1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế phẩm TPCN dạng bột chứa đông trùng hạ thảo

58 1,6K 12

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 58
Dung lượng 1,41 MB

Nội dung

Trong Đông trùng hạ thảo có nhiều loại nucleosid, đây là thành phần có hoạt tính chính, trong đó có adenosin và cordycepin là hai thành phần có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển

Trang 1

- -

HÀ THỊ MAI HẠNH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM

TPCN DẠNG BỘT CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

Trang 2

HÀ THỊ MAI HẠNH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM

TPCN DẠNG BỘT CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

2 DS Nguyễn Thị Quế Mai

Nơi thực hiện:

Viện thực phẩm chức năng (VIDS)

HÀ NỘI - 2015

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn của mình tới những người đã nhiệt tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Thị Quế Mai đã định hướng cho

tôi trong quá trình tìm tài liệu cũng như hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện thực phẩm chức năng (VIDS) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đề tôi hoàn thành đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, cùng các giảng viên, nhân viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất và các bộ môn khác trong Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 08 tháng 05 năm 2015 Sinh viên

Hà Thị Mai Hạnh

Trang 4

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Đông trùng hạ thảo: 2

1.1.1 Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo 2

1.1.2 Phân loại Đông trùng hạ thảo 2

1.1.3 Thành phần hóa học Đông trùng hạ thảo 2

1.1.4 Tác dụng Đông trùng hạ thảo 4

1.2 Tổng quan về adenosin, cordycepin 6

1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học 6

1.2.2 Dược động học cordycepim và adenosin 6

1.2.3 Tác dụng của cordycepin, adenosine 7

1.3 Phương pháp xác định cordycepin và adenosine 8

1.3.1 Một số nghiên cứu định lượng adenosin và cordycepin bằng phương pháp HPLC 8

1.3.2 Các nghiên cứu định lượng adenosin và cordycepin bằng phương pháp khác 12

1.4 Đại cương về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 13

1.4.1 Nguyên lý và các thông số đặc trưng của sắc ký lỏng 13

1.4.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 14

1.4.3 Ứng dụng 15

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị: 18

2.1.1 Thiết bị - dụng cụ 18

2.1.2 Hóa chất, dung môi 18

Trang 5

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Xử lý mẫu 19

2.3.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký: 20

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 21

2.3.4 Ứng dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo 22

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 22

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Chuẩn bị mẫu 23

3.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 24

3.2.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện 24

3.2.2 Khảo sát và lựa chọn pha động 25

3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 26

3.3.1 Khảo sát dung môi chiết 27

3.3.2 Khảo sát phương pháp chiết 27

3.3.3 Khảo sát nhiệt độ chiết 28

3.3.4 Khảo sát thời gian chiết 29

3.3.5 Khảo sát số lần chiết 30

3.3.6 Điều kiện tối ưu của quá trình xử lý mẫu 31

3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 32

3.4.1 Độ đặc hiệu 32

3.4.2 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính và lập đường chuẩn 33

3.4.3 Độ lặp lại 34

3.4.4 Độ đúng 35

3.5 Ứng dụng định lượng trên một số chế phẩm thực phẩm chức năng dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo 36

3.6 Bàn luận 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 45

Trang 6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số phương pháp nghiên cứu xác định adenosine và cordycepin 9

Bảng 2.1 Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm 18

Bảng 3.1 Cách pha dãy dung dịch chuẩn 23

Bảng 3.2 Khảo sát thành phần pha động 26

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát chương trình gradient 1, 2, 3 26

Bảng 3.4 Khảo sát số lần chiết 30

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ adenosin, cordycepin và diện tích pic 33

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 35

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ thu hồi adenosin và cordycepin của phương pháp 36

Bảng 3.8 Kết quả phân tích các mẫu TPCN chứa Đông trùng hạ thảo được gửi tới Viện TPCN 37

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo một số nucleosid trong Đông trùng hạ thảo 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo adenosin 6

Hình 1.3 Công thức cấu tạo cordycepin 6

Hình 1.4 Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú 7

Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 14

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến 20

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của adenosin 25

Hình 3.2 Phổ hấp thụ của cordycepin 25

Hình 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết 27

Hình 3.4 Kết quả khảo sát phương pháp chiết 28

Hình 3.5 Khảo sát nhiệt độ chiết 29

Hình 3.6 Khảo sát thời gian chiết 30

Hình 3.7 Quy trình phân tích mẫu thực 31

Hình 3.8 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn adenosin và cordycepin 32

Hình 3.9 Sắc ký đồ của mẫu trắng 32

Hình 3.10 Đường chuẩn của adenosin ( nồng độ 1–40 µg/mL) 34

Hình 3.11 Đường chuẩn của cordycepin ( nồng độ 1–40 µg/mL) 34

Trang 9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đông trùng hạ thảo là một loại dược liệu quý hiếm có từ rất lâu trên thế giới, sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi Đông trùng hạ thảo là vị thuốc “cải lão hoàn đồng”, “hồi xuân sinh lực” Mặt khác, các nghiên cứu y học cổ truyền hiện đại đều xác định Đông trùng hạ thảo hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người Trong Đông trùng hạ thảo có nhiều loại nucleosid, đây là thành phần có hoạt tính chính, trong đó có adenosin và cordycepin là hai thành phần có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của cơ thể như: giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lượng cơ bắp, giảm sinh trưởng của tế bào xấu, tăng lượng oxy trong máu… Vì vậy, trên thị trường càng ngày càng có nhiều các dòng sản phẩm Thực phẩm chức năng chứa loài dược liệu quý hiếm này để phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe của người dân

Với việc sử dụng ngày càng nhiều các sản phẩm chứa Đông trùng hạ thảo đòi hỏi có các phương pháp đánh giá chất lượng của chúng bởi trên thực tế các sản phẩm này có giá thành rất đắt nhưng khi phân tích, chất lượng rất khác nhau Trong Dược điển Trung Quốc đã đưa ra chuyên luận đánh giá dược liệu Đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis với thành phần adenosin, nhưng thành phần cordycepin chưa được đánh giá Vì vậy việc xây dựng phương pháp định lượng hai thành phần này trong Thực phẩm chức năng chứa Đông trùng hạ thảo là vô cùng cần thiết

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu để tài: “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời adenosine và cordycepin trong chế phẩm TPCN dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo” nhằm góp phần kiểm soát chất lượng chế phẩm chứa Đông trùng hạ

thảo với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp định lượng adenosin và cordycepin trong chế phẩm

Thực phẩm chức năng dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

2 Ứng dụng phương pháp để phân tích một số chế phẩm Thực phẩm chức năng dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo lưu hành trên thị trường

Trang 10

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Đông trùng hạ thảo:

1.1.1 Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo

Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) được các nhà khoa học Trung Quốc xác

định mới đầu xuất hiện từ vùng núi cao nguyên Tây Tạng Đây là loại đông dược

quý hiếm có bản chất là dạng ký sinh của loài nấm Ophiocordyceps sinensisthuộc nhóm nấm Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của một vài loài bướm trong chi

Thitarodes trước đây phân loại trong chi Hepialus [32]

Tên gọi “ Đông trùng hạ thảo” (tiếng Trung: dongchungxiacao) là xuất phát từ quan sát thực tế khi thấy vào mùa đông thì nhìn cặp cá thể này giống con sâu (côn trùng), đến mùa hè thì chúng giống như một loài thực vật Vào mùa đông sâu bị nhiễm bào tử nấm do ăn phải bào tử nấm hoặc qua hơi thở của sâu Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, khi nấm đạt đến độ trưởng thành nhất, nó tiêu thụ đến 99% chất dinh dưỡng từ thân sâu biến sâu thành xác khô Nấm quả thể thành thục sẽ phát tán các bào tử ra xung quanh Thời gian để nấm phát triển thành dạng quả thể kéo dài trong cơ thể sâu cả các tháng mùa đông đến cuối xuân đầu hè, đến mùa hè nấm phát triển thành dạng cây và phát tán bào tử [32]

Tại Trung Quốc, ĐTHT thường gặp ở những rừng ẩm ướt các tỉnh Tứ Xuyên, Vân Nam, Tây Khang, Tây Tạng, nhiều nhất ở Tứ Xuyên và Tây Khang [13]

1.1.2 Phân loại Đông trùng hạ thảo

Chi nấm Cordyceps có hơn 350 loài khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã tìm

thấy 60 loài tuy nhiên cho đến nay hai loài được nghiên cứu nhiều nhất và đưa vào

nuôi trồng là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc và Cordyceps militaris (L ex Fr)

Link

1.1.3 Thành phần hóa học Đông trùng hạ thảo

ĐTHT chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học như : các nucleosid; sterol; các acid hữu cơ; các loại đường mono- , di-, oligosaccharid và polysaccharid; các protein; polyamin; vitamin và rất nhiều khoáng chất

Trang 11

Các nucleosid:

Cytisin

Thymidin

Hình 1.1 Công thức cấu tạo một số nucleosid trong Đông trùng hạ thảo[30]

Các nucleosid là một trong những thành phần có hoạt tính trong ĐTHT, trong

đó adenosin, cordycepin được sử dụng là hoạt chất để đánh giá chất lượng của ĐTHT Có hơn 10 loại nucleosid và các chất tương tự được tìm thấy trong ĐTHT tự nhiên hay nuôi trồng nhưng hàm lượng khác nhau [16] Một nghiên cứu cho thấy nồng độ adenosin được tìm thấy trong ĐTHT nuôi trồng cao gấp 6 lần so với tự nhiên [32]

Các polysaccharid

ĐTHT chứa một lượng lớn polysaccarid, có thể chiếm khoảng 3 -8% [32] Một số monosaccharid có trong ĐTHT như rhamnose, ribose, arabinose…Nghiên cứu của Guoqinh Zhang và cộng sự [29] cho thấy các polysaccharid trong ĐTHT có hiệu quả trong việc điều tiết đường trong máu

Trang 12

Các sterol

Có nhiều loại phytosterol trong ĐTHT nhƣ: cholesterol, ergosterol, campesterol, β sitosterol… Trong đó ergosterol có hoạt tính quan trọng, có tác dụng chống virus, chống loạn nhịp Nồng độ của ergosterol trong ĐTHT nuôi trồng của C.Militaris rất cao, chỉ thấp hơn so với ĐTHT tự nhiên ở Tây Tạng và cao hơn ở Thanh Hải và Tứ Xuyên [32]

Protein và acid amin

ĐTHT có chứa 17 acid amin thiết yếu nhƣ acid glutamic, acid aspartic, arginin… và các hợp chất kiểu polyamin nhƣ cadaverin, spermidin, spermin…, các cyclodipeptid nhƣ cordycedipeptid A Các hợp chất này có hoạt tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus [32]

Acid hữu cơ và khoáng chất

Acid hữu cơ là thành phần chính của chất béo, phospholipid và glycolipid; chúng đƣợc phân loại thành acid béo bão hòa hay không bão hòa Các acid béo không bão hòa có chức năng: làm giảm lipid máu và chống lại bênh tim mạch Đồng thời ĐTHT còn chứa nhiều khoáng chất (K, P, Mg, Ca, B, Mo, Mn, Cd,

Pb, Se, Ni, Si…) Các nguyên tố Zn, Mg, Mn có ý nghĩa rất lớn đến sự phát triển và duy trì chức năng của tuyến sinh dục [32]

Trang 13

Tác dụng chống oxy hóa, tăng cường sức khỏe

ĐTHT chứa nhiều chất chống oxy hóa cao, làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể [27]

Tác dụng chống ung thư

Các nghiên cứu lâm sàng được tiến hành tại Trung Quốc và Nhật Bản cho thấy ĐTHT có tác dụng làm giảm kích thước của khối u và chống lại ung thư [8]

Nâng cao khả năng miễn dịch

Các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh ĐTHT có khả năng tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch thể Cụ thể là tác dụng nâng cao hoạt tính của đại thực bào và tế bào NK, điều tiết phản ứng của tế bào lympho

B, tăng cường một cách có chọn lọc hoạt tính của tế bào T ức chế, làm tăng nồng độ các kháng thể IgG, IgM trong huyết thanh [8]

Tác dụng chống viêm

ĐTHT tác dụng tăng sản xuất interleukin-10, giảm sản xuất interleukin-2, làm tăng bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi nên có tác dụng chống viêm, ức chế sự mất hạt nhỏ [10], [31]

Tác dụng đối với hệ thống tuần hoàn tim, não

ĐTHT có tác dụng làm giãn mạch máu, làm tăng lưu lượng tuần hoàn não và tim, thông qua cơ chế hưng phấn thực thể M ở cơ trơn thành mạch Mặt khác ĐTHT còn có khả năng điều chỉnh lipid máu, làm giảm lượng cholesterol và lipoprotein, hạn chế quá trình tiến triển của tình trạng xơ vữa động mạch

Tác dụng đối với thận, phổi, gan

ĐTHT có tác dụng đối với bệnh mãn tính: viêm gan mãn tính và các bệnh liên quan đến gan, viêm thận mãn, suy thận, viêm khớp dạng thấp, hen suyễn [31]

Ở Trung Quốc, ĐTHT được sử dụng để bảo vệ phổi, thận, điều trị các bệnh hô hấp, rối loạn chức năng thận, các bệnh về gan, bồi bổ cho người bị suy nhược, mệt mỏi

Trang 14

1.2 Tổng quan về adenosin, cordycepin

1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học

Cordycepin và adenosin đều được cấu tạo bởi nhân purin liên kết với đường ribose (ribofuranose) bằng liên kết β –N9 – glucoside [23]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo adenosin

Tên khoa học:

9 - β-D-ribofuranosyl adenin Công thức phân tử: C10H13N5O4 Trọng lượng phân tử: 267,24g/mol Điểm chảy: 234 – 235oC

Độ tan: tan tốt trong nước, DMSO, tan không đáng kể trong ethanol

Hình 1.3 Công thức cấu tạo cordycepin

Tên khoa học:

9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl) adenin Công thức phân tử: C10H13N5O3

Trọng lượng phân tử: 251,24g/mol Phân tử cordycepin tính kiềm, dạng bột hoặc tinh thể bông tuyết

Điểm chảy: 228 – 231oC

Độ tan: tan trong DMSO, methanol, ethanol

Bước sóng hấp thụ cực đại 259 nm

1.2.2 Dược động học cordycepim và adenosin

Vì cấu tạo tương tự nhau nên adenosin và cordycepin có con đường chuyển hóa tương tự Khi nghiên cứu dùng adenosin cho động vật có vú, ở bên ngoài tế bào, adenosin nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosindeaminase trong huyết tương tạo thành hypoxanthinosin, mặt khác sau khi vận chuyển vào trong tế bào, adenosin được phosphoryl hóa bởi adenoinkinase tạo thành ATP Nếu tế bào

Trang 15

không cần dùng adenosin, nó sẽ tiếp tục được loại nhóm amin bởi adenosindeaminase trong tế bào Dạng hypoxanthinosin không hoạt tính được tiếp tục biến đổi tạo acid uric thải trừ qua thận [18]

Tương tự như vậy, cordycepin cũng nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase tạo hypoxanthinosin [7]

Hình 1.4 Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [18]

1.2.3 Tác dụng của cordycepin, adenosine

Tác dụng của cordycepin

Cordycepin có tác dụng ức chế sinh tổng hợp purin, ADN/ARN [31] Khi vào trong tế bào, cordycepin chuyển hóa thành dạng 5’ mono, di và tri phosphate ức chế các enzym như ribose phosphate pyrophosphokinase và 5 – phosphoribosyl – 1 – pyrophosphate amidotransferase trong tổng hợp purin Do cấu trúc gần giống adenosin nên trong quá trình phiên mã tổng hợp ARN, enzyme kết hợp cordycepin, gây rối loạn tổng hợp ARN Các nghiên cứu cũng chỉ ra cordycepin có thể hoạt hóa AMP activated kinase, do đó ức chế di truyền, sinh trưởng phát triển tế bào Đồng thời cordycepin có tác dụng chống viêm [31] Cordycepin còn được chứng minh có

tác dụng ức chế thể hiện gen bệnh tiểu đường [20]

Trang 16

Tác dụng của adenosine

Adenosin liều cao làm tăng dẫn truyền nhĩ – thất, giảm được hiện tượng “ tái nhập” nhĩ – thất Hồi phục được nhịp xoang ở người bị rối loạn nhịp nhanh trên thất kịch phát [1] Chức năng chính của adenosine là ngăn ngừa tổn thương mô trong trường hợp thiếu oxy, thiếu máu cục bộ, co giật, tăng cường tuần hoàn mạch vành, mạch não và điều hòa nhịp tim Đồng thời adenosin trực tiếp kiểm soát các chức năng mô tim, tác dụng giãn mạch vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ tim,

ức chế nút xoang và dẫn truyền nút nhĩ thất do đó adenosin được dùng làm thuốc điều trị rối loạn nhịp tim [10] Adenosin cũng có tác dụng tốt với rối loạn thần kinh như: thiếu máu não cục bộ, động kinh, các bệnh thoái hóa thần kinh và đau thần kinh [9]

Adenosin còn có khả năng điều chỉnh chức năng của nhiều tế bào khác nhau liên quan đến đường hô hấp như bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa acid, tế bào lympho và đại thực bào

1.3 Phương pháp xác định cordycepin và adenosine

1.3.1 Một số nghiên cứu định lượng adenosin và cordycepin bằng phương pháp HPLC

Có nhiều phương pháp phân tích adenosin và cordycepin nhưng phương pháp HPLC được sử dụng nhiều nhất

Trang 17

Bảng 1.1 Một số phương pháp nghiên cứu xác định adenosine và cordycepin

Tài liệu Mẫu

thử

môi/phương pháp chiết

PDA Cột C18 Methanol (A) và Nước

(B) theo chương trình gradient: 0 – 2 phút:

100 – 85% B; 2 – 5 phút: 85 – 70% B; 5 –

10 phút: 70 – 55% B;

10 – 12 phút: 55 – 85%

B; 12 – 15 phút: 85 – 100% B

Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250

mm, 5 µm) và một cột bảo vệ (4,6 mm × 12.5

mm,

5 µm)

Methanol (A) và DD phosphate: natri dihydro phosphat 0,02M và dinatri hydro phosphat 0,02M (B) theo chương trình gradient: 0 – 5 phút:

0% A; 5 – 15 phút: 0 – 5% A; 15 – 40 phút: 5 – 40% A; 40 – 50 phút:

40% A

- Bước sóng: 260 nm

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/ phút

- Nhiệt độ cột : 30⁰C

- Thể tích tiêm mẫu:

20µL

H2O

Trang 18

Jian – Wei

Xie và cộng

sự [24]

ĐTHT khô

Shimadzu (150mm × 4,6

mm × 5 µm)

DD Ammoni acetat 0,04M pH 5,2 (A) và Methanol (B) theo chương trình gradient:

136, 268, 252 và 302

- Nhiệt độ 400oC

- Điện áp đầu dò là 4,5 KV

DAD Eclipse XDB-C18

(5 mm,

150 mm × 4.6 mm)

và một cột Phenomenex C8 (4 mm x 3 mm, 5 mm)

Nước có 0,1% acid acetic (A) và Acetonitril có 0,1%

acid acetic (B) theo chương trình gradient:

0 – 2,5 phút: 2% B; 2,5 – 12,5 phút: 2 – 12%

B; 12,5 – 14 phút: 12 – 96% B

- Bước sóng : 260 nm

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút

- Nhiệt độ cột : nhiệt

độ phòng

Ethanol 20,21%

- Chế độ ion hóa ESI +

- Lựa chọn ion [M + H]+ tại m/z là 136,

137, 268, 252, 302 Xiao Feng

Xue và

cộng sự

Sữa ong chúa

Trang 19

Methanol : H2O = 30 :

70

- Bước sóng: 260 nm

- Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút

PDA Waters Symmetry

- Thời gian rửa giải:15 phút

- Nhiệt độ cột: 30⁰C

Methanol :

H2O = 5 : 5

Trang 20

1.3.2 Các nghiên cứu định lượng adenosin và cordycepin bằng phương pháp khác

Phương pháp sắc ký bản mỏng

Nghiên cứu của MA King Wah và các cộng sự [17] tiến hành xác định

cordycepin và 7 nucleoside khác trong Cordycepin sinensis bằng phương pháp sắc

ký lớp mỏng sử dụng kỹ thuật rửa giải gradient Dịch chiết nước của 11 sản phẩm chứa Đông trùng hạ thảo được phân tích trên bản mỏng silicagel GF254 được xử lý bằng hỗn hợp Na2HPO4 0,05M : carboxymethyl cellulose (4 : 1) sau đó đặt vào tủ sấy 8 phút ở 60oC để hoạt hóa Dung môi triển khai là hỗn hợp cloroform : ethylacetat : isopropanol : nước = 8 : 2 : 6 : 0,6 (theo thể tích) với 2 giọt amoniac cho mỗi 10 ml hỗn hợp Bản mỏng chạy 18 cm, chạy lượt hai 9 cm trong dung môi hỗn hợp cloroform : ethylacetat : isopropanol : nước : dimethylfomamid (10 : 2 : 8 : 0,5 : 2 theo thể tích), phát hiện chất phân tích tại bước sóng 254 nm Phương pháp cho độ thu hồi cordycepin 98,09 %, của adenosin là 97,88 %

Phương pháp điện di mao quản

Nghiên cứu của Koteswara Rao và cộng sự [19] đã định tính và định lượng

cordycepin trong Cordyceps militaris bằng phương pháp điện di mao quản với điều

kiện: DD đệm borat 0,02M với 28,6 % methanol, pH 9,5, điện thế 20 kV, nhiệt độ

25oC, bước sóng 254 nm Đường chuẩn xây dựng từ 20 – 100 μg/mL, độ thu hồi từ

82 % đến 107 %

Nghiên cứu của Feng – Qing Yang và cộng sự [26] tiến hành xác định 12 nucleoside và nucleobase (cytosin, adenin, guanin, cytidin, cordycepin, adenosin, hupoxanthin, guanosin, inosin, 2-deoxyuridin, uridin và thymidin) trong một số loài ĐTHT bằng phương pháp điện di mao quản khối phổ (CE-MS) Mẫu được hòa tan bằng H2O 95⁰C, rung siêu âm ở nhiệt độ 75⁰C trong 30 phút Sau đó đưa dịch chiết

về nhiệt độ phòng, lọc qua màng 0,25 µm Dịch chiết được bơm vào hệ thống

CE-MS với pha động là đệm formic 10 mM chứa 10 % methanol, tốc độ dòng 3 µL/phút Phương pháp cho kết quả hàm lượng nucleosid và nucleobase trong

Trang 21

Cordyceps sinensis là 9138 ± 4823 µg/g cao hơn so với C.militaris là 3722 ± 1446

µg/g

1.4 Đại cương về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4.1 Nguyên lý và các thông số đặc trưng của sắc ký lỏng

Nguyên lý:

Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động

và chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với hai pha dẫn đến sự tách, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành các dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng, sự tách này đạt được do quá trình phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Các chất sau khi được rửa giải ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện detector

Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký [2]

mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh của pic t R là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của một số chất tan trong điều kiện nhất định

hai chất ra khỏi nhau trên cùng một điều kiện sắc ký:

Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4 %

Rs = 1,5 hai pic tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3 %

Trang 22

- Hệ số bất đối AF (Assymetry factor):cho biết mức độ cân đối của pic sắc

ký, được tính theo công thức: AF =

Trong đó: W1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20

a là khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước của pic ở 1/20 chiều cao pic

Trong phép định lượng, yêu cầu nằm trong khoảng 0,8 – 2

1.4.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm 3 phần chính:

- Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu

Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách và phân tích được nhiều hợp chất có độ phân cực đa dạng, từ phân cực, ít phân cực đến không phân cực Đồng thời thành phần chính của pha động là nước nên rất kinh tế

Trang 23

Pha động trong sắc ký lỏng

Pha động đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho

nó để có được hiệu quả tách tốt

Có thể chia pha động làm hai loại:

- Pha động có độ phân cực cao

- Pha động có độ phân cực thấp

Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ

Match khi chồng 2 phổ của chuẩn và thử cũng đánh giá định tính chất phân tích

Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn

Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao

Hệ số Match > 0,900 chỉ ra 2 phổ tương tự nhau

Trang 24

Hệ số Match < 0,900 chỉ ra 2 phổ khác nhau

Để kết luận dương tính, kết quả phân tích HPLC của một dược liệu phải cho thấy nó chứa hoạt chất hay chất đánh dấu trong thành phần, khi so sánh với kết quả HPLC trong cùng điều kiện thực nghiệm của các chất chuẩn hoạt chất hay các chất đánh dấu tương ứng

Phương pháp dùng chuẩn ngoại

Phương pháp dùng chuẩn nội

Phương pháp thêm chuẩn

Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong khuôn khổ khóa luận này, tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm

Chuẩn hóa một điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:

Trong đó:

Cx: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cs: Nồng độ chất chất phân tích trong mẫu chuẩn

Sx(Hx): Diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu thử

Ss(Hs): Diện tích ( chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn

Trang 25

Chuẩn hóa nhiều điểm

Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm nồng độ chuẩn Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ các chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể tính theo hai cách:

- Áp dữ liệu diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của nó

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích pic (hoặc chiều cao) với nồng độ của chất cần xác định

Y = a + bC Trong đó: Y: diện tích của pic của chất phân tích

a: giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b: là độ dốc của đường chuẩn

C: nồng độ của chất phân tích

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất phân tích

Trang 26

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị:

2.1.1 Thiết bị - dụng cụ

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi Chromaster detector DAD Cân phân tích Sartorius, Đức

Cân kỹ thuật Shimadzu, Nhật

Bể lắc siêu âm Helma S60H

Nồi cách thủy Memmert

Bộ lọc hút chân không

Dụng cụ: các loại pipet, bình định mức (20mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL), màng lọc mẫu (syringe filter), sinh hàn hồi lưu, ống ly tâm, ống đong…

2.1.2 Hóa chất, dung môi

Bảng 2.1 Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm

TT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Ethanol Trung Quốc Tinh khiết phân tích

2 Methanol Merck, Đức Dùng cho HPLC

3 Methanol Trung Quốc Tinh khiết phân tích

4 Acetonitril Merck, Đức Dùng cho HPLC

Chất chuẩn: adenosin, cordycepin của Sigma Aldrich, Đức

Mẫu trắng dạng rắn gồm các thành phần: dược liệu linh chi, nhân sâm , tam thất dạng bột

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Mẫu TPCN dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo gửi tới Viện Thực phẩm chức năng dạng bột màu vàng nâu, tơi mịn

Nội dung nghiên cứu của đề tài này là:

- Xây dựng quy trình định lượng adenosin và cordycepin bằng kỹ thuật sắc

ký lỏng với detector PDA (xử lý mẫu, điều kiện chạy sắc ký, thẩm định)

Trang 27

- Lấy mẫu và áp dụng phương pháp để đánh giá một số mẫu thực tế

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Nguyên lý phân tích: Hoạt chất được chiết theo phương pháp thích hợp, dịch chiết được định mức, lọc qua màng lọc 0,45 μm, tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, ghi lại sắc ký đồ

Các số liệu đề tài thu thập từ kết quả thực nghiệm ứng dụng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.3.1 Xử lý mẫu

Từ các tính chất lý hóa của adenosine và cordycepin và theo các tài liệu đã công bố, tôi chọn quy trình xử lý mẫu:

Đồng nhất mẫu

Cân mẫu vào ống ly tâm, thêm dung môi chiết

Lắc xoáy để mẫu và dung môi trộn đều

Chiết mẫu theo cách thích hợp

Ly tâm dịch chiết, thu lấy phần dung dịch Chiết lặp mẫu với dung môi trên Gộp dịch chiết mẫu và định mức đến vạch với cùng dung môi chiết

Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm

Tiêm vào hệ thống sắc ký

a Khảo sát các phương pháp chiết:

Khảo sát hai phương pháp chiết: chiết bằng siêu âm và đun hồi lưu cách thủy

b Khảo sát điều kiện chiết:

Dung môi chiết: khảo sát các dung môi chiết là hỗn hợp nước–ethanol, nước–methanol với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn được dung môi chiết phù hợp nhất

Thời gian chiết: khảo sát thời gian chiết 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút Khảo sát số lần chiết: cùng một nền mẫu chiết lặp lại 1, 2, 3 lần, so sánh kết quả giữa các mẫu

Khảo sát nhiệt độ chiết: cùng một nền mẫu, chiết bằng siêu âm, khảo sát ở nhiệt độ thường, 50oC, 75oC, 100oC

Trang 28

Dung môi chiết

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến 2.3.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký:

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi Chromaster detector PDA để khảo sát điều kiện sắc ký mẫu chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin:

Trang 29

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

Chiết mẫu nghiên cứu theo quy trình đã lựa chọn, chạy sắc ký các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu: tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại

Khảo sát độ đặc hiệu (độ chọn lọc): Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của hai chất chuẩn

Khoảng nồng độ tuyến tính:

- Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối tương quan tuyến tính trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ đảm bảo sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được Y và nồng độ chất phân tích X)

- Xây dựng đường chuẩn 6 điểm X1 đến X6 của dung dịch chứa chất chuẩn adenosin, cordycepin ở trong khoảng nồng độ phù hợp Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn Xác định phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ từng chất

độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng

- Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD% < 5,3% [11]

Độ đúng:

- Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thực nghiệm thu được với giá trị thực của kết quả Tiến hành bằng phương pháp thêm chuẩn, mỗi nồng độ tiến hành sắc ký 3 lần thử nghiệm riêng biệt

- Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi đạt 95,0-105,0% [11]

Ngày đăng: 27/07/2015, 09:28

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo Loại Chi tiết
1. Bộ Y tế - Vụ khoa học và đào tạo (2012), Dược lý học tập 2, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, pp. 40 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Dược lý học tập 2
Tác giả: Bộ Y tế - Vụ khoa học và đào tạo
Nhà XB: Nhà xuất bản Y học Hà Nội
Năm: 2012
2. Bộ Y tế - Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm Dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 84-110 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Kiểm nghiệm Dược phẩm
Tác giả: Bộ Y tế - Vụ khoa học và đào tạo
Nhà XB: Nhà xuất bản Y học
Năm: 2007
3. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu và kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, NXB Y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh, pp Sách, tạp chí
Tiêu đề: Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu và kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên
Tác giả: Nguyễn Minh Đức
Nhà XB: NXB Y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh
Năm: 2006
4. Nguyễn Thị Vân Anh (2014), Xác định adenosin trong thực phẩm chức năng có chứa Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, trường Đại học Dược Hà Nội, pp. 27-40 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Xác định adenosin trong thực phẩm chức năng có chứa Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC
Tác giả: Nguyễn Thị Vân Anh
Năm: 2014
5. Trần Tử Hiếu, Tử Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích phần 2, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, pp. 173-223 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Hóa học phân tích phần 2
Tác giả: Trần Tử Hiếu, Tử Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung
Nhà XB: Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật
Năm: 2007
6. Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, pp. 15-58.Tài liệu Tiếng anh Sách, tạp chí
Tiêu đề: Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh
Tác giả: Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia
Nhà XB: Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật
Năm: 2010

TRÍCH ĐOẠN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w