thời gian bán thải Trung bình Thời gian đạt nồng độ đỉnh tR ULOQ UPLC US-FDA Time at which the maximum concentration (Cmax) is observed Retention time Upper limit of quantitation Ultra Performance Liquid Chromatography United States Food and Drug Administration vii Thời gian lưu Giới hạn định lượng Sắc ký lỏng siêu hiệu Cơ quan Quản lý thuốc Thực phẩm Hoa kỳ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tóm tắt thơng số dược động học allopurinol .5 Bảng 1.2 So sánh hướng dẫn US-FDA EMA 13 Bảng 1.3 Tóm tắt số cơng trình nghiên cứu định lượng đồng thời 15 Bảng 2.1 Chất đối chiếu chuẩn nội dự kiến sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Dung mơi hóa chất sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.3 Các lô huyết tương trắng sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.4 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.5 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 19 Bảng 2.6 Cách pha hỗn hợp chuẩn .20 Bảng 3.1 Kết khảo sát cột sắc ký 32 Bảng 3.2 Hiệu suất chiết với dung môi tủa protein (n=5) 32 Bảng 3.3 Kết khảo sát dung môi chiết (n=5) 33 Bảng 3.4 Kết khảo sát hiệu suất chiết (n=6) 35 Bảng 3.5 Nồng độ ALO, OXY lý thuyết dãy đường chuẩn 36 Bảng 3.6 Kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n = 6) 37 Bảng 3.7 Kết xác định tính đặc hiệu giới hạn định lượng 38 Bảng 3.8 Mối tương quan giá trị nồng độ tỷ số diện tích pic (S/SIS) 40 Bảng 3.9 Kết khảo sát tính tương thích phương trình hồi quy 40 Bảng 3.10 Kết độ độ xác ngày ngày .41 Bảng 3.11 Tỷ lệ phục hồi chất phân tích huyết tương người (n = 6) .42 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ ổn định huyết tương người (n = 6) 43 Bảng 3.13 Kết độ ổn định dung dịch gốc chất phân tích 44 Bảng 3.14 Kết thẩm định ảnh hưởng mẫu 45 Bảng 3.15 Kết thẩm định ảnh hưởng hệ số pha loãng (D= 2) 45 Bảng 3.16 Kết thẩm định ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư (n=6) 46 Bảng 3.17 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 47 Bảng 3.18 Cách pha dãy dung dịch chuẩn dung môi pha mẫu 47 Bảng 3.19 Nồng độ lý thuyết giai mẫu chuẩn mẫu kiểm chứng 48 Bảng 3.20 Kết tương thích hệ thống ngày phân tích mẫu 50 Bảng 3.21 Kết đường chuẩn định lượng ALO, OXY huyết tương người 50 Bảng 3.22 Kết mẫu QC định lượng ALO, OXY huyết tương người 51 Bảng 3.23 Kết định lượng huyết tương người bệnh gút ngày 53 Bảng 3.24 Kết định lượng huyết tương người bệnh gút ngày 54 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo allopurinol Hình 1.2 Sự chuyển hóa hypoxanthinvà allopurinol Hình 1.3 Cơ chế làm giảm sản xuất acid uric allopurinol oxypurinol Hình 1.4 Công thức cấu tạo oxypurinol Hình 1.5 Allopurinol chất chuyển hóa Hình 1.6 Cấu trúc hóa học acyclovir .9 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học guanin Hình 1.8 Cấu trúc hóa học lamivudin 10 Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu phương pháp tủa protein .22 Hình 2.2 Quy trình xử lý mẫu phương pháp chiết lỏng lỏng 23 Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát đung dịch đệm 22 Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ pha động 30 Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký 30 Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát tác nhân tủa protein 32 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát chất chuẩn nội 34 Hình 3.6 Sắc ký đồ huyết tương trắng nồng độ MQC sau xử lý mẫu 35 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn nồng độ LLOQ mẫu huyết tương trắng 37 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ tỉ lệ diện tích pic 40 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ ALO OXY 51 Hình 3.10 Sắc ký đồ phân tích mẫu huyết tương người bệnh gút 52 ix Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-38 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 11: Sắc ký đồ liệu thẩm định ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư PL-39 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-40 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-41 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 12: 20% liệu định lượng ALO, OXY huyết tương người bênh gút (2 ngày ) PL-42 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-43 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-44 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-45 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-46 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-47 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-48 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-49 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-50 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-51 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 13: Chấp thuận hội đồng đạo đức nghiên cứu PL-52 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn