Tiến hành: Trên nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT chúng tôi tiến hành chiết lặp lại 3 lần để khảo sát khả năng chiết, cố định những thông số còn lại (dung môi chiết: H2O, phƣơng pháp: siêu âm, thời gian chiết: 30 phút, nhiệt độ chiết: 50⁰C ). Tại mỗi lần chiết chúng tôi làm lặp 3 lần song song, lấy kết quả trung bình. Kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.4. Khảo sát số lần chiết
Số lần chiết HL Adenosine (mg/100g) HL cordycepin (mg/100g)
1 21,75 60,05 2 22,13 60,32 3 18,32 61,12 0 10 20 30 40 50 60 70 30 60 90 120 Hàm lƣợng (mg/100g) T hời g ia n ( ph út) Cordycepin Adenosin
Nhận xét: Hàm lƣợng của adenosin tăng theo số lần chiết, tuy nhiên giữa các lần hàm lƣợng tăng không đáng kể. Hàm lƣợng cordycepin thu đƣợc trong mẫu thay đổi không đáng kể khi tăng số lần chiết. Vì vậy, chúng tôi quyết định tiến hành chiết một lần vẫn đảm bảo hiệu suất và tiết kiệm dung môi.
3.3.6. Điều kiện tối ưu của quá trình xử lý mẫu
Sau khi khảo sát, chúng tôi quyết định sử dụng phƣơng pháp chiết adenosin và cordycepin từ TPCN dạng bột chứa ĐTHT theo quy trình sau đây:
Hình 3.7. Quy trình phân tích mẫu thực
Cột sắc ký: InertSustain C18 ( 4,6mm × 250mm × 5µm) Detector DAD bƣớc sóng khoảng 260nm
Pha động gồm 2 kênh: kênh A là H2O và kênh B là MeOH theo chƣơng trình gradient: 0–3 phút: 2% A; 3–10 phút: 2–10% B; 10–25 phút: 10–22% B; 25– 30 phút: 22-100% A; 30–40 phút: 100–2% B.
Cân mẫu (0,30 - 0,50 g bột) vào ống ly tâm
15 mL Lắc vortex (5 phút)
Siêu âm (50oC, 30 phút)
Chuyển toàn bộ vào bình định mức 25 mL
Ly tâm nguội (6000 rpm, 5 phút) Định mức
Lọc (45μm)
Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút. Nhiệt độ cột: 40⁰C.
Thể tích bơm mẫu: 20 µL.
3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích
3.4.1. Độ đặc hiệu
Chuẩn bị dung dịch chuẩn nồng độ 20 µg/mL, dung dịch thử và mẫu trắng nhƣ trên. Tiến hành: Sắc ký với điều kiện đã chọn với 3 mẫu chuẩn bị trên. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn adenosin và cordycepin
Nhận xét: Trên nền mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian phân tích từ 20 - 24 phút của hai chất cần phân tích, chứng tỏ phƣơng pháp có độ đặc hiệu tốt.
3.4.2. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính và lập đường chuẩn
Tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn có nồng độ adenosin và cordycepin từ 1- 40 µg/mL, sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị diện tích pic đo đƣợc ứng với các nồng độ của dung dịch trên và thiết lập phƣơng trình hồi quy và hệ số tƣơng quan r. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ sau:
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ adenosin, cordycepin và diện tích pic Nồng độ (µg/mL) Diện tích (mAU.s) Adenosin Cordycepin 1 302556 221489 2 608458 458354 4 1133748 861991 8 2268696 1732802 20 5588561 4542506 40 11308213 9206571
Phƣơng trình hồi quy y = 28163x + 14604 y = 23037x - 46866 Hệ số tƣơng quan (r) 0,9999 0,9999
Hình 3.10. Đường chuẩn của adenosin ( nồng độ 1–40 µg/mL)
Hình 3.11. Đường chuẩn của cordycepin ( nồng độ 1–40 µg/mL)
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát, ta thấy do hệ số tƣơng quan (r) adenosine là 0,9999, của cordycepin là 0,9999. Vì vậy có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ chất cần định lƣợng.
3.4.3. Độ lặp lại
Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần với cùng một nồng mẫu chế phẩm, tính hàm lƣợng dựa vào đƣờng chuẩn xây dựng cùng ngày phân tích, xác định độ lệch tƣơng đối RSD% của hàm lƣợng. 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Diện tích (m AU. s) Nồng độ (µg/mL) Đƣờng chuẩn adenosin 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Diện tích (m AUs) Nồng độ (µg/mL) Đƣờng chuẩn cordycepin
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp Lần Lƣợng cân (g) Adenosin Cordycepin Diện tích pic (mAU.s) HL (mg/100g) Diện tích pic (mAU.s) HL (mg/100g) 1 0,3125 815410 23,34 1959372 61,70 2 0,3292 820817 22,31 2080731 62,20 3 0,3191 763926 21,41 2006507 61,89 4 0,3285 820061 22,33 1940530 59,13 5 0,2925 749271 22,91 1904420 64,07 6 0,2892 760164 23,51 1835284 62,45 TB 22,64 61,74 RSD (%) 3,14 3,17
Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ 100 ppm – 10 ppm độ lệch chuẩn tƣơng đối của phƣơng pháp (RSD) phải đạt < 5,3 %. Kết quả phân tích cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối của adenosine là 3,14 %, của cordycepin là 3,17 %. Nhƣ vậy, phƣơng pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC [11].
3.4.4. Độ đúng
Tiến hành trên nền mẫu thử, chúng tôi thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau (mức thấp, trung bình và mức cao), sau đó tiến hành phân tích lặp 3 lần.
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ thu hồi adenosin và cordycepin của phương pháp
Thêm chuẩn Lần Độ thu hồi (R %)
Adenosin Cordycepin Mức 1 Adenosin: 5,13 µg/mL Cordycepin: 5,3 µg/mL 1 100,7 97,6 2 99,2 99,8 3 102,1 99,2 TB 100,7 98,9 RSD (%) 1,09 1,17 Mức 2 Adenosin: 10,25 µg/mL Cordycepin: 10,6 µg/mL 1 104,4 104,0 2 102,2 101,4 3 101,0 100,1 TB 102,6 101,8 RSD (%) 1,68 1,98 Mức 3 Adenosin: 15,38 µg/mL Cordycepin: 15,9 µg/mL 1 103,5 101,1 2 100,2 104,5 3 102,9 103,1 TB 102,2 102,9 RSD (%) 1,75 1,70
Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ 100 ppm – 10 ppm độ thu hồi của phƣơng pháp phải đạt 95,0-105,0 %. Kết quả phân tích cho thấy độ thu hồi của adenosine trong khoảng 99,2-104,4 % , của cordycepin là 97,6-104, 5 %. Nhƣ vậy, phƣơng pháp có độ thu hồi đạt yêu cầu của AOAC [11].
3.5. Ứng dụng định lƣợng trên một số chế phẩm thực phẩm chức năng dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo. bột chứa Đông trùng hạ thảo.
Trên cơ sở phƣơng pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành định lƣợng adenosin và cordycepin trên các mẫu lấy trên thị trƣờng Hà Nội.
Tiến hành phân tích trên 3 mẫu sản phẩm TPCN chứa ĐTHT đƣợc gửi tới phân tích tại Viện Thực phẩm chức năng. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký, tính hàm lƣợng dựa vào đƣờng chuẩn. Kết quả định lƣợng thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.8. Kết quả phân tích các mẫu TPCN chứa Đông trùng hạ thảo được gửi tới Viện TPCN
Mẫu thử Hàm lƣợng (mg/g) Adenosin Cordycepin 1 0,053 1,83 2 0,103 0,204 0,151 0,296
Nhận xét: Nhƣ vậy, qua kiểm tra trên 3 mẫu sản phẩm TPCN có chứa ĐTHT, có thể thấy hàm lƣợng adenosin và cordycepin thu đƣợc thấp. Tuy nhiên, với số mẫu phân tích còn hạn chế, cách lấy mẫu chƣa đại diện, khuôn khổ nghiên cứu này chƣa đƣa ra đƣợc đánh giá chính xác về hàm lƣợng adenosin và cordycepin trong các chế phẩm TPCN chứa ĐTHT có mặt trên thị trƣờng.
3.6. Bàn luận
HPLC là phƣơng pháp hiện đại đƣợc áp dụng rộng rãi tại các phòng kiểm tra chất lƣợng ở Việt Nam. Với những ƣu điểm nổi bật về độ ổn định, độ chính xác cao, định lƣợng đƣợc nhiều chất không cần phân tách trƣớc tại nhiều bƣớc sóng khác nhau chúng tôi sử dụng phƣơng pháp HPLC để góp phần bƣớc đầu tiêu chuẩn hóa cho chế phẩm chứa ĐTHT mà Dƣợc điển Việt Nam chƣa có chuyên luận nào.
Chúng tôi sử dụng hệ thống HPLC kết nối với detector PDA, cho phép quét toàn bộ phổ hấp thụ tại thời gian lƣu của chất cần phân tích, nếu tách không tốt sẽ lẫn chất khác vào, hệ số chồng phổ Match sẽ khác 1, từ đó có thể biết để thay đổi điều kiện sắc ký để tách tốt hơn. Đồng thời, DAD cho phép phát hiện chất phân tích ở nồng độ rất nhỏ nên kết quả chính xác hơn. Nhất là đối với mẫu dƣợc liệu nên sử dụng detector PDA để đảm bảo tính đặc hiệu tốt.
Chúng tôi sử dụng chƣơng trình gradient nồng độ 40 phút sẽ giúp tăng khả năng tách sắc ký, tránh hiện tƣợng doãng pic, chồng pic, dính pic, đồng thời làm sạch cột, ko làm bẩn mẫu trong những lần phân tích tiếp theo.
So với các phƣơng pháp sắc ký bản mỏng, đo màu hay phƣơng pháp điện di mao quản, phƣơng pháp này có độ nhạy, độ ổn định và độ chính xác cao hơn về mặt định tính, định lƣợng. So với phƣơng pháp ký thật LC-MS thì sử dụng HPLC-DAD phổ biến hơn, tiết kiệm hơn.
Đối tƣợng nghiên cứu: ĐTHT là một dƣợc liệu quý, có giá trị cao, do đó việc tiêu chuẩn hóa chất lƣợng của chúng rất quan trọng. Trong đó hai thành phần adenosin và cordycepin đƣợc sử dụng là hoạt chất đánh giá chất lƣợng của ĐTHT. Dƣợc điển Việt Nam chƣa có chuyên luận đánh giá chế phẩm chứa ĐTHT, vì vậy chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài này để nghiên cứu.
Tuy nhiên, chúng tôi mới chỉ thực hiện đƣợc trên 3 mẫu thực tế và lấy mẫu ngẫu nhiên.
Xây dựng quy trình phân tích: Kết quả của đề tài này chúng tôi đã tìm đƣợc các điều kiện tối ƣu cho quá trình phân tích trên hệ thống HPLC kết nối với detector DAD với hệ dung môi thông dụng, rẻ tiền, cột tách thông dụng.
Khảo sát quy trình xử lý mẫu: Chúng tôi tiến hành khảo sát và tìm ra điều kiện chiết adenosin và cordycepin từ mẫu TPCN cho độ lặp lại tốt, hiệu suất chiết cao. Dung môi sử dụng rẻ, an toàn và tiết kiệm, thời gian chiết tƣơng đối ngắn, tốn ít dung môi.
Thẩm định phƣơng pháp: Sau khi xây dựng quy trình phân tích, chúng tôi tiến hành thẩm định phƣơng pháp theo AOAC. Các tiêu chí thẩm định đều đạt yêu cầu của AOAC [11], tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ khảo sát. Kết quả thẩm định cho thấy phƣơng pháp có độ đặc hiệu cao, độ lặp lại tốt. Nhƣ vậy có thể thấy phƣơng pháp chúng tôi xây dựng để định lƣợng adenosin và cordycepin cho kết quả tốt, tính khả thi cao.
Kết quả phân tích mẫu TPCN trên thị trƣờng: Thực nghiệm cho thấy hàm lƣợng adenosin và cordycepin khác nhau giữa các mẫu TPCN. Điều này xảy ra có thể do khi sản xuất sử dụng các loài Cordyceps khác nhau làm nguyên liệu sản
xuất. Vì các loài Cordyceps khác nhau có hàm lƣợng nucleosid khác nhau, cụ thể trong Cordyceps sinensis hàm lƣợng adenosin cao và hàm lƣợng cordycepin thấp. Ngƣợc lại, trong Cordyceps militaris hàm lƣợng cordycepin là chủ yếu. Vì vậy khuyến cáo các nhà sản xuất nên chú trọng khâu thu mua và kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu trƣớc khi đƣa vào sản xuất để đảm bảo chất lƣợng chế phẩm.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận:
Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm thu đƣợc, chúng tôi có một số kết luận sau:
- Đã khảo sát và lựa chọn đƣợc điều kiện HPLC/PDA để phân tích đồng thời hai chất adenosine và cordycepin trong TPCN chứa ĐTHT, cụ thể nhƣ sau
Cột sắc ký: InertSustain C18 (4,6 mm × 250 mm × 5 µm) Detector PDA bƣớc sóng khoảng 260nm
Pha động gồm 2 kênh: kênh A là H2O và kênh B là MeOH theo chƣơng trình gradient: 0-3 phút: 2 % A; 3-10 phút: 2–10 % B; 10-25 phút: 10-22 % B; 25- 30 phút: 22-100 % A; 30-40 phút: 100-2 % B)
Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút Nhiệt độ cột: 40⁰C
Thể tích bơm mẫu: 20 µL
- Đã khảo sát và lựa chọn đƣợc điều kiện tối ƣu chiết đồng thời hai chất từ nền mẫu thực phẩm chức năng chứa Đông trùng hạ thảo dạng bột, cụ thể nhƣ sau:
Dung môi chiết: H2O
Phƣơng pháp chiết: siêu âm Thời gian chiết: 30 phút Số lần chiết: 1 lần Nhiệt độ chiết: 50⁰C
- Đã thẩm định phƣơng pháp phân tích đồng thời hai chất adenosine và cordycepin trong TPCN chứa ĐTHT, kết quả đạt theo quy định của AOAC.
Phƣơng pháp có tính đặc hiệu đáp ứng yêu cầu
Hai chất tuyến tính tốt trong khoảng 1-40 µg/mL đối với cả hai chất Độ lặp lại của phƣơng pháp tốt với RSD (%) < 5,3 % cho cả hai chất trên nền mẫu thực phẩm chức năng
Độ thu hồi đạt của adenosin là 99,2-104,4 %, của cordycepin là 97,6- 104, 5 %, đáp ứng yêu cầu đề ra.
- Đã ứng dụng phƣơng pháp để định lƣợng adenosin và cordycepin trên 3 chế phẩm TPCN dạng bột chứa ĐTHT đang lƣu hành trên thị trƣờng. Kết quả phân tích cho thấy các mẫu TPCN trên thị trƣờng có hàm lƣợng adenosin và cordycepin chênh lệch nhau nhiều giữa các chế phẩm.
Kiến nghị:
- Ứng dụng phƣơng pháp để kiểm tra chất lƣợng sản phẩm dạng rắn chứa ĐTHT, đồng thời mở rộng phƣơng pháp phân tích với các chế phẩm dạng lỏng và các đối tƣợng sản phẩm chứa ĐTHT khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng việt
1. Bộ Y tế - Vụ khoa học và đào tạo (2012), Dược lý học tập 2, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, pp. 40.
2. Bộ Y tế - Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm Dược phẩm, Nhà
xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 84-110.
3. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu và kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên,
NXB Y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh, pp.
4. Nguyễn Thị Vân Anh (2014), Xác định adenosin trong thực phẩm chức năng
có chứa Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC, Khóa luận tốt nghiệp
dƣợc sĩ đại học, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, pp. 27-40.
5. Trần Tử Hiếu, Tử Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007),
Hóa học phân tích phần 2, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Nhà xuất bản
Khoa học và kỹ thuật, pp. 173-223.
6. Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định
phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh, Nhà xuất bản Khoa học và
Kỹ thuật, Hà Nội, pp. 15-58.
Tài liệu Tiếng anh
7. Adamson R. H., Zaharevitz D. W., Johns D. G. (1977), "Enhancement of the biological activity of adenosine analogs by the adenosine deaminase inhibitor 2’-deoxycoformycin", Pharmacology, 15(1), pp. 84-89.
8. Dong C. H., Xie X. Q., Wang X. L. (2009), "Application of Box-Behnken design in optimisation for polysaccharides extraction from cultured mycelium of Cordyceps sinensis", Food and bioproducts processing, 87(2), pp. 139-144.
9. Guieu R. et al (1998), "Adenosine and the nervous system: pharmacological data and therapeutic perspectives", General Pharmacology: The Vascular System, 31(4), pp. 553-561.
10. Hori M., Kitakaze M. (1991), "Adenosine, the heart, and coronary circulation", Hypertension, 18(5), pp. 565-574.
11. Horwitz W (2002), "AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals", AOAC International: Gaithersburg, MD, USA, pp. 12-19.
12. Huang Lan-Fang, Liang Yi-Zeng, Guo Fang-Qiu (2003), "Simultaneous separation and determination of active components in Cordyceps sinensis and Cordyceps militarris by LC/ESI-MS", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 33(5), pp. 1155-1162.
13. Huang L., Li Q,, Chen Y., Wang X. (2009), "Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps spp", Afr J Microbiol
Res, 3(12), pp. 957-961.
14. Kumar H., Spandana M. (2013), "Simultaneous Extraction, determination and analysis of Adenosine, Cordycepin and other derivatives of Cordyceps sinensis of Nepal by new validated HPLC method", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2(4), pp. 43-45.
15. Li C., Yan A., Cai C. (2012), "[Fast determination of adenosine and cordycepin in Cordyceps and its deserted solid medium]", Se pu= Chinese journal of chromatography/Zhongguo hua xue hui, 30(7), pp. 711-715.
16. Li S. P., Yang F.Q., Tsim Karl W. K. (2006), "Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 41(5), pp. 1571-1584.
17. Ma King‐Wah, Chau Foo‐Tim, Wu Jian‐Yong (2004), "Analysis of the Nucleoside Content of Cordyceps sinensis Using the Stepwise Gradient Elution Technique of Thin‐layer Chromatography", Chinese Journal of Chemistry, 22(1), pp. 85-91.
18. Ontyd J., Schrader J. (1984), "Measurement of adenosine, inosine, and hypoxanthine in human plasma", Journal of Chromatography B: Biomedical
Sciences and Applications, 307, pp. 404-409.
19. Rao Y. K., Fang Shih-Hua, Wu Wen-Shi (2010), "Constituents isolated from Cordyceps militaris suppress enhanced inflammatory mediator's production and human cancer cell proliferation", Journal of ethnopharmacology, 131(2), pp. 363-367.
20. Shin S., Lee S., Kwon J. (2009), "Cordycepin suppresses expression of diabetes regulating genes by inhibition of lipopolysaccharide-induced inflammation in macrophages", Immune network, 9(3), pp. 98-105.
21. Song Jiang‐Feng, Liu Chun‐Quan, Li Da‐Jing (2007), "Optimization of