Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và cefein trong viên nén bằng điện di mao quản

Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu hướng tới xây dựng một phương pháp CZE đơn giản cho phép định lượng đồng thời cả Paracetamol, Cafein trong chế phẩm dạng viên nén hoặc nang cứng, ch

XÂY D ĐỊNH LƯ PARACETAMOL VÀ

DI MAO QUẢN

ỢC SĨ

TRONG VIÊN NÉN BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Tác giả khóa luận muốn dành lời đầu tiênđể bày tỏ lòng cảm ơn chân thành

đếnTS.Lê Đình Chi - Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược Hà

Nội, người thầy không những đã tận tình chỉ bảo, đưa ra những hướng dẫn chính xác

và kịp thời khi tôi gặp khó khăn, mà còn luôn ân cần động viên, chia sẻ với tôi các

vấn đề trong cuộc sống

Xin trân trọng gửi lời tri ân đến các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa phân tích và độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, đã luôn giúp

đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Tình cảm của mọi người đã đem lại cho tôi niềm an ủi lớn lao và đó cũng chính là động lực tinh thần to lớn giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tác giả khóa luận cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thành viên trong Hội đồng đánh giá khóa luận bởi những ý kiến đóng góp của Hội đồng sẽ giúp tôi thấy được những hạn chế của mình để có thể tiến bộ nhanh hơn trên con đường học tập và nghiên cứu Dù người viết đã cố gắng hoàn thành khóa luận của mình với khả năng

có thể, nhưng chắc hẳn không thể tránh khỏi những thiếu sót và bất cập, rất mong được thầy cô chỉ giáo

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Cảnh Quang

1.3 Một số phương pháp phân tích đồng thời paracetamol và cafein 7

1.4 Điện di mao quản (CE: Capillary Electrophoresis) 8

Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18

2.3.1.Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch chế phẩm và các dung dịch làm

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu: 19

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1.Khảo sát và lựa chọn các điều kiện điện di 20

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn nồng độ đệm phosphat 24

3.1.4 Khảo sát và lựa chọn bước sóng phát hiện 26

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

CEC Sắc ký điện di mao quản (Capillary electrochromatography)

CSE Điện di rây mao quản (Capillary sieving electrophoresis)

CGE Điện di gel mao quản (Capillary gel electrophoresis)

IEF Điện di hội tụ đẳng điện (Isoelectric focusing)

ITP Điện di đẳng tốc (Isotachophoresis)

CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis)

CZE Điện di mao quản vùng (Capillary zone electrophoresis) EOF Dòng điện thẩm (Electroosmotic flow)

UV-VIS Bước sóng tử ngoại –khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích đồng thời cafein và paracetamol 7 Bảng 1.2 Các chất thường dùng làm pha động trong CE và giá trị pK của chúng 11 Bảng 3.1 Độ phù hợp hệ thống của paracetamol và cafein 32 Bảng 3.2 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của paracetamol 33Bảng 3.3 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của cafein 33Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ lặp lại trên mẫu paracetamol 34Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại trên mẫu cafein 35Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại khác ngày trên mẫu paracetamol 35Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ lặp lại khác ngày trên mẫu cafein 36Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 80% của cafein 38Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 80% của paracetamol 38Bảng 3.10 Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 100% của cafein 39Bảng 3.11 Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 100% của paracetamol 39Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 120% của cafein 40Bảng 3.13 Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 120% của paracetamol 40Bảng 3.14 Kết quả định lượng cafein trong hapacol extra 41Bảng 3.15 Kết quả định lượng paracetamol trong hapacol extra 42Bảng 3.16 Kết quả định lượng cafein trong panadol extra 43Bảng 3.17 Kết quả định lượng paracetamol trong panadol extra 43Bảng 3.18 Tổng hợp hàm lượng của các chất trong chế phẩm 44

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.6 Ảnh hưởng dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di 11Hình 1.7 Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản 14 Hình 2.1 Máy điện di mao quản P/ACE MDQ plus của hãng Sciex 17 Hình 3.1 Điện di đồ khi sử dụng các dung dịch đệm khác nhau 23Hình 3.2 Sắc ký điện di tại nồng độ đệm 25mM; 30 mM; 35mM; 40mM 25Hình 3.3 Điện di đồ với dung dịch đệm phosphat 25mM ở các pH khác nhau 26 Hình 3.4 Phổ hấp phụ của cafein và paracetamol 27

Hình 3.6 Điện di đồ paracetamol chuẩn và cafein chuẩn 29

Hình 3.11 Điện di đồ định lượng chế phẩm hapacol extra 43Hình 3.12.Điện di đồ định lượng chế phẩm panadol extra 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Paracetamol là một hoạt chất hạ nhiệt giảm đau đã được sử dụng phổ biến từ lâu trong nhiều dạng bào chế khác nhau, cả đơn độc và kết hợp với các hoạt chất khác.Trong số đó có các dạng bào chế sử dụng kết hợp giữa paracetamol và cafein (Panadol Extra (GSK), Hapacol Extra (DHG), Pancelxim Extra (CTCPDP Đông Nam)…) nhằm tăng cường tác dụng giảm đau

Cho tới nay, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vẫn là kỹ thuật được dùng phổ biến nhất để phân tích Paracetamol và Cafein: Paracetamol và Cafein đã được định lượng đồng thời bằng cột C18 [7] Bên cạnh HPLC, Paracetamol và Cafein đã được định lượng đồng thời bằng kỹ thuật sắc ký mixen điện động (micellar kinetic chromatography – MEKC) [11] Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu hướng tới xây dựng một phương pháp CZE đơn giản cho phép định lượng đồng thời cả Paracetamol, Cafein trong chế phẩm dạng viên nén hoặc nang cứng, cho phép thay thế các phương pháp phân tích khác nhau cần thiết trước đây bằng một phương pháp duy nhất tiện lợi hơn cho áp dụng trên thực tế.Vì vậy chúng tôi quyết định

chọn đề tài là “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Paracetamol và Cafein trong viên nén bằng điện di mao quản” với hai mục tiêu:

1 Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời Paracetamol và Cafein bằng điện di mao quản

2 Ứng dụng phương pháp này để định lượng hai thành phần trên trong chế phẩm đang lưu hành trên thị trường

Chương 1:TỔNG QUAN

1.1 Paracetamol:

1.1.1 Công thức cấu tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý:

1.1.1.1 Danh pháp và công thức cấu tạo:

- Tên khoa học: N-(4-hydroxyphenyl) acetamid hay phydroxyacetanilid hay

1.1.1.2 Tính chất:

Bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ, nóng chảy ở khoảng 170oC Chế phẩm hơi tan trong nước, tan nhiều trong nước sôi, rất khó tan trong cloroform, ether, tan trong ethanol và các dung dịch kiềm [2, 5]

Hóa tính do nhóm OH phenolic, nhóm chức acetamid và nhân thơm quyết định[2, 5]

1.1.1.3 Cơ chế tác dụng và tác dụng dược lý:

- Cơ chế tác dụng:

Cơ chế gây sốt: các yếu tố gây sốt ngoại lai (Vi khuẩn, độc tố…), gây sốt cho

cơ thể kích thích bạch cầu sản xuất và giải phóng các chất gây sốt nội sinh Các chất này sẽ hoạt hóa enzym prostagladin synthetase làm tăng tổng hợp PGE1 và PGE2 từ acid arachidonic ở vùng dưới đồi gây mất cân bằng cơ chế điều nhiệt của cơ thể gây sốt [3, 4]

Cơ chế hạ sốt: các thuốc hạ sốt ức chế enzym prostagladin synthetase làm giảm tổng hợp PGE1 và PGE2do đó làm giảm quá trình sinh nhiệt, tăng cường quá trình thải nhiệt, tái lập sự cân bằng cho trung tâm điều nhiệt của cơ thể [3, 4]

Paracetamol là thuốc giảm đau không nằm trong nhóm opioid, nó có tác dụng giảm đau, hạ sốt, nhưng không có tác dụng chống viêm Paracetamol, với liều điều trị, có tác dụng hạ sốt trong cơ thể do bất kỳ nguyên nhân nào nhưng gây hạ thân nhiệt ở người bình thường [3, 4]

-Tác dụng dược lý:

Paracetamol (N-acetyl-p-aminophenol hoặc Acetaminophen) là chất chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin, là thuốc giảm đau, hạ sốt hữu hiệu có thể thay thế aspirin.Paracetamol không có hiệu quả điều trị viêm Với liều ngang nhau tính theo gam, paracetamol có tác dụng giảm đau và hạ sốt tương tự aspirin [4]

Paracetamol làm giảm thân nhiệt của người bệnh sốt, nhưng hiếm khi làm giảm thân nhiệt ở người bình thường Thuốc tác dụng lên vùng dưới đồi gây hạ nhiệt, tỏa nhiệt tăng do giãn tĩnh mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên [4]

Với liều điều trị, paracetamol ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không làm thay đổi cân bằng acid-base, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày như dùng salicylat Nguyên nhân do paracetamol không tác dụng trên cyclooxygenase toàn thân, chỉ tác động đến cyclooxygenase/prostagladin của hệ thần kinh trung ương Paracetamol không tác dụng trên tiểu cầu hoặc thời gian chảy máu [4]

Khi dùng quá liều paracetamol, một chất chuyển hóa là N-bezoquinonimin gây độc nặng cho gan.Liều bình thường, paracetamol dung nạp tốt, không có nhiều tác dụng phụ của aspirin.Tuy vậy, quá liều cấp tính (trên 10g) làm thương tổn gan gây chết người Những vụ ngộ độc và tự vẫn bằng paracetamol đã tăng lên một cách đáng lo ngại trong những năm gần đây [4]

1.1.2 Dược động học:

- Hấp thu: Paracetamol được hấp thu nhanh chóng và hầu như hoàn toàn qua

đường tiêu hóa Thức ăn có thể làm viên nén giải phóng kéo dài paracetamol chậm được hấp thu một phần và thức ăn giàu cacbonhydrat làm giảm tỷ lệ hấp thu của paracetamol Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt trong vòng 30 đến 60 phút sau khi uống với liều điều trị[3, 4]

- Phân bố: Paracetamol phân bố nhanh và đồng đều trong phần lớn các mô

của cơ thể.Khoảng 25% paracetamol trong máu kết hợp với protein huyết tương [3, 4]

- Chuyển hóa: Paracetamol chuyển hóa tại cytocrom P450 ở gan tạo nên chất

trung gian là Nacetylbenzoquinonimin, chất này tiếp tục liên hợp với nhóm sulfuryl của glutathion để tạo ra chất không có hoạt tính[3, 4]

- Thải trừ: Thu

thanh thải là 19,3 lít/gi

ở liều cao (trên 10 g/ngày), s

Thuốc thải trừ qua nước tiểu chủ yếu ở dạng đ

i là 19,3 lít/giờ Thời gian bán thải khoảng 2,5 giờ Khi dùng paracetamol

u cao (trên 10 g/ngày), sẽ tạo ra nhiều N-acetylbenzoquino

glutathion gan.Khi đó N-acetylbenzoquinonimin sẽ phản ứng v

ổn thương gan, hoại tử gan, có thể gây tử

u tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý:

Danh pháp và công thức cấu tạo:

trimethylxanthine, coffeine, theine, mateine, guaranine, methyltheobromine hay 1,3,7-trimethylxanthine

ng với nhóm sulfydrid vong nếu không cấp

c lý:

trimethylxanthine, coffeine, theine, mateine, guaranine,

2,6-dion

1.2.1.3 Cơ chế tác dụng và tác dụng dược lý:

- Trên thần kinh trung ương:Cafein kích thích ưu tiên trên vỏ não làm giảm

các cảm giác mệt mỏi, buồn ngủ, làm tăng hưng phấn vỏ não, tăng cảm nhận giác quan, do đó tăng khả năng làm việc và làm việc minh mẫn hơn Tuy nhiên, nếu sử dụng cafein liên tục và kéo dài thì sau giai đoạn hưng phấn là ức chế Với liều sử dụng cao, cafein tác dụng trên toàn bộ hệ thần kinh trung ương gây co giật [3, 4]

- Trên hệ tuần hoàn:Cafein kích thích làm tim đập nhanh, mạnh, tăng lưu

lượng tim và lưu lượng mạch vành Ở liều điều trị thuốc ít ảnh hưởng đến huyết áp [3, 4]

- Trên hệ hô hấp: Kích thích trung tâm hô hấp, làm giãn phế quản và giãn

mạch phổi Tác dụng này càng rõ khi trung tâm hô hấp bị ức chế[3, 4]

- Trên hệ tiêu hóa: Gây táo bón, tăng tiết dịch vị, có thể gây loét dạ dày, tá

tràng Trên cơ trơn: thuốc có tác dụng làm giãn cơ trơn mạch máu, mạch vành, cơ trơn phế quản và cơ trơn tiêu hóa[3, 4]

- Trên thận: Thuốc làm giãn mạch thận, tăng sức lọc cầu thận, giảm tái hấp

thu Na+ nên có tác dụng lợi tiểu, tuy nhiên tác dụng lợi tiểu kém Nguyên nhân là do cafein ngăn cản phân hủy AMPv do ức chế cạnh tranh với phosphodiesterase Nồng

độ AMPv tăng thúc đẩy các phản ứng làm tăng canxi nội bào, tăng hoạt động của cơ

tim, tăng chuyển hóa, tăng phân hủy lipid, tăng glucose trong máu[3, 4]

1.2.2 Dược động học:

- Hấp thu:Thuốc hấp thu nhanh qua đường uống và đường tiêm Thuốc đạt

nồng độ tối đa trong huyết tương sau khi uống khoảng một giờ[3, 4]

- Phân bố: Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể, qua nhau thai và sữa mẹ, thể

tích phân bố 0,4 – 0,6 l/kg [3, 4]

- Chuyển hóa: Thuốc chuyển hóa ở gan bằng phản ứng dimethyl và oxy hóa

[3, 4]

- Thải trừ: Thuốc thải trừ qua nước tiểu chủ yếu ở dạng đã chuyển hóa Thời

gian bán thải khoảng 3 – 7 giờ, kéo dài ở trẻ sơ sinh và trẻ đẻnon[3, 4]

1.3.Một số phương pháp phân tích Paracetamol và Cafein:

Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích cafein và paracetamol

STT

Tài liệu

tham

khảo

Điều kiện Đối tượng

phân tích Đối tượng mẫu

1 [1], [7], [8]

HPLC

(Cột tách: RP – 18,5µm,

220 x 4,6 mm Pha động : 100% CH3OH Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút

Detectơ UV-VIS: λ = 270

Paracetamol

và cafein

Chế phẩm ba thành phần gồm paracetamol, cafein

và phenobarbital

(Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200-

300 nm, Paracetamol λmax = 244 nm, Cafein λmax = 272 nm trong môi trường axit HCl 0,1M)

1.4 Điện di mao quản (CE: Capillary Electrophoresis):

Điện di mao quản (CE – capillary electrophoresis) là một kỹ thuật tách các chất trong dung dịch lỏng dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (mang điện tích) trong cột mao quản dưới ảnh hưởng của điện trường tạo bởi điện

1.4.1 Nguyên tắc:

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trường nhất định do thế (V) đặt vào hai đầu mao quản sinh ra[10] Cấu tạo của hệ điện di được cho trong hình 1.3

Hình 1.3 Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản

1.4.1.1 Độ điện di, tốc độ điện di và thời gian điện di:

Trong điện di, tốc độ di chuyển của các hạt tích điện (v) tỉ lệ thuận với cường

độ điện trường (E):

v = μ E

Trong đó: v: tốc độ di chuyển của ion

μ: là độ diện di E: là điện trường ngoài Trong điều kiện tốc độ của dòng ổn định, lực tác động lên các tiểu phân tích điện từ phía điện trường ngoài và lực ma sát sẽ cân bằng:

q.E= fe.v

Trong đó: q: là điện tích hạt nhân

fe: là lực ma sát, fe = 6.π.η.r (η: là độ nhớt của dung dịch, r là bán kính ion)

Từ các công thức trên có thể suy ra công thức tính độ linh động của ion như sau:

μ = v/E = q/(6.π.η.r) Như vậy độ linh động điện di tỉ lệ thuận với điện tích của ion chất phân tích

và tỷ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch pha động điện di và độ lớn (bán kính hydrat r) của ion chất phân tích [10]

1.4.1.2 Mao quản:

Mao quản là một bộ phận quan trọng trong phương pháp điện di mao quản Đây chính là một trong các yếu tố quyết định sự điện di hỗn hợp của các chất mẫu Mao quản được chế tạo chủ yếu là silica được gọi là mao quản silica Trong một số trường hợp cũng có thể dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp,

ví dụ mẫu có ion F- và tách ở pH thấp

Hình 1.4 Mặt cắt ngang của mao quản

 Lớp điện kép trên thành mao quản và dòng điện di thẩm thấu

Trong quá trình điện di, lớp điện kép và thế của chúng (thế Zêta) xuất hiện ở sát thành mao quản, nó phụ thuộc vào lực ion của dung dịch pha động điện di

Hình 1.5 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản

Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điện trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển cùng tốc độ với dòng EOF [10]

Hình 1.6 Ảnh hưởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di

Do vậy, để có được hiệu quả tách cao cần thiết phải tìm được điều kiện tối

ưu và/hoặc sử dụng các biện pháp kiểm tra và khống chế (như thêm các chất hoạt hóa, thay đổi bề mặt mao quản,…) sao cho dòng EOF có cường độ phù hợp với chất phân tích trong điều kiện nghiên cứu cụ thể [10]

1.4.1.3 Dung dịch đệm pH và pha động trong phương pháp điện di mao quản:

Dung dịch đệm quyết định độ linh động điện di của các chất phân tích Do yếu tố pH, loại dung dịch đệm mà trong đó, các ion và phân tử axit hay bazơ trong thành phần của dung dịch đệm góp phần tạo nên lực ion của chúng Hơn nữa, chúng cũng ảnh hưởng đến độ tan, tốc độ phản ứng của các chất

Bảng 1.2 Các chất thường dùng làm pha động trong CE và pK của chúng[7]

Tên chất Giá trị pK Tên chất Giá trị pK

2-etansulfonic

TES

13,30

1.4.1.4 Nguồn điện thế cao

Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn điện một chiều nhất định đặt vào hai đầu mao quản Điện thế này tạo ra lực điện trường E và dòng điện I trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất[10]

Trong điện di mao quản, điện thế V một chiều thường được dùng để đặt vào hai đầu mao quản là từ 15 - 40 kV/m, hay là từ 150 - 550 V/cm mao quản Tuy nhiên, thế V được dùng phải làm sao không cho dòng điện I quá lớn trong mao quản, dòng điện I này chỉ nên nằm trong vùng từ 10 - 75 µA Việc chọn điện thế V

là bao nhiêu tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích, chất nền của mẫu, giá trị pH của pha động điện di,… [10, 17]

1.4.1.5 Kỹ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản:

Trong điện di mao quản có ba phương pháp thường dùng nạp mẫu phân tích vào trong mao quản, bao gồm:

 Phương pháp thủy động lực học dùng áp suất

 Phương pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông

Hình 1.7 Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản

- Kỹ thuật bơm mẫu kiểu thuỷ động học kiểu xiphông

Trong kỹ thuật này, mẫu được bơm vào mao quản nhờ áp lực Khi đó, lượng mẫu bơm vào trong mao quản phụ thuộc vào áp lực sử dụng (áp suất, lực hút chân không hoặc chiều cao bơm mẫu) và thời gian bơm mẫu Trong đó bơm mẫu theo nguyên lý xiphông: mẫu được dẫn vào mao quản nhờ chênh lệch độ cao giữa vị trí đặt lọ mẫu và vị trí đặt lọ đựng dung dịch đệm Đây là giải pháp bơm mẫu đơn giản nhất, và được sử dụng cho các hệ điện di maoquản xách tay vận hành thủ công [10]

