Thu thập một số chế phẩm TPCN chứa ĐTHT dạng bột.
Tiến hành phân tích thành phần adenosin và cordycepin trong chế phẩm theo quy trình đã xây dựng.
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thực nghiệm đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê trên Microsoft Ofice Excel 2007.
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Chuẩn bị mẫu
Dung dịch chuẩn:
- Dung dịch chuẩn adenosin: Cân chính xác khoảng 20,0 mg chuẩn adenosin vào bình định mức dung tích 100 mL, thêm khoảng 15 mL MeOH, siêu âm trong 5 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc kỹ (dung dịch 1). Hút chính xác 2 mL dung dịch 1 pha loãng bằng MeOH trong bình định mức 10 mL thu đƣợc dung dịch chuẩn adenosine nồng độ 40 µg/mL tiến hành khảo sát.
- Dung dịch chuẩn cordycepin: Cân chính xác 10,0 mg chất chuẩn cordycepin vào bình định mức dung tích 50 mL, thêm khoảng 30 mL MeOH, lắc siêu âm trong 5 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch lắc kỹ (dung dịch 2). Hút chính xác 2 mL dung dịch 2 pha loãng bằng MeOH trong bình định mức 10 mL thu đƣợc dung dịch chuẩn cordycepin nồng độ 40 µg/mL tiến hành khảo sát.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp:
Cân chính xác khoảng 20,0 mg chất chuẩn adenosin và 20,0 mg chất chuẩn cordycein vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng thêm khoảng 30 mL MeOH, lắc siêu âm trong 5 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch lắc kỹ (dung dịch 3). Hút chính xác 1mL dung dịch 1 pha loãng bằng MeOH trong bình định mức 10 mL thu đƣợc dung dịch chuẩn gốc nồng độ 40 µg/mL tiến hành khảo sát.
Từ dung dịch chuẩn 40 µg/ml tiến hành pha loãng trong các bình định mức 20mL thành các dung dịch chuẩn có nồng độ 1 µg/mL, 2 µg/mL, 4 µg/mL, 8 µg/mL, 20 µg/mL theo bảng sau:
Bảng 3.1. Cách pha dãy dung dịch chuẩn
Nồng độ (µg/mL) 1 2 4 8 20
Thể tích chính xác dung dịch chuẩn 40 µg/ml cần lấy (mL)
Dung dịch thử:
Cân chính xác khoảng 0,30 g bột chế phẩm vào bình định mức 25 mL, thêm khoảng 15 mL H2O siêu âm 30 phút, thêm H2O vừa đủ đến vạch lắc kỹ. Lọc bỏ khoảng 10 mL dịch đầu, dịch lọc đƣợc lọc qua màng lọc 0,45 µm thu đƣợc dung dịch thử.
Dung dịch mẫu trắng:
Cân chính xác khoảng 0,30 g mẫu placebo vào bình định mức 25 mL, thêm khoảng 15 mL H2O lắc siêu âm 30 phút, thêm H2O vừa đủ đến vạch lắc kỹ. Lọc bỏ khoảng 10 mL dịch đầu, lọc qua màng lọc 0,45 µm thu đƣợc dung dịch mẫu trắng.
3.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký
3.2.1. Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện
Qua tham khảo các tài liệu với điều kiện của phòng thí nghiệm và thực nghiệm, chúng tôi tiến hành phân tích adenosin và cordycepin trên hệ thống HPLC, detector PDA với các điều kiện nhƣ sau:
Cột sắc ký: cột C18 ( 4,6 x 25 mm, 5 µm). Detector PDA bƣớc sóng khoảng 260 nm. Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.
Nhiệt độ cột: 40⁰C.
Thể tích tiêm mẫu: 20 µL.
Chúng tôi tiến hành quét phổ của pic adenosin và cordycepin trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 20 µg/mL cho kết quả nhƣ hình 3.1 và 3.2.
Hình 3.1. Phổ hấp thụ của adenosin
Hình 3.2. Phổ hấp thụ của cordycepin
Nhận xét: Từ phổ đồ thu đƣợc, chúng tôi quyết định lựa chọn bƣớc sóng đo là khoảng 260 nm.
3.2.2. Khảo sát và lựa chọn pha động
Pha động là yếu tố quan trọng đến hiệu quả tách sắc ký, nó có thể ảnh hƣởng tới tốc độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lƣu giữ, hiệu lực của cột tách, độ phân giải, độ rộng của pic sắc ký…
Tiến hành với các thành phần pha động khác nhau gồm: Kênh A là H2O, kênh B là dung môi ACN hay MeOH, cố định các điều kiện phân tích khác. Quá trình khảo sát cho kết quả nhƣ sau
Bảng 3.2. Khảo sát thành phần pha động
Thành phần pha động (92 : 8) Thời gian lƣu (phút) Kết quả
Kênh A Kênh B Adenosin Cordycepin
H2O ACN 5,6 7,0 Pic đẹp, gọn
H2O MeOH 16,7 22,6 Pic trải rộng
Nhận xét: Mặc dù chƣơng trình chạy sử dụng H2O và ACN cho pic đẹp, gọn nhƣng thời gian lƣu nhanh, chất cần phân tích có thể chƣa tách đƣợc hết khỏi nền mẫu thử, đồng thời sử dụng dung môi ACN tốn kém hơn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát chƣơng trình gradient.
Sau khi tiến hành chạy 5 chƣơng trình gradient, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát chương trình gradient 1, 2, 3
Gradient Thời gian lƣu (phút) Kết quả
Adenosin Cordycepin Adenosin Cordycepin
Gradient 1 21,5 21,8 Pic xấu, chân không gọn
Pic thấp, pic xấu, choãi chân Gradient 2 23,7 28,1 Pic xấu, kéo đuôi Pic đẹp, cân đối,
gọn Gradient 3 11,4 Không có Pic xấu, không
cân xứng
Không có Gradient 4 9,31 9,91 Pic gọn, đẹp nhƣng hai pic tách nhau
không tốt
Gradient 5 20,96 23,02 Pic gọn, đẹp, cân đối, hai pic tách nhau tốt
Nhận xét: Với chƣơng trình gradient 5 (Kênh A là H2O và kênh B là MeOH theo chƣơng trình gradient: 0-3 phút: 2% A; 3-10 phút: 2–10% B; 10-25 phút: 10- 22% B; 25-30 phút: 22-100% A; 30-40 phút: 100-2% B) thì pic adenosin và cordycepin rất nhọn, cân đối, sắc ký đồ chạy ổn định, lặp lại với thời gian lƣu hợp lý. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chƣơng trình gradient 5 để tách và định lƣợng chất phân tích.
3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Theo quy trình xử lý mẫu dự kiến, trân nền mẫu TPCN chứa ĐTHT dạng bột, tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình chiết nhƣ: phƣơng pháp
chiết, dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, số lần chiết trên nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT.
3.3.1. Khảo sát dung môi chiết
Tiến hành: Trên cùng một nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT chúng tôi tiến hành chiết theo dự kiến, sử dụng dung môi với các tỷ lệ khác nhau, cố định các thông số còn lại (phƣơng pháp: siêu âm, thời gian chiết: 30 phút, nhiệt độ chiết: 25⁰C, số lần chiết: 1 lần). Với mỗi loại dung môi phân tích lặp lại 3 lần, tính kết quả trung bình. Kết quả phân tích đƣợc chỉ ra trong hình sau:
Hình 3.3. Kết quả khảo sát dung môi chiết
Nhận xét: Kết quả cho thấy khi sử dụng dung môi H2O hoặc MeOH : H2O = 1 : 9 hoặc MeOH : H2O = 5 : 5, hàm lƣợng adenosin và cordycepin đều cao hơn hẳn khi sử dụng các dung môi còn lại nhƣng dung môi H2O cho hàm lƣợng cả hai chất cần phân tích đều cao nhất. Vì vậy, chúng tôi quyết định sử dụng dung môi chiết là H2O vì không độc hại, không gây ô nhiễm môi trƣờng, không dễ cháy nổ và tiết kiệm hơn các loại dung môi khác.
3.3.2. Khảo sát phương pháp chiết
Tiến hành: Trên cùng một nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT, chúng tôi tiến hành chiết theo hai phƣơng pháp: siêu âm và hồi lƣu, cố định các thông số còn lại (dung
0 10 20 30 40 50 60 70 H àm lƣợng ( m g/1 00 g) Dung môi Adenosin Cordycepin
môi chiết : H2O, thời gian chiết: 30 phút, nhiệt độ chiết: 25⁰C, số lần chiết: 1 lần). Ở mỗi mức nhiệt độ tiến hành làm lặp 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Hình 3.4. Kết quả khảo sát phương pháp chiết
Nhận xét: Hàm lƣợng của adenosine (23,04 mg/100g) và cordycepin (61,12 mg/100g) thu đƣợc trong mẫu khi chiết bằng siêu âm đều cao hơn so với hàm lƣợng của adenosin (18,01 mg/100g) và cordycepin (58,2 mg/100g) khi chiết bằng phƣơng pháp hồi lƣu vì siêu âm có tác dụng tăng mạnh tính thấm thấu và khuếch tán nhờ những tác dụng của sóng siêu âm: làm tăng diện tích tiếp xúc giữ hai pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ, tăng cƣờng sự xáo trộn của hỗn hợp, có tác dụng làm nóng tại chỗ. Do đó, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp siêu âm để chiết chất cần phân tích ra khỏi nền mẫu.
3.3.3. Khảo sát nhiệt độ chiết
Tiến hành: Trên cùng một nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT, tiến hành chiết ở nhiệt độ khác nhau: 25⁰C, 50oC, 75oC, 100oC và cố định những thông số còn lại (dung môi chiết : H2O, phƣơng pháp: siêu âm, thời gian chiết: 30 phút, số lần chiết: 1 lần). Ở mỗi mức nhiệt độ tiến hành làm lặp 3 lần, lấy kết quả trung bình.
0 10 20 30 40 50 60 70 Adenosin Cordycepin H àm lƣợng ( m g/1 00 g) Siêu âm Đun hồi lƣu
Hình 3.5. Khảo sát nhiệt độ chiết
Nhận xét: Hàm lƣợng adenosin thu đƣợc trong mẫu tăng khi tăng nhiệt độ chiết mẫu tăng từ 25ºC lên 50ºC. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ chiết lên 75ºC và 100ºC thì hàm lƣợng adenosin sẽ giảm dần do tinh bột bị hồ hóa làm giảm khả năng hòa tan hoạt chất vào dung môi chiết. Hàm lƣợng cordycepin thu đƣợc khi chiết ở 25ºCvà 50ºC xấp xỉ nhau, tăng lên khi nhiệt độ chiết tăng lên 75ºC và 100ºC nhƣng tăng không đáng kể. Từ kết quả trên, chúng tôi quyết định sử dụng nhiệt độ 50ºC để chiết các chất phân tích ra khỏi nền mẫu vì khi tăng nhiệt độ sẽ làm tăng hệ số khuếch tán, lƣợng chất khuếch tán cũng tăng lên, đồng thời làm giảm độ nhớt của dung môi do đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất, đồng thời nếu tăng nhiệt độ lên quá cao có thể ảnh hƣởng tới chất phân tích cũng nhƣ làm tăng tạp chất trong dịch chiết ảnh hƣởng tới kết quả.
3.3.4. Khảo sát thời gian chiết
Tiến hành: Trên nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT, chúng tôi tiến hành chiết mẫu theo quy trình dự kiến với thời gian thay đổi: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và cố định các thông số còn lại (dung môi chiết : H2O, phƣơng pháp: siêu âm, nhiệt độ chiết: 50⁰C, số lần chiết: 1 lần), kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
0 20 40 60 80 25 50 75 100 Hàm lƣợng (mg/100g) Nhiệt độ ( ºC) Cordycepin Adenosin
Hình 3.6. Khảo sát thời gian chiết
Nhận xét: Hàm lƣợng adenosin thu đƣợc tăng khi thời gian chiết tăng từ 30 phút đến 60 phút nhƣng hiệu suất chiết tăng không đáng kể. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian lên 90 phút, 120 phút thì hàm lƣợng giảm dần. Hàm lƣợng cordycepin thu đƣợc trong mẫu tăng khi tăng thời gian chiết nhƣng tăng không đáng kể. Do đó, chúng tôi lựa chọn thời gian 30 phút để chiết adenosin và cordycepin ra khỏi nền mẫu vì nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp ảnh hƣởng tới kết quả phân tích.
3.3.5. Khảo sát số lần chiết
Tiến hành: Trên nền mẫu TPCN có chứa ĐTHT chúng tôi tiến hành chiết lặp lại 3 lần để khảo sát khả năng chiết, cố định những thông số còn lại (dung môi chiết: H2O, phƣơng pháp: siêu âm, thời gian chiết: 30 phút, nhiệt độ chiết: 50⁰C ). Tại mỗi lần chiết chúng tôi làm lặp 3 lần song song, lấy kết quả trung bình. Kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.4. Khảo sát số lần chiết
Số lần chiết HL Adenosine (mg/100g) HL cordycepin (mg/100g)
1 21,75 60,05 2 22,13 60,32 3 18,32 61,12 0 10 20 30 40 50 60 70 30 60 90 120 Hàm lƣợng (mg/100g) T hời g ia n ( ph út) Cordycepin Adenosin
Nhận xét: Hàm lƣợng của adenosin tăng theo số lần chiết, tuy nhiên giữa các lần hàm lƣợng tăng không đáng kể. Hàm lƣợng cordycepin thu đƣợc trong mẫu thay đổi không đáng kể khi tăng số lần chiết. Vì vậy, chúng tôi quyết định tiến hành chiết một lần vẫn đảm bảo hiệu suất và tiết kiệm dung môi.
3.3.6. Điều kiện tối ưu của quá trình xử lý mẫu
Sau khi khảo sát, chúng tôi quyết định sử dụng phƣơng pháp chiết adenosin và cordycepin từ TPCN dạng bột chứa ĐTHT theo quy trình sau đây:
Hình 3.7. Quy trình phân tích mẫu thực
Cột sắc ký: InertSustain C18 ( 4,6mm × 250mm × 5µm) Detector DAD bƣớc sóng khoảng 260nm
Pha động gồm 2 kênh: kênh A là H2O và kênh B là MeOH theo chƣơng trình gradient: 0–3 phút: 2% A; 3–10 phút: 2–10% B; 10–25 phút: 10–22% B; 25– 30 phút: 22-100% A; 30–40 phút: 100–2% B.
Cân mẫu (0,30 - 0,50 g bột) vào ống ly tâm
15 mL Lắc vortex (5 phút)
Siêu âm (50oC, 30 phút)
Chuyển toàn bộ vào bình định mức 25 mL
Ly tâm nguội (6000 rpm, 5 phút) Định mức
Lọc (45μm)
Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút. Nhiệt độ cột: 40⁰C.
Thể tích bơm mẫu: 20 µL.
3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích
3.4.1. Độ đặc hiệu
Chuẩn bị dung dịch chuẩn nồng độ 20 µg/mL, dung dịch thử và mẫu trắng nhƣ trên. Tiến hành: Sắc ký với điều kiện đã chọn với 3 mẫu chuẩn bị trên. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn adenosin và cordycepin
Nhận xét: Trên nền mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian phân tích từ 20 - 24 phút của hai chất cần phân tích, chứng tỏ phƣơng pháp có độ đặc hiệu tốt.
3.4.2. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính và lập đường chuẩn
Tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn có nồng độ adenosin và cordycepin từ 1- 40 µg/mL, sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị diện tích pic đo đƣợc ứng với các nồng độ của dung dịch trên và thiết lập phƣơng trình hồi quy và hệ số tƣơng quan r. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ sau:
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ adenosin, cordycepin và diện tích pic Nồng độ (µg/mL) Diện tích (mAU.s) Adenosin Cordycepin 1 302556 221489 2 608458 458354 4 1133748 861991 8 2268696 1732802 20 5588561 4542506 40 11308213 9206571
Phƣơng trình hồi quy y = 28163x + 14604 y = 23037x - 46866 Hệ số tƣơng quan (r) 0,9999 0,9999
Hình 3.10. Đường chuẩn của adenosin ( nồng độ 1–40 µg/mL)
Hình 3.11. Đường chuẩn của cordycepin ( nồng độ 1–40 µg/mL)
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát, ta thấy do hệ số tƣơng quan (r) adenosine là 0,9999, của cordycepin là 0,9999. Vì vậy có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ chất cần định lƣợng.
3.4.3. Độ lặp lại
Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần với cùng một nồng mẫu chế phẩm, tính hàm lƣợng dựa vào đƣờng chuẩn xây dựng cùng ngày phân tích, xác định độ lệch tƣơng đối RSD% của hàm lƣợng. 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Diện tích (m AU. s) Nồng độ (µg/mL) Đƣờng chuẩn adenosin 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Diện tích (m AUs) Nồng độ (µg/mL) Đƣờng chuẩn cordycepin
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp Lần Lƣợng cân (g) Adenosin Cordycepin Diện tích pic (mAU.s) HL (mg/100g) Diện tích pic (mAU.s) HL (mg/100g) 1 0,3125 815410 23,34 1959372 61,70 2 0,3292 820817 22,31 2080731 62,20 3 0,3191 763926 21,41 2006507 61,89 4 0,3285 820061 22,33 1940530 59,13 5 0,2925 749271 22,91 1904420 64,07 6 0,2892 760164 23,51 1835284 62,45 TB 22,64 61,74 RSD (%) 3,14 3,17
Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ 100 ppm – 10 ppm độ lệch chuẩn tƣơng đối của phƣơng pháp (RSD) phải đạt < 5,3 %. Kết quả phân tích cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối của adenosine là 3,14 %, của cordycepin là 3,17 %. Nhƣ vậy, phƣơng pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC [11].
3.4.4. Độ đúng
Tiến hành trên nền mẫu thử, chúng tôi thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau (mức thấp, trung bình và mức cao), sau đó tiến hành phân tích lặp 3 lần.
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ thu hồi adenosin và cordycepin của phương pháp
Thêm chuẩn Lần Độ thu hồi (R %)
Adenosin Cordycepin Mức 1 Adenosin: 5,13 µg/mL Cordycepin: 5,3 µg/mL 1 100,7 97,6 2 99,2 99,8 3 102,1 99,2 TB 100,7 98,9 RSD (%) 1,09 1,17 Mức 2 Adenosin: 10,25 µg/mL Cordycepin: 10,6 µg/mL 1 104,4 104,0 2 102,2 101,4 3 101,0 100,1 TB 102,6 101,8 RSD (%) 1,68 1,98 Mức 3 Adenosin: 15,38 µg/mL Cordycepin: 15,9 µg/mL 1 103,5 101,1 2 100,2 104,5 3 102,9 103,1 TB 102,2 102,9 RSD (%) 1,75 1,70
Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ 100 ppm – 10 ppm độ thu hồi của phƣơng pháp phải đạt 95,0-105,0 %. Kết quả phân tích cho thấy độ thu hồi của adenosine trong khoảng 99,2-104,4 % , của cordycepin là 97,6-104, 5 %. Nhƣ vậy, phƣơng pháp có độ thu hồi đạt yêu cầu của AOAC [11].
3.5. Ứng dụng định lƣợng trên một số chế phẩm thực phẩm chức năng dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo.