Tiến hành: Trên cùng một nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT chúng tôi tiến hành chiết theo dự kiến, sử dụng dung môi với các tỷ lệ khác nhau, cố định các thông số còn lại (phƣơng pháp: siêu âm, thời gian chiết: 30 phút, nhiệt độ chiết: 25⁰C, số lần chiết: 1 lần). Với mỗi loại dung môi phân tích lặp lại 3 lần, tính kết quả trung bình. Kết quả phân tích đƣợc chỉ ra trong hình sau:
Hình 3.3. Kết quả khảo sát dung môi chiết
Nhận xét: Kết quả cho thấy khi sử dụng dung môi H2O hoặc MeOH : H2O = 1 : 9 hoặc MeOH : H2O = 5 : 5, hàm lƣợng adenosin và cordycepin đều cao hơn hẳn khi sử dụng các dung môi còn lại nhƣng dung môi H2O cho hàm lƣợng cả hai chất cần phân tích đều cao nhất. Vì vậy, chúng tôi quyết định sử dụng dung môi chiết là H2O vì không độc hại, không gây ô nhiễm môi trƣờng, không dễ cháy nổ và tiết kiệm hơn các loại dung môi khác.
3.3.2. Khảo sát phương pháp chiết
Tiến hành: Trên cùng một nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT, chúng tôi tiến hành chiết theo hai phƣơng pháp: siêu âm và hồi lƣu, cố định các thông số còn lại (dung
0 10 20 30 40 50 60 70 H àm lƣợng ( m g/1 00 g) Dung môi Adenosin Cordycepin
môi chiết : H2O, thời gian chiết: 30 phút, nhiệt độ chiết: 25⁰C, số lần chiết: 1 lần). Ở mỗi mức nhiệt độ tiến hành làm lặp 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Hình 3.4. Kết quả khảo sát phương pháp chiết
Nhận xét: Hàm lƣợng của adenosine (23,04 mg/100g) và cordycepin (61,12 mg/100g) thu đƣợc trong mẫu khi chiết bằng siêu âm đều cao hơn so với hàm lƣợng của adenosin (18,01 mg/100g) và cordycepin (58,2 mg/100g) khi chiết bằng phƣơng pháp hồi lƣu vì siêu âm có tác dụng tăng mạnh tính thấm thấu và khuếch tán nhờ những tác dụng của sóng siêu âm: làm tăng diện tích tiếp xúc giữ hai pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ, tăng cƣờng sự xáo trộn của hỗn hợp, có tác dụng làm nóng tại chỗ. Do đó, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp siêu âm để chiết chất cần phân tích ra khỏi nền mẫu.
3.3.3. Khảo sát nhiệt độ chiết
Tiến hành: Trên cùng một nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT, tiến hành chiết ở nhiệt độ khác nhau: 25⁰C, 50oC, 75oC, 100oC và cố định những thông số còn lại (dung môi chiết : H2O, phƣơng pháp: siêu âm, thời gian chiết: 30 phút, số lần chiết: 1 lần). Ở mỗi mức nhiệt độ tiến hành làm lặp 3 lần, lấy kết quả trung bình.
0 10 20 30 40 50 60 70 Adenosin Cordycepin H àm lƣợng ( m g/1 00 g) Siêu âm Đun hồi lƣu
Hình 3.5. Khảo sát nhiệt độ chiết
Nhận xét: Hàm lƣợng adenosin thu đƣợc trong mẫu tăng khi tăng nhiệt độ chiết mẫu tăng từ 25ºC lên 50ºC. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ chiết lên 75ºC và 100ºC thì hàm lƣợng adenosin sẽ giảm dần do tinh bột bị hồ hóa làm giảm khả năng hòa tan hoạt chất vào dung môi chiết. Hàm lƣợng cordycepin thu đƣợc khi chiết ở 25ºCvà 50ºC xấp xỉ nhau, tăng lên khi nhiệt độ chiết tăng lên 75ºC và 100ºC nhƣng tăng không đáng kể. Từ kết quả trên, chúng tôi quyết định sử dụng nhiệt độ 50ºC để chiết các chất phân tích ra khỏi nền mẫu vì khi tăng nhiệt độ sẽ làm tăng hệ số khuếch tán, lƣợng chất khuếch tán cũng tăng lên, đồng thời làm giảm độ nhớt của dung môi do đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất, đồng thời nếu tăng nhiệt độ lên quá cao có thể ảnh hƣởng tới chất phân tích cũng nhƣ làm tăng tạp chất trong dịch chiết ảnh hƣởng tới kết quả.
