Xây dựng phương pháp định lượng các đồng phân đối quang của atenolol trong chế phẩm bằng điện di mao quản

Trong những năm gần đây, kỹ thuật điện di mao quản Capillary Electrophoresis - CE là phương pháp hóa lý được các nhà phân tích lựa chọn trong lĩnh vực tách các đồng phân quang học với nh

ĐỖ THỊ HÒA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM BẰNG ĐIỆN DI MAO

QUẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI -2014

ĐỖ THỊ HÒA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI

QUANG CỦA ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM BẰNG ĐIỆN DI MAO

QUẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 Th.S Vũ Ngân Bình

2 DS Ngô Minh Thúy

Nơi thực hiện đề tài:

1 Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội

2 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2014

Hà Nội, DS Ngô Minh Thúy và PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh – Phòng Quản

lý khoa học – Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo,

giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo, các anh/ chị kỹ thuật viên tại Bộ

môn Hóa phân tích và độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như toàn thể

anh/ chị cán bộ, công nhân viên tại Labo Hóa – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh

thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo

và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt năm năm em học tập tại trường

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè, và những người luôn theo sát chăm lo, động viên, kích lệ em trong học tập và cuộc sống

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014 Sinh viên

Đỗ Thị Hòa

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ATENOLOL 3

1.1.1 Tính chất lý, hóa 3

1.1.2 Dược lý và cơ chế tác dụng 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI MAO QUẢN 6

1.2.1 Khái niệm 6

1.2.2 Nguyên lý của quá trình điện di mao quản 7

1.2.3 Điện di mao quản vùng 9

1.3 VÀI NÉT VỀ PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC 10

1.3.1 Đồng phân quang học 10

1.3.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang 10

1.3.3 Ứng dụng điện di mao quản trong phân tích đồng phân quang học 12

1.4 TÁCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG BẰNG CE SỬ DỤNG CYCLODEXTRIN LÀ TÁC NHÂN CHỌN LỌC ĐỐI QUANG 13

1.4.1 Tổng quan về Cyclodextrin 13

1.4.2 Tách đồng phân đối quang sử dụng Cyclodextrin là tác nhân chọn lọc đối quang 15

1.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL 16

1.5.1 Nghiên cứu trong nước 16

1.5.2 Nghiên cứu trên thế giới 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Dung môi và hóa chất 19

2.1.3 Trang thiết bị 19

2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol

bằng điện di mao quản 20

2.2.3 Ứng dụng phương pháp này định lượng chế phẩm có chứa Atenolol trên thị trường 21

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.3.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc 21 2.3.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 22

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 23

2.3.4 Ứng dụng định lượng Atenolol trong các chế phẩm trên thị trường 23

2.3.5 Phương pháp xử lí số liệu 23

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN ĐIỆN DI 25

3.1.1 Lựa chọn cột mao quản 25

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của điện thế áp vào hai đầu mao quản 26

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 28

3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 28

3.2.2 Khoảng nồng độ tuyến tính 29

3.2.3 Độ đặc hiệu 31

3.2.4 Độ lặp lại 33

3.2.5 Độ đúng 34

3.3 ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM 36

BÀN LUẬN 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

BGE (Background Electrolyte) Dung dịch điện ly nền

CE (Capillary Electrophoresis) Điện di mao quản

CGE (Capillary Gel Electrophoresis) Điện di mao quản gel

CIEF (capillary isoelectric focusing) Điện di mao quản hội tụ

đẳng điện CITP (capillary isotachophoresis) Điện di mao quản đẳng tốc

cyclodextrin CZE (Capillary Zone Electrophoresis) Điện di mao quản vùng

EOF ( Electro-osmotic flow ) Dòng điện thẩm

HPCE (High Performance Capillary Electrophoresis)

HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao MEKC (Micellar Electrokinetic Chromatography) Sắc ký điện động mixen

RSD ( Relative Standard Deviation ) Độ lệch chuẩn tương đối

Bảng 1: Tính chất của một số CD tự nhiên 14

Bảng 2: Độ phù hợp hệ thống 28

Bảng 3: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn Atenolol racemic 29

Bảng 4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 30

Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu thử M1 34

Bảng 6: Kết quả xác định phần trăm tìm lại trên mẫu M1(thêm 10%) 35

Bảng 7: Kết quả xác định phần trăm tìm lại trên mẫu M1(thêm 20%) 36

Bảng 8: Kết quả định lượng mẫu M2 37

Hình 3: Sự hình thành dòng EOF 8

Hình 4: Giá trị thực của hiệu điện thế 25

Hình 5: Giá trị thực của cường độ dòng điện: 26

Hình 6: Điện di đồ ở 3 hiệu điện thế 27

Hình 7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của S-(-)-Atenolol theo nồng độ S-(-)-Atenolol 30

Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của R-(+)-Atenolol theo nồng độ R-(+)-Atenolol 31

Hình 9: Điện di đồ mẫu placebo 32

Hình 10: Điện đi đồ mẫu Atenolol racemic chuẩn 100 ppm 32

Hình 11: Điện di đồ mẫu thử 100 ppm 32

Hình 12: Điện di đồ mẫu M2 37

Hình 13: Vị trí tương tác liên kết hydro[22] 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trong điều trị trên lâm sàng đã sử dụng ngày càng nhiều các thuốc

có chứa hoạt chất là các dạng đồng phân quang học tinh khiết, giúp nâng cao hiệu quả điều trị, giảm liều dùng và hạn chế được nhiều tác dụng không mong muốn so với khi dùng thuốc có chứa hoạt chất ở dạng hỗn hợp racemic Ví dụ như levofloxacin (đồng phân tả tuyền của ofloxacin) có tác dụng kháng khuẩn mạnh gấp hàng chục đến hàng trăm lần dextrofloxacin (đồng phân hữu tuyền của ofloxacin) [4], hoặc dexchlorpheniramin maleat (đồng phân hữu tuyền của chlorpheniramin maleat) là một thuốc kháng Histamin H1 dùng điều trị dị ứng có tác dụng mạnh gấp hai lần chlorpheniramin maleat (dạng racemic) với cùng liều lượng do dạng đồng phân tả tuyền không có tác dụng, do đó cho phép giảm liều dùng chỉ còn một nửa [3]

Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, xu hướng các bệnh về tim mạch ngày càng tăng nhanh Đối với nhóm thuốc tim mạch thì thời gian điều trị thường kéo dài, do đó việc sử dụng dạng đồng phân quang học tinh khiết lại càng có ý nghĩa quan trọng Atenolol là dẫn chất của benzenacetamid, có tác dụng chẹn chọn lọc trên thụ thể β1- adrenergic, dùng điều trị tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn định, nhồi máu cơ tim sớm (trong vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên thất [2] Với một carbon bất đối trong phân tử, Atenolol là hỗn hợp racemic của hai đồng phân đối quang: S-(-)-Atenolol và R-(+)-Atenolol Một số nghiên cứu đã chứng minh và chỉ ra rằng S-(-)-Atenolol đóng vai trò chính trong chẹn β giao cảm khi dùng Atenolol dạng hỗn hợp racemic, đồng thời độc tính cũng thấp hơn so với dạng R-(+)-Atenolol [20],[21] Do đó việc sản xuất và sử dụng đồng phân S-(-)-Atenolol ngày càng được quan tâm nhiều hơn Điều này đòi hỏi phải xây dựng phương pháp phân tách và định lượng được từng dạng đơn đồng phân trong hỗn hợp racemic của Atenolol

Trong những năm gần đây, kỹ thuật điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là phương pháp hóa lý được các nhà phân tích lựa chọn trong lĩnh vực tách các đồng phân quang học với nhiều lý do: hiệu lực tách cao, lượng

mẫu và hóa chất sử dụng nhỏ, thiết bị hoàn toàn tự động, cơ chế tách đơn giản và dễ dàng trong phát triển phương pháp [16], [19], [22]

Tại Việt Nam, việc áp dụng kỹ thuật điện di mao quản trong phân tích kiểm nghiệm vẫn còn hạn chế Để nâng cao năng lực kiểm tra chất lượng thuốc của hệ thống kiểm nghiệm cũng như hội nhập với xu hướng phát triển của ngành Dược trên

thế giới, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng các đồng

phân đối quang của Atenolol trong chế phẩm bằng điện di mao quản” với hai

mục tiêu:

1 Thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng

điện di mao quản

2 Ứng dụng phương pháp này định lượng chế phẩm có chứa Atenolol trên thị

trường

1.1.2 Dược lý và cơ chế tác dụng

1.1.2.1 Tác dụng và cơ chế tác dụng

Atenolol có tác dụng chống tăng huyết áp, là dẫn chất của benzenacetamid, thuộc nhóm chẹn chọn lọc trên thụ thể β1 Thuốc có tác dụng làm giảm lực co cơ và giảm tần số tim Atenolol không có tác dụng ổn định màng Atenolol tan trong nước,

do đó ít thấm vào hệ thần kinh trung ương

Ðiều trị bằng Atenolol sẽ ức chế tác dụng của catecholamin khi gắng sức và căng thẳng tâm lý, dẫn đến làm giảm tần số tim, giảm cung lượng tim và giảm huyết

áp Ðiều trị bằng Atenolol không làm tăng hoặc làm tăng rất ít sức cản của mạch ngoại biên Trong điều kiện có stress với tăng giải phóng adrenalin từ tuyến thượng thận, Atenolol không làm mất sự co mạch sinh lý bình thường Ở liều điều trị, tác dụng co cơ trơn phế quản của Atenolol kém hơn so với những thuốc chẹn thụ thể beta không chọn lọc Tính chất này cho phép điều trị cả những người có bệnh hen phế quản nhẹ hoặc bệnh phổi tắc nghẽn khác Điều trị như vậy phải được kết hợp với thuốc chủ vận thụ thể β2 dùng theo đường hít, dưới sự giám sát chặt chẽ của thầy thuốc chuyên khoa về hen

Atenolol ít ảnh hưởng đến giải phóng insulin và chuyển hóa carbohydrat Phản ứng tim mạch đối với hạ đường huyết (như tim đập nhanh) không bị ảnh hưởng một cách có ý nghĩa bởi Atenolol Bởi vậy, Atenolol có thể dùng được cho người đái tháo đường Ở người tăng huyết áp, Atenolol làm giảm một cách có ý nghĩa huyết áp cả ở tư thế đứng lẫn tư thế nằm Ðể điều trị tăng huyết áp, nếu cần,

có thể kết hợp Atenolol với thuốc chống tăng huyết áp khác, chủ yếu là thuốc lợi niệu và/hoặc thuốc giãn mạch ngoại biên [2]

Một nghiên cứu cho thấy liều 50 mg đơn đồng phân S-(-)-Atenolol làm giảm huyết áp tâm thu, huyết áp tâm trương, nhịp tim cùng mức độ với sử dụng liều 100

mg Atenolol racemic Trong khi đó liều 50 mg đơn đồng phân R-(+)-Atenolol không làm thay đổi bất kì thông số nào Như vậy đồng phân S-(-)-Atenolol là đồng phân có hoạt tính chẹn β giao cảm và đồng phân R-(+)-Atenolol là đồng phân không có hoạt tính [20]

Đồng phân R-(+)-Atenolol có thể làm tăng hoặc thậm chí gây ra những tác dụng phụ nghiêm trọng Đó là lý do nên thay thế Atenolol racemic bằng đơn đồng phân S-(-)-Atenolol với liều chỉ bằng một nửa liều Atenolol racemic đang được sử dụng để giảm tác dụng phụ [21].

1.1.2.2 Dược động học

Nồng độ tối đa trong huyết tương của thuốc đạt được trong vòng từ 2-4 giờ sau khi uống Sinh khả dụng của Atenolol xấp xỉ 45%, nhưng có sự khác nhau tới 3-

4 lần giữa các người bệnh Thể tích phân bố là 0,7 lít/kg

Atenolol chỉ được chuyển hóa một lượng nhỏ, dưới 10% của liều dùng được bài tiết là chất chuyển hóa Phần lớn liều thuốc dùng được bài tiết qua thận dưới dạng không thay đổi Thời gian bán thải của thuốc từ 6 - 9 giờ đối với người lớn có chức năng thận bình thường Thời gian bán thải của thuốc tăng lên đối với người có chức năng thận giảm và không bị ảnh hưởng bởi bệnh gan Nồng đố thuốc trong máu thường tăng theo tuổi Nếu Atenolol được dùng cùng với thức ăn thì sinh khả dụng của thuốc giảm ít nhất là 20% Tuy nhiên điều này không có ý nghĩa lâm sàng [2]

1.1.2.3 Chỉ định

Tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn định, nhồi máu cơ tim sớm (trong

vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên thất [2] 1.1.2.4 Chống chỉ định

 Sốc tim, suy tim không bù trừ, blốc nhĩ - thất độ II và độ III, chậm nhịp tim

có biểu hiện lâm sàng

 Không được dùng kết hợp với verapamil [2]

Stada 50 mg (Công ty TNHH Liên doanh Stada Việt Nam), Tenocar 50 mg, Teginol

50 mg (Công ty cổ phần Dược Hậu Giang)

1.2 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI MAO QUẢN

1.2.1 Khái niệm

Sự phát triển của điện di bắt đầu trong khoảng từ năm 1930 đến năm1937 khi Tiselius cố gắng tách protein huyết thanh gồm α, β – albumin và γ – globulin Đó là lần đầu tiên điện di được sử dụng cho việc tách các hợp chất có hoạt tính sinh học Tuy nhiên, sự phân tách không hoàn chỉnh do lượng mẫu lớn và sử dụng hiệu điện thế thấp Năm 1967, Hjerten thực hiện điện di protein, acid nucleic và các ion vô cơ bằng mao quản có đường kính trong 300 µm, phát hiện bằng UV Vào đầu những năm 1980, Jorgenson và Lukacs công bố phát minh về một hệ thống CE đơn giản và

đã thu hút sự chú ý của rất nhiều các nhà nghiên cứu Năm 1989, Karger tổ chức Hội nghị quốc tế đầu tiên về điện di mao quản hiệu năng cao và trong cùng năm đó,

hệ thống CE thương mại đầu tiên đã có sẵn Kể từ đó, số công bố về CE đã tăng lên

nhanh chóng do tính linh hoạt, đơn giản và hiệu quả cao của nó [17]

Điện di là hiện tượng di chuyển của tiểu phân tích điện hòa tan hay phân tán trong chất điện giải khi có dòng điện đi qua Cation di chuyển về phía cực âm (catod), anion di chuyển về phía cực dương (anod) Các phần tử không tích điện không bị hút về phía hai điện cực Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất trong mao quản silica dài 25 - 100 cm, đường kính trong 25 - 100 μm, đường kính ngoài 300 - 400 μm Điện thế một chiều áp vào hai đầu mao quản 10 - 30 kV (cường độ điện trường có thể đến 500 V/cm) tạo ra quá trình chia tách, các chất phân tích được phát hiện khi di chuyển về một đầu mao quản nhờ một detector thích hợp [1], [6]

Hình 2: Sơ đồ hệ thống điện di mao quản

1.2.2 Nguyên lý của quá trình điện di mao quản

Quá trình vận hành của CE điển hình với mao quản silica chứa dung dịch đệm làm việc, thì nhóm silanol (SiOH) ở trên thành trong của mao quản sẽ giải phóng ion hydrogen (H+) vào dung dịch đệm và bề mặt thành mao quản sẽ tích điện

âm ngay cả ở pH rất thấp Cation hay các chất hòa tan tích điện dương một phần trong môi trường bị hút tĩnh điện vào thành mao quản tích điện âm tạo nên một lớp điện kép để cân bằng điện tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao quản gọi là thế Zeta (ξ)

Khi đặt thế trên chiều dài cột mao quản, các cation trong lớp điện kép khuếch tán sẽ di chuyển về phía catod Nhưng các cation này bị solvat hóa nên kéo cả khối dung dịch trong mao quản đi về catod Sự chuyển động của khối dung dịch trong mao quản silica dưới tác dụng của lực điện trường được gọi là dòng điện thẩm (electroosmotic flow - EOF)

Hình 3: Sự hình thành dòng EOF

Mức độ ion hóa của nhóm silanol trên thành mao quản phụ thuộc chủ yếu vào pH của dung dịch đệm làm việc, do đó trị số EOF thay đổi theo pH Ở pH thấp, nhóm silanol nói chung có độ ion hóa thấp và dòng EOF nhỏ Ở pH cao hơn, nhóm silanol bị ion hóa nhiều hơn và dòng EOF tăng

Ngoài pH dung dịch đệm, dòng EOF sẽ thay đổi khi:

 Lực ion của dung dịch tăng lên, làm giảm thế Zeta nên dòng EOF giảm

 Trong một số trường hợp, các dung môi hữu cơ như methanol hay acetonitril được cho thêm vào dung dịch đệm để làm tăng độ tan của các chất hòa tan, hằng số điện môi của dung dịch điện di giảm xuống kéo theo sự giảm của EOF

Detector được đặt về phía đầu catod của mao quản Dòng EOF thường lớn hơn linh độ điện di Do vậy, ngay cả anion cũng bị đẩy về phía catod và detector Khi sử dụng đệm phosphat pH 7,0 ở mao quản không có lớp bao, thông thường trình tự xuất hiện các chất tan trong điện di đồ là các cation, các chất trung tính và các anion

Hiện nay, có 5 loại điện di mao quản chủ yếu:

 Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis - CZE) còn gọi là điện di dung dịch tự do hay điện di mao quản dòng tự do

 Sắc ký mixen điện động, còn gọi là sắc ký điện động mixen (micellar electrokinetic chromatography - MEKC)

 Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE)

 Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (capillary isoelectric focusing - CIEF)

 Điện di mao quản đẳng tốc (capillary isotachophoresis - CITP) [1], [6]

1.2.3 Điện di mao quản vùng

Trong điện di mao quản vùng, quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác nhau về linh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử hoặc dung dịch thử Linh độ là hàm số của điện tích chất phân tích và kích thước trong điều kiện nhất định của phương pháp Chúng được tối ưu hóa bằng cách kiểm soát các thành phần của đệm, pH và lực ion

Điện di mao quản vùng sử dụng nguyên lý của điện di và điện thẩm để tách các tiểu phân tích điện

Linh độ điện di của ion (EP), được biễu diễn bằng phương trình:

Trong đó EO là linh độ dòng EOF

Thời gian di chuyển (tm), tính bằng giây, là thời gian cần thiết cho chất tan di chuyển trên toàn bộ chiều dài hiệu dụng (l) của mao quản (từ đầu vào đến detector),

tm được biểu thị bằng hệ thức sau:

Trong đó E là cường độ điện trường (E = V/L)

Hiệu lực của hệ thống điện di có thể liên quan đến linh độ, dòng EOF và được biểu thị bằng số đĩa lý thuyết (N), được tính bằng phương trình:

Dạng đồng phân quang học đơn giản nhất xuất hiện trong trường hợp khi hợp chất có thể tồn tại dưới hai dạng đồng phân lập thể có cấu tạo không chồng khít lên nhau được Hầu hết các tính chất lý học thông thường của hai đồng phân đối quang là giống nhau, trừ khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo những góc bằng nhau nhưng ngược chiều Xác định cấu hình tuyệt đối của đồng phân đối quang theo quy định của hệ thống của Cahn-Ingold-Prelog Nếu đồng phân quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang bên phải thì nó được gọi là đồng phân quay phải

R (tiếng La tinh: rectus (phải)) Nếu đồng phân quang học đó quay mặt phẳng ánh sáng sang bên trái thì nó được gọi là đồng phân quay trái S (tiếng Latinh: siniter (trái))

Hỗn hợp racemic có chứa số phân tử bằng nhau của mỗi dạng đối quang, do

đó độ quay cực tổng cộng bằng không [5], [9], [15]

1.3.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang

1.3.2.1 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang gián tiếp

Phương pháp này dựa trên một phản ứng hóa học giữa hai đồng phân đối quang với một hợp chất bất đối tạo thành hỗn hợp hai đồng phân lập thể nhưng không đối quang trước khi được phân tách bằng điện di Được thể hiện như sơ đồ:

(R,S)-C + (S)-D [(R)-C-(S)-D] + [(S)-C-(S)-D]

Trong đó:

C: Hỗn hợp racemic cần phân tích

D: Thuốc thử bất đối

R-, S- tương ứng là đồng phân quay phải và đồng phân quay trái

Hỗn hợp thu được có thể được tách bằng GC và HPLC Về nguyên tắc,có thể dùng CE để phân tích hỗn hợp trên, sử dụng dung dịch điện ly nền không chọn lọc đối quang, bởi các thành phần trong hỗn hợp có tính chất lý hóa khác nhau.Tuy nhiên phương pháp này rất khó áp dụng trong CE So với phương pháp phân tách trực tiếp thì phương pháp gián tiếp này có một số nhược điểm sau đây:

 Tốn thời gian xử lí mẫu

 Cần có các nhóm hoạt động hóa học trong cấu trúc như nitơ, hydroxyl, carboxylic

 Phải sử dụng thuốc thử bất đối rất tinh khiết vì sự có thêm một chất đối quang sẽ tạo ra thêm hai đồng phân lập thể không đối quang nữa và gây khó khăn cho quá trình phân tích

 Hai đồng phân trong hỗn hợp racemic cần phân tích phải phản ứng với cùng mức độ và tốc độ

 Đáp ứng của detector với hai dẫn xuất tạo thành phải tương đương nhau

 Điều kiện phản ứng phải thích hợp để tránh sự chuyển dạng lập thể của thuốc thử bất đối, đồng phân quang học của chất phân tích và dẫn xuất đồng phân lập thể không đối quang

Thông thường, không phải dễ dàng để giải quyết tất cả các vấn đề trong quá trình thực nghiệm như mô tả ở trên Tuy nhiên, phương pháp gián tiếp có thể được

áp dụng trong những trường hợp mà phương pháp trực tiếp không thể áp dụng được hoặc khi cần tăng độ nhạy Phương pháp gián tiếp trong CE chủ yếu được áp dụng

cho phân tách đồng phân quang học của acid amin Tuy nhiên cũng đã có những nghiên cứu áp dụng phương pháp này với dược chất [12]

1.3.2.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang trực tiếp

Phương pháp tách trực tiếp được áp dụng thành công trong CE cho việc tách đồng phân đối quang của một số nhóm hợp chất, chủ yếu là dược phẩm Tác nhân chọn lọc đối quang hoặc có thể được thêm vào dung dịch điện ly nền hoặc được gắn lên thành mao quản, hoặc được cố định hay gắn lên các hệ gel để tạo một môi trường chọn lọc đối quang mà tương tác với hai đồng phân đối quang trong suốt quá trình điện di dựa trên sự hình thành phức đồng phân lập thể không đối quang tạm thời Các phức tạm thời di chuyển về phía detector với vận tốc khác nhau chỉ khi chúng có hằng số bền khác nhau Các tương tác tương đối yếu tham gia vào quá trình hình thành đồng phân lập thể không đối quang gồm liên kết hydro, tương tác

kỵ nước, liên kết π-π, lưỡng cực - lưỡng cực Độ tinh khiết quang học của tác nhân chọn lọc đối quang trong phương pháp tách trực tiếp không phải là một yếu tố quan trọng như trong phương pháp tách gián tiếp; trên thực tế, các tạp chất chỉ ảnh hưởng đến độ phân giải và đã được chỉ ra rằng kết quả tương đối tốt có thể thu được bằng cách sử dụng tác nhân chọn lọc đối quang có chứa tới 10% đồng phân đối quang còn lại Cơ chế phân tách đồng phân đối quang bao gồm tạo phức lồng, tạo mixen

và tương tác ái lực Cơ chế tạo phức lồng đã được áp dụng rộng rãi nhằm nâng cao

độ chọn lọc trong phân tách một số hợp chất bao gồm: đồng phân hình học, đồng phân lập thể và đồng phân đối quang Đến nay ba nhóm chính để tạo phức lồng được sử dụng trong CE gồm các cyclodextrins (CDs), ether vòng được tetracarboxylat hóa và kháng sinh [9], [12]

1.3.3 Ứng dụng điện di mao quản trong phân tích đồng phân quang học

Hầu hết các thuốc là hợp chất đối quang và mỗi đồng phân thể hiện tác dụng dược lý và độc tính riêng biệt Do đó, phân tách đồng phân đối quang là cần thiết trong phân tích dược phẩm để có được những đồng phân an toàn và có tác dụng mong muốn Cho đến nay phương pháp phân tích được sử dụng cho việc tách đồng phân đối quang bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lớp mỏng

(TLC), sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng siêu tới hạn (SFC), và điện di mao quản(CE) Ứng dụng của sắc ký khí chủ yếu giới hạn trong các hợp chất dễ bay hơi Phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích các thuốc đối quang là HPLC CE là một kỹ thuật bổ sung cho HPLC, đặc biệt đối với việc phân tích hợp chất phân cực

và tích điện [9] Ưu điểm của CE gồm: hiệu lực tách cao, lượng mẫu và hóa chất sử dụng nhỏ, thiết bị hoàn toàn tự động, cơ chế tách đơn giản và dễ dàng trong phát triển phương pháp [9], [19] Việc tách đồng phân đối quang bằng CE có thể được thực hiện bằng phương pháp gián tiếp hoặc trực tiếp Các phương pháp trực tiếp thuận lợi hơn các phương pháp gián tiếp do sự đơn giản và tính sẵn có của một loạt các tác nhân chọn lọc đối quang như cyclodextrins (CDs), ether vòng được tetracarboxylat hóa và kháng sinh tạo phức lồng với các đồng phân đối quang Trong số đó, CD là tác nhân chọn lọc đối quang được sử dụng phổ biến nhất Ngoài các CD tự nhiên, các dẫn xuất CD khác nhau đã được thương mại hóa và chúng mang lại độ chọn lọc cao trong tách đồng phân đối quang Bên cạnh cơ chế tạo phức lồng, các cơ chế khác dùng để tách đồng phân đối quang gồm trao đổi phối tử, tương tác ái lực (ví dụ: việc sử dụng protein, kháng sinh là tác nhân chọn lọc đối quang), và tương tác mixen (ví dụ: sử dụng các bề mặt tự nhiên hay tổng hợp là tác nhân chọn lọc đối quang)[17]