- Kỹ thuật bơm mẫu kiểu điện động học

Kỹ thuật này sử dụng lực điện khi áp thế cao (5 - 10 kV trong vài giây) để bơm mẫu vào mao quản.Phương pháp bơm mẫu này cho kết quả các pic phân tách

có độ sắc nét cao.Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm rất lớn là diện tích pic (dùng để định lượng) có độ lặp lại thấp với các nền mẫu khác nhau, do đó thường chỉ dùng để định tính [10]

1.4.2 Phân loại:

Trong điện di mao quản, các kỹ thuật điện di sau được sử dụng:

- Điện di vùng (zone electrophoresis) là kỹ thuật đợn giản và được áp dụng rộng

rãi nhất hiện nay trong cả điện di trên mặt phẳng vào mao quản Trên mao quản, kỹ thuật này được gọi là điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis, CZE) Việc thêm vào dung dịch đệm một số chất sẽ cho các kỹ thuật điện di mới như MECK, CIEF, CSE[10, 17]

- Sắc ký điện động micell (micellar electrokinetic chromatography, MEKC) là

một phương pháp điện di trong đó mẫu thử được tách ra bởi sự phân bố khác nhau của chúng trong các micell (được xem như là một pha tĩnh giả) và dung dịch đệm (pha động) Trong MEKC, các chất hoạt động bề mặt được thêm vào dung dịch đệm

ở nồng độ lớn hơn nồng độ micell tới hạn.Trong phần lớn trường hợp, MEKC được tiến hành trong môi trường kiềm.Natri dodecyl sulfat (SDS) là chất hoạt động bề mặt thường sử dụng nhất[10, 17]

- Sắc ký điện động vi nhũ tương (microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC) có thể xem như một kỹ thuật mở rộng của MEKC MEEKC sử dụng các

vi nhũ tương (thường là dầu/nước) làm pha tĩnh giả MEEKC linh động và hiệu quả hơn MEKC, có thể dùng cho cả chất phân ly và trung tính hay trong phân tích quang hoạt MEEKC được dùng nhiều trong phân tích dược phẩm[10, 17]

- Sắc ký điện di mao quản (capillary electrochromatography, CEC): là một kỹ

thuật mới được phát triển gần đây sử dụng dòng điện thẩm để đưa dung môi rửa giải

đi qua pha tĩnh của cột nhồi HPLC có dung môi CEC sử dụng thiết bị điện di thông thường nhưng có thêm ưu điểm là việc ghép nối với detector khối phổ dễ dàng hơn

so với điện di mao quản thông thường Các chất trung tính cũng có thể phân tách với hiệu quả rất cao trong kỹ thuật này [10, 17]

- Điện di rây mao quản (capillary sieving electrophoresis, CSE): Trong điện di

rây mao quản, dung dịch đệm được thêm vào những chất có tác dụng cản trở vật lý

sự di chuyển của các phân tử như polyethylen oxyd hay dextran Các phân tử lớn như protein sẽ di chuyển chậm hơn do ma sát hay cản trở bởi các chất này Mức độ

bị cản trở phụ thuộc vào khối lượng hay bán kính thủy động của phân tử Nếu thêm vào môi trường điện di các chất có cấu trúc mạng 3 chiều tương tự như sắc ký lọc

gel ta có Điện di gel mao quản (capillary gel electrophoresis, CGE) Tuy nhiên,

trong điện di mao quản, CSE cho kết quả lặp lại và tin cậy hơn, dễ thay thế sau khi điện di nên được sử dụng rộng rãi hơn trong phân tích protein [10, 17]

Ngoài các kỹ thuật trên, một số kỹ thuật điện di mao quản khác cũng được sử

dụng Ví dụ như: Điện di hội tụ đẳng điện (isoelectric focusing, IEF), Điện di đẳng tốc (isotachophoresis, ITP) [17]

1.4.3 Ưu nhược điểm:

- Điện di mao quản có hiệu lực phân tách rất cao Một trong những yếu tố quan trọng là các chất được di chuyển đồng đều trong mao quản tạo nên

các băng dịch chuyển chứ không phải các vùng dịch chuyển dạng parabol như trong

sắc ký lỏng cao áp Điều này hạn chế sự dãn rộng các băng phân tách, tạo nên các đỉnh hẹp trên điện di đồ làm cho dung lượng pic của điện di cao hơn, đồng nghĩa với độ phân giải cao hơn.Khi chọn được các điều kiện điện di thích hợp, độ phân giải của phương pháp có thể đạt được rất cao Số đĩa lý thuyết trong một hệ điện di mao quản có thể đạt tới hàng trăm ngàn (thường là 100.000 - 250.000 đĩa lý thuyết), thậm chí hàng triệu (có thể tới 30.000.000 đĩa lý thuyết trong CGE các oligonucleotid) Do các đỉnh của các chất tách ra hẹp hơn nên chúng có cường độ lớn hơn, góp phần làm tăng độ nhạy của phương pháp Phương pháp điện di nguyên thủy (điện di vùng) vốn chỉ áp dụng cho các chất ion hóa.Vì thế, trong một hỗn hợp phức tạp gồm cả các chất điện ly và trung tính, chỉ có các chất điện ly di chuyển làm cho điện di đồ trở nên đơn giản hơn, thích hợp hơn với việc định lượng Thiết

bị điện di mao quản tương đối đơn giản, việc sử dụng cũng ít tốn kém về vật tư tiêu hao hơn các phương pháp sắc ký khác [10]

- Điện di mao quản cũng có những nhược điểm so với các phương pháp sắc

ký khác Điện di mao quản chủ yếu được dùng cho các chất có thể điện ly Mặc dù các kỹ thuật điện di có thể phân tách được các phân tử không ion hóa nhưng việc phát triển phương pháp và áp dụng chúng trong phân tích các hợp chất tự nhiên còn tương đối hạn chế So với sắc ký lỏng, việc chọn các điều kiện phân tích (dung dịch

đệm, điện thế) cũng hạn chế và ít linh động hơn so với lựa chọn dung môi và pha tĩnh sắc ký [10, 17]

Chương 2:NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị:

2.1.1 Hóa chất:

2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu (Chế phẩm chứa Paracetamol và Cafein):

Hai mẫu chế phẩm chứa 500 mg Paracetamol và 65 mg Cafein trong một viên: viên nén Panadol extra (GSK, số lô: 16069, hạn dùng: 05/2018), viên nén Hapacol extra (Dược Hậu Giang, số lô: 020616, hạn dùng: 08/2019)

2.1.1.2 Chất chuẩn:

Chất đối chiếu Paracetamol (SKS: 0415019, hàm lượng 100,04% (nguyên trạng), Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương), Cafein (SKS: 0107210, hàm lượng 100,0% (nguyên trạng), Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương)

2.1.1.3 Hóa chất dung môi:

Hóa chất loại tinh khiết phân tích: acid orthophosphoric 85%, dikali hydrophosphat, natri hydroxyd (Merck, Đức)

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ:

- Máy điện di mao quản P/ACE MDQ plus của hãng Sciex

Hình 2.1 Máy điện di mao quản P/ACE MDQ plus của hãng Sciex

 Máy lọc nước siêu lọc Elga

 Máy siêu âm

 Máy đo pH

 Cân phân tích

 Máy lắc xoáy

 Micropipet có độ chính xác 10, 100, 1000 µl

 Các loại dụng cụ thủy tinh có độ chính xác thích hợp

2.2 Nội dung nghiên cứu:

Khảo sát các điều kiện để xây dựng các phương pháp định lượng đồng thời Paracetamol và Cafein trong viên nén bằng điện di mao quản

Thẩm định phương pháp

Ứng dụng: Định lượng 2 thành phần trên trong một số chế phẩm có mặt trên thị trường