3.3.4. Khảo sát thời gian chiết
Tiến hành: Trên nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT, chúng tôi tiến hành chiết mẫu theo quy trình dự kiến với thời gian thay đổi: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và cố định các thông số còn lại (dung môi chiết : H2O, phƣơng pháp: siêu âm, nhiệt độ chiết: 50⁰C, số lần chiết: 1 lần), kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
0 20 40 60 80 25 50 75 100 Hàm lƣợng (mg/100g) Nhiệt độ ( ºC) Cordycepin Adenosin
Hình 3.6. Khảo sát thời gian chiết
Nhận xét: Hàm lƣợng adenosin thu đƣợc tăng khi thời gian chiết tăng từ 30 phút đến 60 phút nhƣng hiệu suất chiết tăng không đáng kể. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian lên 90 phút, 120 phút thì hàm lƣợng giảm dần. Hàm lƣợng cordycepin thu đƣợc trong mẫu tăng khi tăng thời gian chiết nhƣng tăng không đáng kể. Do đó, chúng tôi lựa chọn thời gian 30 phút để chiết adenosin và cordycepin ra khỏi nền mẫu vì nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp ảnh hƣởng tới kết quả phân tích.
3.3.5. Khảo sát số lần chiết
Tiến hành: Trên nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT chúng tôi tiến hành chiết lặp lại 3 lần để khảo sát khả năng chiết, cố định những thông số còn lại (dung môi chiết: H2O, phƣơng pháp: siêu âm, thời gian chiết: 30 phút, nhiệt độ chiết: 50⁰C ). Tại mỗi lần chiết chúng tôi làm lặp 3 lần song song, lấy kết quả trung bình. Kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.4. Khảo sát số lần chiết
Số lần chiết HL Adenosine (mg/100g) HL cordycepin (mg/100g)
1 21,75 60,05 2 22,13 60,32 3 18,32 61,12 0 10 20 30 40 50 60 70 30 60 90 120 Hàm lƣợng (mg/100g) T hời g ia n ( ph út) Cordycepin Adenosin
Nhận xét: Hàm lƣợng của adenosin tăng theo số lần chiết, tuy nhiên giữa các lần hàm lƣợng tăng không đáng kể. Hàm lƣợng cordycepin thu đƣợc trong mẫu thay đổi không đáng kể khi tăng số lần chiết. Vì vậy, chúng tôi quyết định tiến hành chiết một lần vẫn đảm bảo hiệu suất và tiết kiệm dung môi.
3.3.6. Điều kiện tối ưu của quá trình xử lý mẫu
Sau khi khảo sát, chúng tôi quyết định sử dụng phƣơng pháp chiết adenosin và cordycepin từ TPCN dạng bột chứa ĐTHT theo quy trình sau đây:
Hình 3.7. Quy trình phân tích mẫu thực
Cột sắc ký: InertSustain C18 ( 4,6mm × 250mm × 5µm) Detector DAD bƣớc sóng khoảng 260nm
Pha động gồm 2 kênh: kênh A là H2O và kênh B là MeOH theo chƣơng trình gradient: 0–3 phút: 2% A; 3–10 phút: 2–10% B; 10–25 phút: 10–22% B; 25– 30 phút: 22-100% A; 30–40 phút: 100–2% B.
Cân mẫu (0,30 - 0,50 g bột) vào ống ly tâm
15 mL Lắc vortex (5 phút)
Siêu âm (50oC, 30 phút)
Chuyển toàn bộ vào bình định mức 25 mL
Ly tâm nguội (6000 rpm, 5 phút) Định mức
Lọc (45μm)
Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút. Nhiệt độ cột: 40⁰C.