CE hiện đang là mộtphương pháp được thiết lập để phân tích dược phẩm và được khuyến khích ở một số Dược điển Ví dụ, Dược điển Anh (BP) đề xuất việc xác định erythropoietin và levocabastin hydrochlorid bởi MEKC, trong khi Dược điển Mỹ (USP) đã có một chương chung về CE từ năm 2002 [19]

1.4 TÁCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG BẰNG CE SỬ DỤNG CYCLODEXTRIN LÀ TÁC NHÂN CHỌN LỌC ĐỐI QUANG

1.4.1 Tổng quan về Cyclodextrin

Cyclodextrin (CD) là oligosaccharid mạch vòng, gồm các đơn vị glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-(1,4)-glucosid và được tạo ra từ phản ứng thủy phân tinh bột bằng enzym Mặc dù trong thực tế, CD hình thành từ 6 lên đến 12 đơn vị

glucose đã được phân lập, tuy nhiên chỉ CD có 6,7,8 đơn vị glucose (tương ứng với

α, β, γ-CD) là hiện đang được sử dụng trong hóa phân tích

Hình dạng của CD tương tự như một hình nón cụt rỗng với một khoang tương đối kỵ nước, có thể lưu giữ chất phân tích và mặt ngoài thân nước do sự có mặt của các nhóm hydroxyl (vị trí 2, 3 và 6 của glucopyranose) Vành rộng hơn có chứa các nhóm hydroxyl thứ cấp đối quang, trong khi vành hẹp hơn chứa nhóm hydroxyl sơ cấp không đối quang Tính chất vật lý của các CD tự nhiên khá khác nhau, ví dụ như về chiều rộng của khoang, độ tan, trọng lượng phân tử…, tuy nhiên chúng có cùng độ sâu (Bảng 1)

ví dụ như tăng độ tan, tăng khả năng tạo ra các liên kết thứ cấp khác nhau, tiềm

năng trong phân tích những hợp chất không tích điện, mức độ kị nước khác nhau của hốc kị nước Ví dụ, so sánh β - CD và DM- β- CD, có thể thấy rằng sự có mặt của các nhóm methoxy làm tăng hoặc độ sâu hoặc độ tan của tác nhân chọn lọc đối quang Nhóm thế tích điện hoặc không tích điện thay thế cho nhóm hydroxyl trên cấu trúc CD có thể rất có ích cho tối ưu phương pháp CE Trong thực tế, đồng phân không tích điện có thể được chuyển đến detector như chất phân tích tích điện do sự hình thành phức lồng với dẫn xuất của CD có nhóm thế tích điện Hơn nữa sự chuyển động của tác nhân chọn lọc đối quang theo hướng ngược lại với chất phân tích là điều kiện lý tưởng để đạt được độ phân giải tốt vì làm tăng sự khác biệt về linh độ giữa chất phân tích tự do và chất phân tích trong phức lồng [9], [10], [13]

1.4.2 Tách đồng phân đối quang sử dụng Cyclodextrin là tác nhân chọn lọc đối quang

Nhiều dẫn xuất CD đã được phát triển để tăng khả năng hòa tan trong nước

và để thay đổi hình dạng khoang Tách đồng phân đối quang bằng CZE với CD là tác nhân chọn lọc đối quang lần đầu tiên được giới thiệu bởi Fanali và là kỹ thuật thành công nhất trong số các kỹ thuật để tách đồng phân đối quang của CE; số lượng các bài báo mô tả kỹ thuật này gia tăng đáng kể [19]

Trong cơ chế tạo phức lồng, hợp chất lồng khít vào khoang CD với toàn bộ phân tử hoặc với phần kỵ nước của phân tử; do đó, loại CD có vai trò rất quan trọng trong quá trình tách Tương tác kỵ nước với mình khoang kỵ nước không đủ để cho phép tách các đồng phân đối quang, liên kết yếu giữa các nhóm nhóm thế với trung tâm bất đối của chất phân tích và các nhóm hydroxyl thứ cấp và / hoặc sơ cấp của

CD đóng vai trò trong nhận dạng đối quang [9], [12], [19]

CD là một hợp chất trung hòa về điện và do đó chúng di chuyển với tốc độ của dòng EOF trong CZE Khi một chất tan tích điện được lồng vào khoang của

CD, phức lồng tạo thành có điện tích giống với chất tan tự do nhưng khối lượng phân tử tăng lên, và do đó linh độ điện di thấp hơn so với chất tan tự do Trong tách đồng phân đối quang, các đồng phân có linh độ điện di đồng nhất và các đồng phân trong phức lồng có thể có linh độ tương tự nhau Vì vậy, nguyên tắc của CZE sử

dụng CD là tác nhân chọn lọc đối quang (CD - CZE) để tách đồng phân đối quang

là sự khác biệt giữa các hằng số bền của phức lồng tạo ra giữa các đồng phân đối quang với CD Đồng phân tạo phức lồng bền hơn thì có linh độ hiệu dụng thấp hơn Linh độ hiệu dụng là linh độ trung bình hoặc biểu kiến của chất tan trong điều kiện thử nghiệm, nhưng trong hầu hết các trường hợp, chúng ta sử dụng đơn giản là linh

độ [19]

Phân tách đồng phân đối quang có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: loại

và nồng độ CD, pH, thành phần của BGE, nhiệt độ mao quản, hiệu điện thế…[13]

1.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL

1.5.1 Nghiên cứu trong nước

 Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Thị Kiều Anh [8], đã tách và định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, sử dụng:

 Cột: Chirex 3022 ((S)-indoline-2-carboxylic acid và naphtyl)ethylamin) (4,0 x 250 mm; 5 μm)

(R)-1-(α- Pha động: n-hexan : 1,2 dicloromethan : methanol : acid trifluoroacetic = 57,5 : 35 : 7,5 : 0,2 (tt/tt/tt/tt)

 Cột mao quản silica nung chảy: chiều dài tổng 58,5 cm (chiều dài hiệu dụng 50 cm), đường kính trong 75 μm

 Dung dịch điện ly nền: Tris 50 mM, CM-β-CD 8 mM, pH 4,0

 Nhiệt độ: 200C

 Hiệu điện thế: 16 kV

 Chế độ tiêm mẫu: 50 mbar x 3s

 Bước sóng phát hiện: 194 nm

 Nồng độ chất phân tích: 100 ppm (kl/tt) Atenolol racemic

Nghiên cứu này mới sơ bộ tách, định tính các đồng phân Chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu phát triển, hoàn thiện phương pháp để ứng dụng vào định lượng các đồng phân quang học của Atenolol

1.5.2 Nghiên cứu trên thế giới

Một số nghiên cứu định lượng đồng phân quang học của Atenolol bằng HPLC như sau:

 Nghiên cứu của Santoro M.I, Cho H.S (2000) [18], sử dụng điều kiện sắc ký như sau:

CE cũng được ứng dụng trong phân tích đồng phân đối quang của Atenolol

 Nghiên cứu của Wuhong Li, Changhai Liu, Guangguo Tan, Xinrong Zhang, Zhenyu Zhu, Yifeng Chai [22] sau khi khảo sat và lựa chọn, đưa ra điều kiện

điện di như sau:

 Cột mao quản silica nung chảy, chiều dài tổng cộng 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng 40 cm, đường kính trong 50 μm

 Tiêm mẫu: 50 mbar × 3s

 Hiệu điện thế: 24 kV

 Bước sóng phát hiện : 214 nm

 Nhiệt độ mao quản: 20oC

 Dung dịch điện ly nền (BGE): Tris 50mM và CM-β-CD 8 mM, được điều chỉnh bằng acid phosphoric tới pH 4,0

 Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan trong dung dịch đệm Tris 50 mM ở nồng

độ 10 mM Dung dịch phân tích được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc với đệm Tris tới nồng độ 0,2 mM Tất cả các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,22 μm

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chế phẩm viên nén có chứa Atenolol 50 mg (Atenolol dạng hỗn hợp racemic):

 Viên nén Atenolol STADA 50 mg, SĐK: VD-12619-10, số lô:040913, hạn dùng:10/09/2018, nhà sản xuất: công ty TNHH liên doanh STADA-

VN, chứa 50mg Atenolol.(Mẫu M1)

 Viên nén Tenormin 50 mg, SĐK: VN-1585-06, số lô: JA462, hạn dùng:

06/06/2016, nhà sản xuất: Astra Zeneca, Anh, chứa 50mg Atenolol.(Mẫu M2)

2.1.2 Dung môi và hóa chất