2.3 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch chế phẩm và các dung dịch làm việc khác:

Dung dịch đệm borat 10mM: cân chính xác khoảng 0,0954 natri tetraborat cho vào cốc có mỏ, hòa tan trong 25ml nước loại ion, lắc đều

Dung dịch đệm phosphat 25mM; 30mM; 35mM; 40mM: cân chính xác lần lượt khoảng 0,14g;0,17g ; 0,20g ; 0,23gdikali hydrophosphat vào các cốc có mỏ, hòa tan trong 25ml nước loại ion, lắc đều

Dung dịch NaOH 0,1N: cân khoảng 0,45g NaOH cho vào cốc có mỏ, hòa tan trong 100ml nước loại ion, lắc đều

Dung dịch chuẩn dùng để phân tích paracetamol và cafein trong các chế phẩm được chuẩn bị trong nước với nồng độ paracetamol, cafein lần lượt là 800

g/ml; 103 g/ml Để thẩm định phương pháp, các dung dịch chuẩn được chuẩn bị

ở nồng độ thích hợp bằng cách hòa tan và pha loãng chất chuẩn trong nước

Chế phẩm ở dạng viên nén được nghiền mịn, làm đồng đều Một lượng bột viên tương ứng với khoảng 75 mg paracetamol vào bình định mức 100 ml, thêm 10

ml methanol lắc đều, thêm 60 ml nước, lắc siêu âm 10 phút và thêm nước vừa đủ

100 ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc rồi qua màng lọc 0,2m và dùng dịch lọc tiêm vào hệ thống điện di

Tất cả các dung dịch đều được lọc qua màng 0,2µm trước khi chạy điện di

2.3.2 Điều kiện điện di:

Các điều kiện điện di sau được sử dụng: mao quản silica nung chảy (đường kính trong 75 m, chiều dài hiệu dụng 50 cm, chiều dài tổng cộng 62,5 cm) được duy trì ở 25oC; detector PDA lấy diện di đồ ở 210nm; tiêm mẫu 10 giây ở 5 psi; dung dịch điện ly nền là dikali hydrophosphat 25mM ở pH = 9,2

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu:

Tính toán, thống kê và xử lý số liệu trên phần mềm Microsolf Excel 2013.Một

số công thức tính toán giá trị thống kê như sau :

Với : m:lượng bột thuốc cân

m:khối lượng trung bình của một viên thuốc

S: diện tích pic

C:nồng độ dung dịch thuốc

Chương 3:THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1.Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và cafein bằng CZE:

Các dung dịch sử dụng cho quá trình xây dựng và thẩm định phương pháp được chuẩn bị như sau:

-Pha dung dịch BGE: Các dung dịch được cân và pha bằng nước siêu lọc trong

bình định mức Dung dịch BGE được pha mới hàng ngày

-Pha dung dịch NaOH: Dung dịch được cân trực tiếp bằng cốc có mỏ và pha vào

bình định mức bằng nước siêu lọc

-Dung dịch chuẩn gốc:

Dung dịch chuẩn gốc paracetamol 7500 µg/mL (A): Cân chính xác khoảng 75,0 mg paracetamol vào bình định mức 10,0 ml Thêm nước siêu lọc, lắc đều cho tan hết sau đó bổ sung nước siêu lọc vừa đủ đến vạch

Dung dịch chuẩn cafein980 µg/mL (B): Cân chính xác khoảng 9,8 mg cafein chuẩn vào bình định mức 10,0 ml Thêm nước siêu lọc, lắc đều cho tan hết sau đó

bổ sung nước siêu lọc vừa đủ đến vạch

Dung dịch chuẩn làm việc để xác định thứ tự di chuyển:

- Dung dịch chuẩn đơn paracetamol: Hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn gốc

paracetamol A1 đã lọc qua màng 0,2 µm và 900 µL nước siêu lọc đã lọc qua màng 0,2 µm, lắc đều Khi đó ta được dung dịch chuẩn paracetamol có nồng độ khoảng

750 µg/mL