Thể tích bơm mẫu: 20 µL.
3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích
3.4.1. Độ đặc hiệu
Chuẩn bị dung dịch chuẩn nồng độ 20 µg/mL, dung dịch thử và mẫu trắng nhƣ trên. Tiến hành: Sắc ký với điều kiện đã chọn với 3 mẫu chuẩn bị trên. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn adenosin và cordycepin
Nhận xét: Trên nền mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian phân tích từ 20 - 24 phút của hai chất cần phân tích, chứng tỏ phƣơng pháp có độ đặc hiệu tốt.
3.4.2. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính và lập đường chuẩn
Tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn có nồng độ adenosin và cordycepin từ 1- 40 µg/mL, sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị diện tích pic đo đƣợc ứng với các nồng độ của dung dịch trên và thiết lập phƣơng trình hồi quy và hệ số tƣơng quan r. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ sau:
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ adenosin, cordycepin và diện tích pic Nồng độ (µg/mL) Diện tích (mAU.s) Adenosin Cordycepin 1 302556 221489 2 608458 458354 4 1133748 861991 8 2268696 1732802 20 5588561 4542506 40 11308213 9206571
Phƣơng trình hồi quy y = 28163x + 14604 y = 23037x - 46866 Hệ số tƣơng quan (r) 0,9999 0,9999
Hình 3.10. Đường chuẩn của adenosin ( nồng độ 1–40 µg/mL)
Hình 3.11. Đường chuẩn của cordycepin ( nồng độ 1–40 µg/mL)
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát, ta thấy do hệ số tƣơng quan (r) adenosine là 0,9999, của cordycepin là 0,9999. Vì vậy có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ chất cần định lƣợng.
3.4.3. Độ lặp lại
Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần với cùng một nồng mẫu chế phẩm, tính hàm lƣợng dựa vào đƣờng chuẩn xây dựng cùng ngày phân tích, xác định độ lệch tƣơng đối RSD% của hàm lƣợng. 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Diện tích (m AU. s) Nồng độ (µg/mL) Đƣờng chuẩn adenosin 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Diện tích (m AUs) Nồng độ (µg/mL) Đƣờng chuẩn cordycepin
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp Lần Lƣợng cân (g) Adenosin Cordycepin Diện tích pic (mAU.s) HL (mg/100g) Diện tích pic (mAU.s) HL (mg/100g) 1 0,3125 815410 23,34 1959372 61,70 2 0,3292 820817 22,31 2080731 62,20 3 0,3191 763926 21,41 2006507 61,89 4 0,3285 820061 22,33 1940530 59,13 5 0,2925 749271 22,91 1904420 64,07 6 0,2892 760164 23,51 1835284 62,45 TB 22,64 61,74 RSD (%) 3,14 3,17
Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ 100 ppm – 10 ppm độ lệch chuẩn tƣơng đối của phƣơng pháp (RSD) phải đạt < 5,3 %. Kết quả phân tích cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối của adenosine là 3,14 %, của cordycepin là 3,17 %. Nhƣ vậy, phƣơng pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC [11].
3.4.4. Độ đúng
Tiến hành trên nền mẫu thử, chúng tôi thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau (mức thấp, trung bình và mức cao), sau đó tiến hành phân tích lặp 3 lần.
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ thu hồi adenosin và cordycepin của phương pháp
Thêm chuẩn Lần Độ thu hồi (R %)
Adenosin Cordycepin Mức 1 Adenosin: 5,13 µg/mL Cordycepin: 5,3 µg/mL 1 100,7 97,6 2 99,2 99,8 3 102,1 99,2 TB 100,7 98,9 RSD (%) 1,09 1,17 Mức 2 Adenosin: 10,25 µg/mL Cordycepin: 10,6 µg/mL 1 104,4 104,0 2 102,2 101,4 3 101,0 100,1 TB 102,6 101,8 RSD (%) 1,68 1,98 Mức 3 Adenosin: 15,38 µg/mL Cordycepin: 15,9 µg/mL 1 103,5 101,1 2 100,2 104,5 3 102,9 103,1 TB 102,2 102,9 RSD (%) 1,75 1,70
Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ 100 ppm – 10 ppm độ thu hồi của phƣơng pháp phải đạt 95,0-105,0 %. Kết quả phân tích cho thấy độ thu hồi của adenosine trong khoảng 99,2-104,4 % , của cordycepin là 97,6-104, 5 %. Nhƣ vậy, phƣơng pháp có độ thu hồi đạt yêu cầu của AOAC [11].
3.5. Ứng dụng định lƣợng trên một số chế phẩm thực phẩm chức năng dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo. bột chứa Đông trùng hạ thảo.
Trên cơ sở phƣơng pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành định lƣợng adenosin và cordycepin trên các mẫu lấy trên thị trƣờng Hà Nội.
Tiến hành phân tích trên 3 mẫu sản phẩm TPCN chứa ĐTHT đƣợc gửi tới phân tích tại Viện Thực phẩm chức năng. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký, tính hàm lƣợng dựa vào đƣờng chuẩn. Kết quả định lƣợng thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.8. Kết quả phân tích các mẫu TPCN chứa Đông trùng hạ thảo được gửi tới Viện TPCN
Mẫu thử Hàm lƣợng (mg/g) Adenosin Cordycepin 1 0,053 1,83 2 0,103 0,204 0,151 0,296
Nhận xét: Nhƣ vậy, qua kiểm tra trên 3 mẫu sản phẩm TPCN có chứa ĐTHT, có thể thấy hàm lƣợng adenosin và cordycepin thu đƣợc thấp. Tuy nhiên, với số mẫu phân tích còn hạn chế, cách lấy mẫu chƣa đại diện, khuôn khổ nghiên cứu này chƣa đƣa ra đƣợc đánh giá chính xác về hàm lƣợng adenosin và cordycepin trong các chế phẩm TPCN chứa ĐTHT có mặt trên thị trƣờng.
3.6. Bàn luận
HPLC là phƣơng pháp hiện đại đƣợc áp dụng rộng rãi tại các phòng kiểm tra chất lƣợng ở Việt Nam. Với những ƣu điểm nổi bật về độ ổn định, độ chính xác cao, định lƣợng đƣợc nhiều chất không cần phân tách trƣớc tại nhiều bƣớc sóng khác nhau chúng tôi sử dụng phƣơng pháp HPLC để góp phần bƣớc đầu tiêu chuẩn hóa cho chế phẩm chứa ĐTHT mà Dƣợc điển Việt Nam chƣa có chuyên luận nào.
Chúng tôi sử dụng hệ thống HPLC kết nối với detector PDA, cho phép quét toàn bộ phổ hấp thụ tại thời gian lƣu của chất cần phân tích, nếu tách không tốt sẽ lẫn chất khác vào, hệ số chồng phổ Match sẽ khác 1, từ đó có thể biết để thay đổi điều kiện sắc ký để tách tốt hơn. Đồng thời, DAD cho phép phát hiện chất phân tích ở nồng độ rất nhỏ nên kết quả chính xác hơn. Nhất là đối với mẫu dƣợc liệu nên sử dụng detector PDA để đảm bảo tính đặc hiệu tốt.
Chúng tôi sử dụng chƣơng trình gradient nồng độ 40 phút sẽ giúp tăng khả năng tách sắc ký, tránh hiện tƣợng doãng pic, chồng pic, dính pic, đồng thời làm sạch cột, ko làm bẩn mẫu trong những lần phân tích tiếp theo.
So với các phƣơng pháp sắc ký bản mỏng, đo màu hay phƣơng pháp điện di mao quản, phƣơng pháp này có độ nhạy, độ ổn định và độ chính xác cao hơn về mặt định tính, định lƣợng. So với phƣơng pháp ký thật LC-MS thì sử dụng HPLC-DAD phổ biến hơn, tiết kiệm hơn.
Đối tƣợng nghiên cứu: ĐTHT là một dƣợc liệu quý, có giá trị cao, do đó việc tiêu chuẩn hóa chất lƣợng của chúng rất quan trọng. Trong đó hai thành phần adenosin và cordycepin đƣợc sử dụng là hoạt chất đánh giá chất lƣợng của ĐTHT. Dƣợc điển Việt Nam chƣa có chuyên luận đánh giá chế phẩm chứa ĐTHT, vì vậy chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài này để nghiên cứu.
Tuy nhiên, chúng tôi mới chỉ thực hiện đƣợc trên 3 mẫu thực tế và lấy mẫu ngẫu nhiên.
Xây dựng quy trình phân tích: Kết quả của đề tài này chúng tôi đã tìm đƣợc các điều kiện tối ƣu cho quá trình phân tích trên hệ thống HPLC kết nối với detector DAD với hệ dung môi thông dụng, rẻ tiền, cột tách thông dụng.
Khảo sát quy trình xử lý mẫu: Chúng tôi tiến hành khảo sát và tìm ra điều kiện chiết adenosin và cordycepin từ mẫu TPCN cho độ lặp lại tốt, hiệu suất chiết cao. Dung môi sử dụng rẻ, an toàn và tiết kiệm, thời gian chiết tƣơng đối ngắn, tốn ít dung môi.
Thẩm định phƣơng pháp: Sau khi xây dựng quy trình phân tích, chúng tôi tiến hành thẩm định phƣơng pháp theo AOAC. Các tiêu chí thẩm định đều đạt yêu cầu của AOAC [11], tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ khảo sát. Kết quả thẩm định cho thấy phƣơng pháp có độ đặc hiệu cao, độ lặp lại tốt. Nhƣ vậy có thể thấy phƣơng pháp chúng tôi xây dựng để định lƣợng adenosin và cordycepin cho kết quả tốt, tính khả thi cao.
Kết quả phân tích mẫu TPCN trên thị trƣờng: Thực nghiệm cho thấy hàm lƣợng adenosin và cordycepin khác nhau giữa các mẫu TPCN. Điều này xảy ra có thể do khi sản xuất sử dụng các loài Cordyceps khác nhau làm nguyên liệu sản
xuất. Vì các loài Cordyceps khác nhau có hàm lƣợng nucleosid khác nhau, cụ thể trong Cordyceps sinensis hàm lƣợng adenosin cao và hàm lƣợng cordycepin thấp. Ngƣợc lại, trong Cordyceps militaris hàm lƣợng cordycepin là chủ yếu. Vì vậy khuyến cáo các nhà sản xuất nên chú trọng khâu thu mua và kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu trƣớc khi đƣa vào sản xuất để đảm bảo chất lƣợng chế phẩm.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận:
Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm thu đƣợc, chúng tôi có một số kết luận sau:
- Đã khảo sát và lựa chọn đƣợc điều kiện HPLC/PDA để phân tích đồng thời hai chất adenosine và cordycepin trong TPCN chứa ĐTHT, cụ thể nhƣ sau
Cột sắc ký: InertSustain C18 (4,6 mm × 250 mm × 5 µm) Detector PDA bƣớc sóng khoảng 260nm
Pha động gồm 2 kênh: kênh A là H2O và kênh B là MeOH theo chƣơng trình gradient: 0-3 phút: 2 % A; 3-10 phút: 2–10 % B; 10-25 phút: 10-22 % B; 25- 30 phút: 22-100 % A; 30-40 phút: 100-2 % B)
Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút Nhiệt độ cột: 40⁰C
Thể tích bơm mẫu: 20 µL
- Đã khảo sát và lựa chọn đƣợc điều kiện tối ƣu chiết đồng thời hai chất từ nền mẫu thực phẩm chức năng chứa Đông trùng hạ thảo dạng bột, cụ thể nhƣ sau:
Dung môi chiết: H2O
Phƣơng pháp chiết: siêu âm Thời gian chiết: 30 phút