Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải tại một số bệnh viện hà nội bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC MS

Vì vậy, việc định lượng hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải tại một số bệnh viện trên địa bàn thành phố Hà Nội là rất cần thiết nhằm xác định được tình hình thực trạng dư l

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TR ẦN THỊ LAN

METRONIDAZOL TRONG NƯỚC THẢI TẠI

KHÓA LU ẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

TR ẦN THỊ LAN

METRONIDAZOL TRONG NƯỚC THẢI TẠI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Thanh Phương

ThS Nguyễn Trung Hiếu

Nơi thực hiện: Phòng Hóa Lý – TT kiểm

nghi ệm dược phẩm - mỹ phẩm Hà Nội

HÀ N ỘI – 2013

L ỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đối với

ThS Nguy ễn Thị Thanh Phương, ThS Nguyễn Trung Hiếu đã tận tình hướng

dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận này

Em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và độc chất – Trường

Đại Học Dược Hà Nội, ban giám đốc cùng toàn bộ cán bộ,nhân viên phòng Hóa lý-

Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp

đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để thực hiện đề tài

Em chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường, phòng đào tạo, cùng các thầy cô

bộ môn hoá phân tích và độc chất và các bộ môn khác của trường Đại Học Dược

Hà Nội đã tạo những điều kiện tốt nhất để emhoàn thành quá trình học tập tại

trường

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn gia đình,người thân,bạn bè đã luôn khích

lệ,chia sẻ,động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5/2013

Sinh viên

Trần Thị Lan

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.TỔNG QUAN VỀ METRONIDAZOL 3

1.1.1 Công thức cấu tạo 3

1.1.2 Tính chất lý hóa 3

1.1.3 Đặc điểm dược động học 3

1.1.4 Dược lý – dược lâm sàng 4

1.1.5 Chế phẩm chứa metronidazol trên thị trường 5

1.1.6 Một số phương pháp định lượng metronidazol 6

1.2.THỰC TRẠNG NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN 7

1.2.1 Thành phần, tính chất nước thải bệnh viện 7

1.2.2 Tình trạng nước thải bệnh viện hiện nay 9

1.3.TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT LC/MS 9

1.3.1 Khái niệm 9

1.3.2 Cấu tạo 9

1.3.3 Một số kỹ thuật LC/MS 15

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 17

2.1.1 Hóa chất và thiết bị 17

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH 20

CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 CHUẨN BỊ MẪU 22

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 24

3.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 24

3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 26

3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu và ảnh hưởng của nền mẫu 28

3.3 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 32

3.3.1.Tính thích hợp của hệ thống 32

3.3.2 Độ chọn lọc 32

3.3.3 Khảo sát độ tuyến tính 33

3.3.4 Độ đúng 34

3.3.5 Độ chính xác 35

3.3.6 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 36

3.3.7 Khảo sát độ ổn định 37

3.3.7.1 Độ ổn định trong dung môi 37

3.3.7.2 Độ ổn định trong dung dịch thử 39

3.4 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG MTD TRONG NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN 40

3.5 BÀN LUẬN 41

K ẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 TÀI LI ỆU THAM KHẢO

PH Ụ LỤC

ọc ở áp suất thường ) BOD : Biochemical Oxygen Demand

( Nhu cầu oxy sinh hóa )

COD : Chemical Oxygen Demand

( Nhu cầu oxy hóa học )

ESI : Electrospray ionization

( Ion hóa phun điện tử )

HPLC : High Performance Liquid Chromatography ( Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

IT.s : Intensity.seconds

( Cường độ tín hiệu giây )

LC/MS : Liquid chromatography – Mass spectrometry ( Sắc ký lỏng - khối phổ)

LOD : Limit of detection

( Giới hạn phát hiện)

LOQ : Limit of quantification

( Giới hạn định lượng)

MTD : Metronidazol

RSD%: Relative Standard Deviation

( Độ lệch chuẩn tương đối )

SRM : Selected Reaction Monitoring

( Chọn lọc ion con sau phản ứng )

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ các chất ô nhiễm trong nước thải

bệnh viện: QCVN 28:2010/BTNMT 8

Bảng 3.1: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc MTD trong nước ( C) 22

Bảng 3.2: Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn MTD trong nước thải 22

Bảng 3.3: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong nước ( QC-W) 23

Bảng 3.4: Chuẩn bị các mẫu QC trong nước thải 23

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 27

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát tốc độ dòng 27

Bảng 3.7: Kết quả đánh giá khả năng chiết của các phương pháp 31

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 32

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của MTD 34

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 35

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp 36

Bảng 3.12: Kết quả độ ổn định của MTD trong dung môi 38

Bảng 3.13: Kết quả độ ổn định của MTD trong nước thải 39

Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu nước thải bệnh viện 40

ộ phận của detector khối phổ 12

Hình 1.3: Bộ ion hóa phun điện tử ESI 13

Hình 1.4: Bộ phân tích tứ cực đơn 14

Hình 1.5: Nguyên lý hoạt động của khối phổ 2 lần MS/MS 15

Hình 2.1: Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS/MS 8030 17

Hình 2.2: Mô hình thực nghiệm 19

Hình 3.1: Phổ MS của dung dịch chuẩn MTD 5 µg/ml 24

Hình 3.2: Phổ MS2 của dung dịch chuẩn MTD 5 µg/ml, CE = 15 V 25

Hình 3.3: Phổ MS2 của dung dịch chuẩn MTD 5 µg/ml, CE = 25 V 25

Hình 3.4: Quy trình chiết MTD trong nước thải bệnh viện bằng chiết lỏng-lỏng 29

Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn MTD 0,05µg/mL trong nước (a) và khi tiêm mẫu nước thải trắng đã được xử lý chiết lỏng – lỏng (b) 30

Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu nước thải trắng đã qua xử lý chiết pha rắn 30

Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu nước thải trắng (a), mẫu chuẩn MTD (0,005 µg/mL)(b).33 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ MTD 34

Hình 3.9: Sắc ký đồ xác định LOD của dung dịch chuẩn MTD 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước thải bệnh viện là một trong những mối quan tâm, lo ngại vì chúng có thể gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và nguy hại đến đời sống con người Điều quan tâm hàng đầu đối với nước thải của các bệnh viện là vấn đề các vi trùng gây

bệnh và thuốc kháng sinh Các sinh vật được tiếp xúc lâu dài với các chất kháng sinh ở nồng độ thấp trong môi trường sẽ kích thích sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc và duy trì quần thể các chủng kháng thuốc Hiện tượng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người, đang

là mối quan tâm lo lắng của toàn xã hội Vi khuẩn kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị nhiễm trùng Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng kháng kháng sinh còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác Nhưng tình trạng xử lý nước thải bệnh viện hiện nay lại chưagiám sát được dư lượng thuốc kháng sinh, chưa được đưa vào tiêu chuẩn quản

lý

Metronidazol là một dẫn chất thuộc nhóm 5- nitro imidazol, có phổ hoạt tính rộng trên động vật nguyên sinh như amip, Giardia và trên vi khuẩn kị khí Nên metronidazol có một vị trí rất quan trọng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn kỵ khí Vì vậy, việc định lượng hàm lượng kháng sinh

metronidazol trong nước thải tại một số bệnh viện trên địa bàn thành phố Hà Nội là rất cần thiết nhằm xác định được tình hình thực trạng dư lượng kháng sinh trong nguồn nước thải và đề xuất những giải pháp quản lý, xử lý phù hợp nhằm đem lại hiệu quả cao và tránh được tình trạng kháng kháng sinh

Hệ thống phân tích LC/MS ra đời là bước nhảy vọt về kỹ thuật phân tích, tạo điều kiện cho các nhà khoa học thực hiện được các nghiên cứu phức tạp Với ưu điểm vượt trội về độ nhạy và tính đặc hiệu, kỹ thuật phân tích này ngày càng được áp dụng nhiều trong nghiên cứu các chất có hàm lượng thấp

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải

m ột số bệnh viện Hà Nội bằng kỹ thuật LC- MS”

Với các mục tiêu:

1 Kh ảo sát điều kiện định lượng kháng sinh metronidazol bằng kỹ thuật LC- MS

2 Th ẩm định phương pháp định lượng vừa xây dựng

3 Áp d ụng phương pháp để khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải tại một số bệnh viện Hà Nội

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 T ỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH METRONIDAZOL

• Công thức phân tử: C6H9N3O3

• Khối lượng phân tử: M = 171,2 g/mol

• Tên khoa học: 2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethan-1-ol

các mô và dịch cơ thể (như trong nước bọt, dịch não tủy, mủ của áp xe não, mủ viêm tai giữa, đờm, lợi, mủ màng phổi, sữa, mủ áp xe gan, nước ối, tổ chức phôi, tinh dịch, thủy dịch) với nồng độ tương tự như trong huyết tương Thuốc cũng qua được nhau thai và đi vào tuần hoàn thai nhi nhanh chóng Chuyển hóa ở gan thành các chất chuyển hóa dạng hydroxy và acid, các chất chuyển hóa còn hoạt tính, thải

trừ chủ yếu qua nước tiểu, thời gian bán thải khoảng 8 giờ

1.1.4 Dược lý – dược lâm sàng [3], [4], [6], [7]

1.1.4.1 Tác d ụng và cơ chế tác dụng

Metronidazol là một dẫn chất 5 - nitro - imidazol, có phổ hoạt tính rộng trên động

vật nguyên sinh như amip, Giardia và trên vi khuẩn kị khí

• Metronidazol là một thuốc rất mạnh trong điều trị nhiễm động vật nguyên sinh

như Entamoeba histolytica, Giardia lambliavà Trichomonas

trên Bacteroides, Fusobacterium và các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc khác, nhưng không có tác dụng trên vi khuẩn ái khí

• Có tác dụng diệt vi khuẩn Campylobacter/ Helicobacter pylori gây bệnh viêm dạ

dày mạn tính và loét dạ dày tá tràng

• Cơ chế: Trong ký sinh trùng, nhóm 5 - nitro của thuốc bị khử thành các chất trung gian độc với tế bào Các chất này liên kết với cấu trúc xoắn của phân tử DNA làm

vỡ các sợi này và cuối cùng làm tế bào chết Nồng độ trung bình có hiệu quả của metronidazol là 8 µg/mL hoặc thấp hơn đối với hầu hết các động vật nguyên sinh

và các vi khuẩn nhạy cảm Nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) các chủng nhạy cảm khoảng 0,5 µg/mL

• Kháng thu ốc: Metronidazol chỉ bị kháng trong một số ít trường hợp, thường gặp

ở một vài chủng Trichomonas vaginalis, hiếm khi gặp với Bacteroides và những

vi khuẩn kỵ khí khác Các chủng kháng Metronidazol đã được chứng minh chứa

ít ferrdoxin, chất này là một protein xúc tác khử hóa metronidazol Trong các

chủng đó, ferredoxin giảm nhưng không mất hoàn toàn, có lẽ giải thích tại sao nhiễm khuẩn với các chủng kháng đó lại đáp ứng với liều metronidazol cao và

kéo dài hơn

1.1.4.2 Ch ỉ định

- Ðiều trị các trường hợp nhiễm Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica (thể

cấp tính ở ruột và thể áp xe gan), Dientamoeba fragilis ở trẻ em, Giardia lamblia

và Dracunculus medinensis

- Ðiều trị nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn kỵ khí nhạy cảm như nhiễm khuẩn ổ

bụng, nhiễm khuẩn phụ khoa, nhiễm khuẩn da và các cấu trúc da, nhiễm khuẩn hệ

thần kinh trung ương, nhiễm khuẩn huyết và viêm màng trong tim Phối hợp với

uống Neomycin, hoặc Kanamycin để phòng ngừa khi phẫu thuật ở người phải phẫu thuật đại trực tràng và phẫu thuật phụ khoa

- Viêm lợi hoại tử loét cấp, viêm lợi quanh thân răng và các nhiễm khuẩn răng khác

do vi khuẩn kị khí Bệnh Crohn thể hoạt động ở kết tràng, trực tràng Viêm loét dạ

dày - tá tràng do Helicobacter pylori (phối hợp với 1 số thuốc khác)

1.1.4.3 Ch ống chỉ định

- Có tiền sử quá mẫn với metronidazol hoặc các dẫn chất nitro-imidazol khác

- Bệnh nhân động kinh

- Rối loạn đông máu

- Người mang thai 3 tháng đầu, thời kì cho con bú

1.1.4.4 Tác d ụng không mong muốn (ADR)

Thường gặp: buồn nôn, nhức đầu, chán ăn, khô miệng, nôn mửa, tiêu chảy, miệng

có vị kim loại Nặng: co giật, mất điều hòa, giảm bạch cầu, rối loạn đông máu

1.1.5 Ch ế phẩm chứa metronidazol trên thị trường [3], [4], [6]

- Viên nén metronidazol hàm lượng 250 mg và 500 mg

- Thuốc đạn, thuốc trứng 500 mg, 1000 mg

- Dịch truyền 100 mL chứa 500 mg metronidazol, thuốc tiêm 5 mg/mL

- Kem bôi da, âm đạo 10%

- Viên nang 373 mg, 500 mg

- Nhũ dịch metronidazol

- Dạng viên nén giải phóng kéo dài 750mg

• Chỉ thị màu: [1], [29], [30], [31], [32], [33]

Hòa tan một lượng chính xác Metronidazol bằng anhydrid acetic, đun nóng nhẹ để hòa tan chất tan, làm lạnh và thêm một giọt thuốc thử xanh malachite TS ( hoặc chỉ

thị là p- naphtholbenzein chuẩn) Định lượng bằng acid HClO4 0,1 N, kết thúc định

lượng khi dung dịch chuyển màu vàng xanh đối với malachit (chuyển từ vàng xanh sang xanh lá cây đối với chị thị naphtholbenzein) 1mL HClO4 ứng với 17,12 mg

C6H9N3O3

1.6.1.2 Định lượng bằng quang phổ UV-VIS:

• Trong môi trường acid: [4], [5]

Dựa vào khả năng hấp thụ UV của Metronidazol: đo độ hấp thụ của dung dịch Metronidazol trong HCl 0,1 N ở bước sóng hấp thụ cực đại 277 nm Mẫu trắng là dung dịch HCl 0,1 N A( 1%, 1 cm ) ở 277nm là 377 Tiến hành song song với chuẩn cùng điều kiện

• Trong môi trường kiềm: [10], [12]

Hòa tan một lượng chính xác Metronidazol bằng dung dịch NaOH 0,1 N trong bình định mức 100 mL Lọc bỏ 20 mL dung dịch đầu, hút 1mL dịch lọc tiếp theo vào bình định mức 100 mL, bổ sung NaOH 0,1 N tới vạch, lắc đều Dung dịch thu được đem đo mật độ quang ở bước sóng 319 nm với mẫu trắng là NaOH 0,1 N A (1%, 1 cm) ở 319 nm là 377 Song song tiến hành với chuẩn cùng điều kiện

1.6.1.3 Định lượng bằng đo nitrit: [4]

Bằng cách khử nhóm nitro thơm bằng hydro mới sinh thành nhóm amin thơm, định lượng metronidazol dựa vào nhóm chức amin thơm này

1.6.1.4 Định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ):[9]

Định lượng Metronidazol bằng HPLC với chương trình chạy như sau:

- Cột Supelco IC-AB2 C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm)

- Detector UV đặt ở 292 nm

- Pha động: acid phosphoric 0,01 M : CH3CN : CH3OH ( 1000 : 225 : 25 ) Metronidazol có tính base, nên dùng pha động pH = 2,4 ( <3) có lợi hơn dùng pH trung hòa Metronidazol rất dễ tan trong acid, bề rộng của pic sẽ hẹp và tính đối

xứng được đảm bảo (hệ số cân đối 0,9- 1,1)

1.2 Gi ới thiệu chung về thực trạng nước thải ở các bệnh viện tại Hà Nội [37],

[38]

1.2.1 Thành ph ần, tính chất nước thải bệnh viện

Thành phần chính gây ô nhiễm môi trường do nước thải bệnh viện gây ra là:

- Các chất hữu cơ: BOD, COD

Bảng1.1:Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ các chất ô nhiễm trong nước

1.2.2 Mức độ xử lý và tình trạng nước thải hiện nay tại các bệnh viện[37],

[38]

Trong bối cảnh quản lý, xử lý nước thải gần như bị thả lỏng, đáng chú ý hơn cả là,

từ trước đến nay, ngành y tế chưa kiểm soát kháng sinh trong nước thải bệnh viện

Từ năm 2009, Viện Y học Lao động & Vệ sinh Môi trường cùng với một số đơn vị như Viện Pasteur Nha Trang, Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên, Viện Vệ sinh Lao động TP.HCM thực hiện chương trình quan trắc của Bộ Y tế, trong đó có quan trắc nước thải bệnh viện Kết quả quan trắc cho thấy, nước thải bệnh viện có đặc điểm ô nhiễm chủ yếu như nước thải sinh hoạt chứa vi khuẩn,trong đó có vi sinh vật gây bệnh đường ruột vốn dễ dàng lây truyền qua nước Một số chất độc tế bào hay dư lượng thuốc kháng sinh cũng có khả năng có trong nước thải bệnh viện Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa xác định được hai thành phần độc hại nói trên Nguyên do là các

cơ quan này không có phòng thí nghiệm đủ điều kiện phân tích

Thống kê của Bộ Y tế mới đây cho thấy 67,7% số bệnh viện tuyến trung ương, 56,1% bệnh viện tuyến tỉnh và 44,4% bệnh viện tuyến huyện thực hiện thu gom và

xử lý nước thải theo quy định Như vậy vẫn còn rất nhiều cơ sở y tế xả chất thải

lỏng ra môi trường

1.3 T ỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT LC/MS [1], [2], [8],[11], [13], [14], [20], [21], [22], [24], [34]

1.3.1 Khái ni ệm

Sắc kí lỏng khối phổ là kĩ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các

chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc kí lỏng hiệu năng cao ( High performance liquid chromatography-HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận

khối phổ( Mass spectrometry- MS)

1.3.2 C ấu tạo

Thành phần cơ bản của hệ thống LC/MS (Hình 1.1) gồm 7 phần chính:

- Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi)

- Hệ thống bơm (Pump system)

- Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)

-Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ cột)

-Cột sắc ký (pha tĩnh – stationary phase)

• Độ tinh khiết cao (ví dụ: nước/đệm với MeOH/ACN)

• Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh

• Không có bọt khí, không có bụi (đánh siêu âm, lọc)

- Có hai cách dùng pha động để rửa giải:

• Đẳng dòng (rửa giải thường): Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình sắc ký

• Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường sử dụng từ 2 đến 4

loại dung môi khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký

H ệ

th ống bơm

Detector

MS

• Áp suất có thể đạt đến 1000 bar (15.000 Psi)

• Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0,01 – 10 mL/min

• Thể tích chết nhỏ

• Trơ với dung môi của pha động

• Có thể trộn 2 hay nhiều dung môi với nhau

 Hệ tiêm mẫu

Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau, thường dùng loại 0,5-20µL

chất nhồi trong cột là Silicagel hoặc Silicagel đã được silan hóa, hoặc được bao một

lớp mỏng hữu cơ, ngoài ra người ta còn dùng các hạt khác như nhôm oxyd, polyme

xốp, chất trao đổi ion

 Detector kh ối phổ

Là bộ phận phát hiện và đo các tín hiệu sinh ra khi có chất ra khỏi cột, các tín hiệu này được ghi trên sắc đồ

Việc sử dụng MS làm detector có những ưu điểm sau:

•Độ nhạy cao (phân tích được các chất ở mức độ vết)

•Đưa ra những thông tin về khối lượng và cấu tạo hóa học của chất phân tích

•Làm tăng tính chọn lọc và giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích

*Nguyên t ắc hoạt động:

Đây là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ nguyên tử hay phân tử của mẫu.Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector Tất cả quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không, áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện

bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hay phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các

chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất

*Nhi ệm vụ của detector khối phổ:

Chuyển các ion đã đến detector thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy

khối phổ

*Các b ộ phận của detector khối phổ:

Hình 1.2:Các b ộ phận của detector khối phổ

 Bộ nạp mẫu:

Là đầu ra của máy sắc ký lỏng, kết nối với khối phổ

 Bộ nguồn ion hóa:

Là bộ phận ion hóa mẫu có nhiệm vụ: ion hóa chất cần phân tích, khử dung môi

để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển

với bộ phận nằm trong chân không sâu và rút ra ngoài các phân tử trung hòa, ion khác dấu có thể ảnh hưởng đến phép đo

Có rất nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhưng hiện nay thường sử dụng hai kỹ thuật là kỹ thuật ion hóa phun điện tử ( ESI) và ion hóa bằng hóa học ở áp suất thường

(APCI) Trong khóa luận này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI

- Kỹ thuật phun ion ESI ( Electrospray ionization) :

Xử lý dữliệuBơm chân không

Hệ chân không áp suất 10-3 – 10-6 Pa

Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao

quản bằng kim loại cao thế 1- 6 kV ( điện thế dương ở đầu ion kim loại tạo ion dương, điện thế âm ở đầu kim loại tạo ion âm), sau đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra xung quang ống mao quản Trong khí nóng, các phân tử dung môi từ từ

bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ bẻ dần ra thành những hạt nhỏ mang điện tích Các ion dương

hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi

và khí nitơ bị bơm hút ra ngoài

Hình 1.3: B ộ ion hóa phun điện tử ESI

APCI được sử dụng nhiều cho những phân tử phân cực có khối lượng nhỏ hơn

1000 ESI được sử dụng nhiều hơn cho những phân tử phân cực nhiều hơn và có

khối lượng phân tử khối lớn ( ion đa điện tích với protein) Trong trường hợp cả hai

kỹ thuật đều dùng được trong phân tích một hóa chất xác định, ESI được ưu tiên hơn; tuy nhiên vẫn cần thí nghiệm để lựa chọn kỹ thuật thích nghi nhất

 Bộ phân tích khối:

Bộ phận này được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion của máy có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector Bộ phân tích

khối phân thành 4 loại:

• Bộ phân tích tứ cực ( Quadrupole analyser )

• Bộ phân tích từ ( Magnetic analyser )

• Bộ phân tích thời gian bay ( Time of flight analyser - TOF )

• Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (Ion cyclotron resonance analyser–ICR) Thiết bị mà chúng tôi sử dụng để phân tích ở đây sử dụng khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer) Khối phổ kế tứ cực sử dụng 4 thanh tròn ngắn đặt song song nhau thành 1 bó, hai đầu đặt trên 2 giá đỡ:

Hình 1.4: B ộ phân tích tứ cực đơn

Từng cặp đối diện, tích điện âm hay dương của nguồn điện DC Chúng làm cho các phân tử chuyển động quanh trục trung tâm Do đó chỉ các ion nhất định mới tới được detector, sự thay đổi tần số và điện thế cấp đã làm cho các ion có số khối khác nhau lần lượt tới detector

Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm như : Không nghiên cứu được cơ

chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, do kỹ thuật ion hoá nhẹ nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm độ

nhạy, độ chính xác

Máy đo khối phổ hai lần liên tiếp MS/MS gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc

lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm ( collision cell )

MS đầu tiên ( tứ cực Q1 ) được sử dụng để cô lập ion mẹ ( precursor ion ), ion này

liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những ion con ( product ion ), tiếp theo MS thứ hai (tứ cực Q2 ) sẽ phân tách những ion này Những ion mong muốn sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu

Hình 1.5: Nguyên lý ho ạt động của khối phổ 2 lần MS/MS

 Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu:

Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần mềm

kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo cáo, kết

xuất dữ liệu thô vừa thu được

1.3.3 M ột số kỹ thuật LC/MS:

1.3.3.1 K ỹ thuật phân tích toàn thang ( Full scan)

Là kỹ thuật phân tích mà phổ khối sẽ được đưa ra toàn bộ ion sinh ra từ ion gốc, ta

có một sắc đồ toàn ion TIC ( Total Ion Chromatogram).Kỹ thuật này cho đầy đủ các thông tin liên quan về chất phân tích hơn, tuy nhiên phương pháp này có độ

nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

1.3.3.2 K ỹ thuật phân tích chọn lọc ion SIM ( Selected Ion Monitoring)

Kỹ thuật này chỉ cho phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy ( tăng

tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu đường nền) Kỹ thuật SIM nhạy hơn Fullscan Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích dư lượng một chất đã biết trong một mẫu phức tạp

1.3.3.3 K ỹ thuật MS/MS

Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó được phân tích tiếp bằng cách

sử dụng năng lượng bẻ gãy tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2 Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy

do làm giảm nhiễu đường nền đáng kể

1.3.3.4 K ỹ thuật SRM ( Selected Reaction Monitoring)

Nếu khi lấy khối phổ 2 lần MS/MS ( MS2

) mà khối phổ kế chỉ ghi nhận một mảnh ion con mà thôi thì ta nói sử dụng kỹ thuật SRM ( chọn lọc ion con sau phản ứng) Đây là một kỹ thuật định lượng khá chính xác

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN V ẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

• Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS/MS 8030

Hình 2.1: Máy s ắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS/MS 8030

• Máy đo pH (Cyber Scan 500, Singapore)

• Cân phân tích (Sartorius, d = 0,1 mg, Đức)

• Bộ dụng cụ lọc mẫu, bộ dụng cụ lọc dung môi

• Màng lọc Sartorius RC 0,45 µm

• Micropipet

• Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống đong, lọ chứa mẫu, cốc có mỏ, pipet

2.1 2 Đối tượng nghiên cứu

- M ẫu trắng: Nước thải trắng –mẫu nước thải bệnh viện không có MTD (là mẫu

nước thải bệnh viện Ba Vì trước xử lý –T201, sau khi kiểm tra không phát hiện MTD)

- M ẫu chuẩn tự tạo: Hòa tan MTD chuẩn trong nước thải trắng với các nồng độ

thích hợp

- M ẫu thử: Mẫu nước thải trước xử lý và sau xử lý qua hệ thống xử lý nước thải của

bệnh viện được lấy từ các bệnh viện:

+ Mẫu nước thải bệnh viện Đại học Y Hà Nội, ngày lấy mẫu 21/11/2012: trước xử

lý (ký hiệu T101) và sau xử lý ( ký hiệu T111)

+ Mẫu nước thải bệnh viện Ba Vì, ngày lấy mẫu 19/11/2012: trước xử lý (ký hiệu T201) và sau xử lý ( ký hiệu T211)

+ Mẫu nước thải bệnh viện Thanh Trì, ngày lấy mẫu 25/12/2012: trước xử lý (ký

hiệu T301) và sau xử lý ( ký hiệu T311)

2.2 N ỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình định lượng metronidazol trong nước thải bệnh viện trên thiết bị LC-MS

- Thẩm định phương pháp định lượng ( tính thích hợp, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ ổn định)

- Thu thập và phân tích một số mẫu nước thải bệnh viện trên địa bàn thành phố Hà

Nội

Tiến hành thực nghiệm theo mô hình dưới đây (Hình 2.2):

Hình 2.2:Mô hình th ực nghiệm

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Qua nghiên cứu tài liệu tham khảo, chúng tôi căn cứ vào phương pháp định lượng kháng sinh trong nước thải bệnh viện tại Thụy Sĩ bằng LC-MS [35] và phương pháp định lượng MTD trong huyết tương bằng LC-MS/MS [36] để làm cơ sở xây

dựng phương pháp định lượng Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện

khối phổ trên thiết bị LC- MS/MS (Shimadzu LC/MS/MS 8030) sử dụng cột pha

đảoApollo C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) và pha động chứa các thành phần acetonitril, nước điều chỉnh pH = 3 bằng acid acetic đặc

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện thích hợp để có thể tiến hành định lượng MTD trong nước thải bệnh viện bằng phương pháp HPLC với detector MS Sau đó, tiến hành thẩm định phương pháp theo tài liệu [19] trên mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu chuẩn tự tạo để đảm bảo phương pháp là phù hợp

Chọn điều kiện sắc ký (cột sắc ký, thành phần pha động, tốc độ dòng,

thể tích tiêm)

Chọn phương pháp chiết

hợp

Độ tuyến tính

Độ đúng

Độ chính xác

LOD

và LOQ

Độ

ổn định

Mẫu nước thải

bệnh viện Đại

học Y Hà Nội (T101, T111)

Mẫu nước thải

bệnh viện Ba Vì (T201, T211)

Mẫu nước thải

bệnh việnThanh Trì (T301, T311)

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH

 Các đặc trưng thống kê dựa vào công thức hoặc dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel:

+ Giá trị trung bình :

Hàm Average trong Microsoft Excel

+ Độ lệch chuẩn:

Hàm Stdev trong Microsoft Excel

+ Độ lệch chuẩn tương đối:

1

n

i i

o Khi 2 phương sai không đồng nhất (khác nhau có ý nghĩa):

+ Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích píc sắc

ký và nồng độ chất phân tích: y = ax + b

Hệ số góc a được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoft Excel

Hệ số chắn b được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoft Excel

Hệ số tương quan r được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoft Excel

 Nồng độ MTD trong mẫu được tính theo công thức:

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 CHU ẨN BỊ MẪU

 Chu ẩn bị mẫu chuẩn tự tạo:

o Hòa tan chính xác chất chuẩn MTD trong nước cất vừa đủ 100 mL để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ MTD chính xác khoảng 250 µg/mL (dung

 Chu ẩn bị mẫu kiểm tra ( QC )

o Hòa tan chính xác chất chuẩn MTD trong nước cất vừa đủ 100 mL để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ MTD chính xác khoảng 250 µg/mL

o Pha loãng 4 mL dung dịch chuẩn gốc với nước cất vừa đủ 10 mL để thu được dung dịch chuẩn làm việc (WS) có nồng độ MTD chính xác khoảng 100 µg/mL

o Pha các dung dịch chuẩn trong nước (QC-W) từ dung dịch WS theo bảng 3.3

o Từ các dung dịch chuẩn trong nước, pha các mẫu QC chứa chuẩn MTD trong nước thải bằng cách phối hợp các dung dịch chuẩn làm việc trong nước tương ứng với nước thải trắng theo bảng 3.4

Bảng 3.3: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong nước ( QC-W)

Dung d ịch QC-W trong nước V nước

th ải trắng (mL)

3.2 KH ẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

3.2.1 Kh ảo sát điều kiện khối phổ

Chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng căn cứ vào tài liệu phương pháp định lượng kháng sinh trong nước thải bệnh viện tại Thụy Sĩ bằng LC-MS [35] và phương pháp định lượng MTD trong huyết tương bằng LC-MS/MS [36], với điều

• Nhiệt độ mao quản: 2500C

Với điều kiện khối phổ như trên, chúng tôi tiến hành khảo sát để xác định ion mẹ, ion con và thế phân mảnh

Sau khi chạy chương trình tune tín hiệu (là chương trình điều chỉnh và tối ưu tín

hiệu bắt ion có m/z xác định), khảo sát phổ khối của MTD, kết quả quét phổ MS 1

lần ở chế độ + ESI của dung dịch chuẩn MTD trong nước C4 (5 µg/mL) được ghi ở hình 3.1

Hình 3.1:Ph ổ MS của dung dịch chuẩn MTD 5 µg/mL

172.15