Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải một số bệnh viện tại hà nội bằng kỹ thuật LC MS

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ NGA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TẠI HÀ NỘI BẰNG KỸ T

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ NGA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TẠI HÀ NỘI BẰNG

KỸ THUẬT LC-MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ NGA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH

SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI

MỘT SỐ BỆNH VIỆN TẠI HÀ NỘI BẰNG

KỸ THUẬT LC-MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 Ths Nguyễn Thanh Phương

2 Ths Nguyễn Trung Hiếu

Nơi thực hiện:

1 Phòng phân tích II- TT kiểm nghiệm

Dược phẩm- Mỹ phẩm Hà Nội

2 Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2013

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn đến Ths Nguyễn Thanh

Phương, Ths Nguyễn Trung Hiếu, Dược sỹ Dương Thị Vân đã trực tiếp

giúp đỡ cung cấp cho em những tài liệu, hướng dẫn em những kỹ năng cần thiết để em hoàn thành khóa luận này

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích - Trường Đại học Dược Hà Nội, các cán bộ phòng phân tích II- Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Hà Nội đã giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài

Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu nhà trường, phòng đào tạo đã tạo điều kiện tốt nhất cho em để hoàn thành quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, em vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, những người đã luôn động viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có được kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2013

Sinh viên Phạm Thị Nga

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SULFAMETHOXAZOL 7

1.2.2 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao 7

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 KHẢO SÁT VÀ TÌM ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG-KHỐI PHỔ 24

3.4.6 Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 39 3.4.7 Khảo sát độ ổn định của sulfamethoxazol trong dung môi 40 3.5 ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG SULFAMETHOXAZOL TRONG

DANH MỤC CÁC BẢNG

05 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của sulfamethoxazol 36

09 Độ ổn định của sulfamethoxazol trong dung môi 41

10 Kết quả hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong

một số mẫu nước thải bệnh viện 43

11 Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ chất ô nhiễm Phụ lục

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

06 Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LCMS-8030 19

07 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN-H2 O : 1-1) 25

08 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN- H2 O: 8-2) 25

09 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN- H2 O: 2-8) 26

10 Sắc ký đồ mẫu chứa SMZ với điều kiện sắc ký đã khảo sát

lại

27

11 Phổ khối của SMZ 0,05 ppm pha trong ACN: H2 O (1:1) 29

12 Phổ khối của SMZ thu được ở các mức năng lượng va

21 Sắc ký đồ mẫu thử TN (SXL) Phụ lục

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Full scan: Kỹ thuật phân tích toàn thang

HPLC: High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng

hiệu năng cao)

LC-MS: Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass

Spectrometry)

LC-MS/MS: Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (Liquid Chromatography

Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry)

LOQ: Giới hạn định lượng dưới (Limit of Quantitation)

m/z: Khối lượng / Điện tích

RSD% : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SPE: Solid phase extraction (Chiết pha rắn)

SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

SIM: Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion

IT.s : Cường độ tín hiệu.giây (intensity.second)

- Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật của đất [28], [29], [30], [31]

Quần thể vi sinh vật đất có ý nghĩa rất quan trọng trong các chu trình chuyển hoá vật chất trong đất và cải thiện độ phì nhiêu của đất Kháng sinh dù bằng con đường nào được thải ra môi trường đều phá vỡ sự cân bằng sinh thái

hệ vi sinh vật và ảnh hưởng đến độ phì của đất, tăng ô nhiễm môi trường

- Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi

trường [28], [29], [30], [31]

Kháng sinh được thải ra môi trường bằng nhiều con đường khác nhau, trong môi trường chứa rất nhiều loài vi sinh vật, trong đó có nhiều loài vi khuẩn đã có khả năng kháng một hoặc một vài loại kháng sinh, chính chúng là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường

- Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm [28], [29], [30], [31]

Sử dụng nguồn nước thải chưa được xử lý của một số công ty sản xuất dược phẩm hay một số bệnh viện, sử dụng kháng sinh trong trồng trọt, chăn nuôi Tất cả những nguyên nhân trên làm cho thực phẩm tồn dư kháng sinh,

có ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe của người tiêu dùng Các chuyên gia còn cảnh báo, đã xuất hiện mối đe dọa, sau hơn chục năm hoặc vài chục năm nữa

chúng ta sẽ bất lực với nhiều chứng bệnh, thậm chí không còn kháng sinh dự phòng khi nhiễm khuẩn nhẹ

Sulfamethoxazol là một kháng sinh thuộc nhóm sulfamid, là nhóm có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong bệnh viện để điều trị nhiễm khuẩn đặc biệt là nhiễm khuẩn tiết niệu [7] Do đó, khả năng có mặt của sulfamethoxazol trong nước thải bệnh viện là rất lớn Mặc dù, có xuất hiện trong nước thải bệnh viện nhưng hàm lượng của chúng lại rất nhỏ, những phương pháp phân tích thông thường đôi khi lại không phát hiện được Xuất phát từ thực tế trên đây, chúng tôi thực hiện đề tài:

“ Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng

bằng kỹ thuật LC-MS”

Với các mục tiêu sau:

 Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng kháng sinh sulfamethoxazol bằng kỹ thuật LC-MS

 Thẩm định phương pháp vừa xây dựng

 Khảo sát hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải tại một số bệnh viện tại Hà Nội

 Tính chất hóa học:

SMZ có tính lưỡng tính, tính kiềm do nhóm amin thơm và có tính acid

do nguyên tử H ở chức amid linh động, dễ tạo muối Na tan tốt trong nước Nhưng nếu pha trong dung dịch pH thiên về acid sẽ trả lại dạng acid không tan trong nước làm dung dịch bị vẩn đục

Do có nguyên tử H linh động SMZ tạo muối phức kết tủa với Ag+, phức màu kết tủa với Cu++

, Co++

Nhóm amin thơm tự do cho phản ứng diazo hóa, rồi ngưng tụ với α(β)- naphton cho phẩm azoic màu đỏ cam Người ta thường dựa vào nhóm này để định lượng bằng phép đo nittrit với chỉ thị là dung dịch hồ tinh bột có iod hoặc tropeolin 00 hoặc dùng điện kế Nhóm amin thơm làm phân tử dược chất rất dễ bị oxy hóa nên phải có các biện pháp chống oxy hóa thích hợp để ổn định dược chất khi pha thành dung dịch

1.1.3 Cơ chế tác dụng [5], [6], [9], [10], [11], [14]

Với nồng độ thấp, SMZ là một sulfamid kìm khuẩn, với nồng độ cao nó

có tác dụng diệt khuẩn Một số vi khuẩn trong quá trình tổng hợp và chuyển hóa acid folic thành nucleoprotein cần thiết cho cơ thể Do SMZ có cấu trúc tương tự acid para aminobenzoic PABA nên nó có khả năng tranh chấp cao với chất này Từ đó ức chế được dihydrofolat synthetase SMZ ngăn cản tổng hợp acid folic đồng thời ức chế dihydrofolat synthetase nên kìm hãm quá trình chuyển acid folic thành acid dihydrofolic Do đó, quá trình tổng hợp acid folic (là 1 acid cần thiết cho quá trình tăng trưởng của các chủng vi khuẩn nhậy cảm) bị ức chế ngay từ giai đoạn I

Sulfamethoxazol

(-)

Dihydrofolat synthetase

Pteridin + PABA Acid folic

Đối với vi khuẩn không tổng hợp acid folic hay không sử dụng acid folic

thì hiển nhiên, nó sẽ không chịu tác động của sulfamid kháng khuẩn này

1.1.4 Dược động học, độ ổn định [5], [6], [7]

 Dược động học:

Hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, sinh khả dụng cao, đạt nồng độ trong

huyết tương xấp xỉ đường tiêm tĩnh mạch Thuốc phân bố rộng rãi vào các mô

và dịch cơ thể, kể cả dịch não tủy SMZ chuyển hóa ở gan và thải trừ chủ yếu

qua nước tiểu ở dạng nguyên vẹn và dạng đã chuyển hóa

Thời gian bán thải 9 – 11 giờ ở người bình thường và kéo dài ở bệnh

nhân suy thận

 Độ ổn định:

Trong môi trường acid HCl 0,4M, SMZ có thể bị thủy phân thành acid

sulphanilic và 5- methyl-3-amino isoxazol và tiếp tục bị phân hủy khi đun

nóng Trong môi trường kiềm SMZ tương đối bền vững

SMZ không bền dưới tác động của nhiệt và rất nhạy cảm với ánh sáng

mặt trời Các điều kiện ánh sáng, nhiệt độ làm tăng quá trình oxy hóa tạo các

sản phẩm khác nhau Dung dịch sẽ bị biến màu từ không màu thành màu vàng

rồi sang màu nâu

1.1.5 Tác dụng dược lý [5], [7]

SMZ là 1 sulfamid kháng khuẩn , tác dụng lên nhiều vi khuẩn Gram âm

như lậu cầu, mô não cầu và Gram dương như liên cầu, tụ cầu, phế cầu

Hiện nay, đã có 1 số loại vi khuẩn kháng thuốc (vi khuẩn kị khí, Enter –

ococcus) nhưng SMZ còn rất đặc hiệu trong việc điều trị nhiễm khuẩn đường

tiết niệu (do Escherichia coli) Đặc biệt, với chứng lẹo mắt (sưng mí mắt cấp

tính) gây ra bởi vi khuẩn như Staphylococus (hiện nay thuốc nhỏ mắt có chứa

SMZ thường dùng với mục đích này)

1.1.6 Chỉ định [5], [7]

Dạng bào chế viên nén, thuốc tiêm thường kết hợp với trimethoprim

(sulfamethoxazol : trimethoprim theo tỷ lệ 5:1) dùng để điều trị các nhiễm

khuẩn do khuẩn do vi khuẩn nhạy cảm: Nhiễm khuẩn tiết niệu, sinh dục,

nhiễm khuẩn hô hấp (như viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa ) nhiễm

khuẩn đường tiêu hóa vì dạng này có khả năng kháng khuẩn cao

Thuốc nhỏ mắt có chứa natri sulfamethoxazol kết hợp với 1 số thành

phần khác (biệt dược Rhoto antibacteria) được dùng để điều trị trong các

trường hợp lẹo mắt, viêm kết mạc, viêm mí mắt Ngoài ra, dùng để chống bội

nhiễm trong các trường hợp như loại bỏ các dị vật ra khỏi mắt

1.1.7 Tác dụng không mong muốn [5], [7]

- Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn, tiêu chảy, viêm miệng, viêm lưỡi

- Thận: Viêm kẽ thận, suy thận, sỏi thận

- Da: Ban da, mày đay, mụn phỏng, hội chứng Steven- Johnson và Lyell

- Máu: Thiếu máu hồng cầu to do thiếu acid folic, thiếu máu tan máu,

giảm huyết cầu tố

- Ngoài ra, vàng da ứ mật, tăng K+ huyết, ù tai, ảo giác Tiêm tĩnh mạch

có thể gây viêm tĩnh mạch, tổn thương mô

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SULFAMETHOXAZOL

[3], [4], [11], [12], [13], [24], [25]

- Định lượng nguyên liệu: Dùng phương pháp đo nitrit, hoặc dùng phương

pháp đo quang dựa trên sự tạo phức của SMZ, tạo sản phẩm có màu đỏ Cũng

có thể dùng kỹ thuật HPLC

- Định lượng đa thành phần hay thành phẩm: Dùng HPLC với detector

UV

1.2.1 Phương pháp đo nitrit [3], [24], [25]

Hòa tan khoảng 0,200 g chế phẩm trong hỗn hợp gồm 50 ml dung dịch

acid hydroclorid 10% (TT) và 50 ml nước Thêm 3g kali bromid (TT), làm

lạnh dung dịch trong nước đá và chuẩn độ chậm bằng dung dịch natri nitrit

0,1M (CĐ), xác định điểm kết thúc bằng chuẩn độ đo ampe

1ml dung dịch natri nitrit 0,1M (CĐ) tương đương với 25,33 mg

C10 H11N3O3S

1.2.2 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao [11], [12], [13], [14]

Điều kiện phân tích bằng HPLC đã áp dụng:

Các phương pháp trên có giới hạn phát hiện thấp, thường dùng để định

lượng kháng sinh SMZ trong chế phẩm Do hàm lượng kháng sinh trong

nước thải bệnh viện tương đối thấp nên các phương pháp trên không đáp ứng

được yêu cầu Chính vì thế, cần sử dụng LC-MS với độ nhạy cao hơn để định

lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải bệnh viện

1.3 T ỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ [1], [8], [15]

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là kỹ thuật phân tích chất dựa trên sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân tích khối phổ (MS) Sau quá trình thử nghiệm lâu dài, đến đầu những năm 1970 người ta mới kết nối thành công hệ thống LC với MS Nguyên nhân của sự chậm trễ này chủ yếu là

do khó khăn về kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống có độ chân không cao của máy khối phổ (MS) Kể từ đó đến nay sắc ký lỏng khối phổ LC-MS không ngừng phát triển và chứng minh được tầm quan trọng của mình trong phân tích

Phương pháp LC-MS thường được sử dụng trong phân tích dược phẩm

để phân tích:

- Các hợp chất tương đối phân cực hoặc phân cực nhiều, khó bay hơi

(GC-MS rất khó thực hiện hay không thực hiện được)

- Các phân tích kiểm nghiệm phức tạp mà HPLC thường không giải quyết được

- Phân tích thuốc trong dịch sinh học

- Phân tích các hợp chất tự nhiên trong cây thuốc

- Trường hợp không tìm được các detector thích hợp

Phân tích khối phổ có tính chọn lọc, độ nhạy, độ đặc hiệu cao Giới hạn phát hiện có thể đến 10-14 gam Do vậy, phân tích khối phổ càng được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ như xác định các đồng vị, xác định công thức cấu tạo, định tính, định lượng các chất trong dịch sinh học

và trong các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên Đặc biệt, dùng để phân tích hàm lượng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp

1.3.1 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ

1.3.1.1 Pha động

Trong sắc ký lỏng, thành phần của dung môi rửa giải (pha động) là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới sự tách Pha động thường là hỗn hợp các dung môi hòa tan vào nhau để có thể tách chất với độ phân giải phù hợp Trước khi sử dụng cần phải lọc (màng lọc 0,45 hoặc 0,2 µm), đuổi khí hòa tan trong pha động, vì khí hòa tan có thể làm biến dạng, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền Có thể loại khí hòa tan bằng cách: Chạy siêu âm, sục khí trơ như heli

Có hai cách dùng pha động để rửa giải:

- Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình sắc

ký

- Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường sử dụng từ 2 đến 4 loại dung môi khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình dung môi đã định Chế độ rửa giải gradient nồng độ thích hợp với những mẫu phân tích gồm nhiều thành phần có độ phân cực khác nhau nhiều, khi đó chế độ này rút ngắn thời gian phân tích và tăng độ phân giải

1.3.1.3 H ệ tiêm mẫu:

Hiện nay, các máy HPLC hiện đại đều sử dụng hệ thống tiêm mẫu tự động Đây là một ưu điểm lớn của HPLC vì có thể tích chính xác và độ lặp lại rất cao

1.3.1.4 C ột sắc ký

Cột tách thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài từ 10 - 30 cm, đường kính trong 4 - 10 mm Kích thước của hạt nhồi trong cột thường là 5 - 10 µm Các chất nhồi cột thường được sử dụng là silicagel, nhôm oxyd, polyme xốp hoặc các loại pha đảo C2, C8, C18,

Cột tách yêu cầu phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên bề mặt và có thể chịu được áp suất cao

1.3.1.5 Detector kh ối phổ

Là bộ phận phát hiện và đo các tín hiệu sinh ra khi có chất ra khỏi cột, các tín hiệu này được ghi trên sắc đồ

 Việc sử dụng khối phổ làm detector có những ưu điểm sau:

- Độ nhạy cao, phân tích được các chất có giới hạn phát hiện thường ở mức phần tỷ (ppb)

- Có thể đưa ra những thông tin đặc hiệu về khối lượng và cấu tạo hóa học của chất phân tích

- Làm tăng tính chọn lọc và giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích

Pa đến 10-6

Pa

Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc một phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất

 Nhiệm vụ của detector khối phổ: Chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

Hệ chân không (áp suất 10-3

: 10-6 Pa)

Hình 01 : Các bộ phận của detector khối phổ

• Nhiệm vụ:

- Ion hóa các nguyên tử, phân tử của mẫu

- Ion hóa chất cần phân tích

- Chuyển ion từ pha dung dịch vào pha hơi

- Khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối

- Cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân không sâu

- Rút ra ngoài các phân tử trung hòa và ion khác dấu có thể ảnh hưởng tới phép đo

• Các kỹ thuật ion hóa:

Hiện nay chủ yếu sử dụng hai kỹ thuật: Kỹ thuật phun điện tử (ESI) và

kỹ thuật ion hóa bằng hóa học ở áp suất thường (APCI)

 Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất thường APCI (Atmospheric pressure chemical ionization)

- Nguyên tắc: Phân tử hòa tan trong dung môi đi qua một lò sấy, hóa hơi, các phân tử hơi được phun ra nhờ khí N2 và bị ion hóa trong vùng phóng điện

- Hiện tượng ion hóa xảy ra:

+ Cơ chế tạo ion dương:

N2 + e- → N2+

+ 2e-

H2O + e- → H2O+ + 2e- H2O + H2O + → H3O+

+ ∙OH (Phản ứng ion- phân tử)

M + H3O + → MH+

+ HO (Phản ứng ion- phân tử) + Cơ chế tạo ion âm:

Với những phân tử có H linh động, trong vùng phóng điện có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi một H+, phần còn lại là một anion:

 Kỹ thuật phun ion ESI (Electrospray ionization)

Kỹ thuật ESI là kỹ thuật được sử dụng trong khóa luận này và cũng

là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất trong LC- MS

Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế 3-5 kV (điện thế dương ở đầu kim loại tạo ion dương, và ngược lại) và sau đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra xung quanh ống mao quản Dưới tác động của điện thế cao và luồng khí phun nitơ, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện thoát ra từ đầu ống mao quản Sau khi qua ống mao quản, dưới tác động của khí nóng và luồng khí phun nitơ, các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích nhỏ dần

và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ bẻ dần tạo thành những hạt nhỏ mang điện tích Sau đó các ion âm hay ion dương tạo thành được đưa vào

bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra ngoài

 B ộ phân tích khối:

Bộ phận này được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion của máy có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector

Bộ phân tích khối trong luận văn này là bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole ion trap)

Thế xoay chiều tần số radio áp vào cực trung tâm sẽ đưa các ion vào chuyển động tròn trong hốc với quĩ đạo ổn định Bằng cách thay đổi thế xoay chiều làm cho các ion có m/z xác định chuyển động theo quĩ đạo không ổn định rơi vào cực phía dưới bẫy Bộ phận nhận electron của detector sẽ thu nhận và phát hiện ion

Bộ phân tích tứ cực đơn Bộ phân tích từ

Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện

tử của máy khối phổ

Toàn bộ hệ thống LC-MS được kết nối với máy tính đã cài đặt phần mềm thích hợp, người phân tích giao tiếp với hệ thống qua máy tính trên phần

mềm này để điều khiển, theo dõi quá trình phân tích, nhận thông tin và xử lý thông tin

Tín hiệu điện được khuyếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu phục vụ

xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau: Ghi phổ, định lượng

1.3.2.1 K ỹ thuật phân tích toàn thang (Full scan)

Với một hỗn hợp nhiều chất, sau khi được tách ra qua cột sắc ký lỏng và đưa vào detector khối phổ, khối phổ kế ghi nhận tổng cường độ các ion sinh

ra từ mỗi chất, phổ khối sẽ đưa ra toàn bộ ion sinh ra từ ion gốc, ta có một sắc

ký đồ toàn ion TIC (Total Ion Chromatogram)

Kỹ thuật này cho đầy đủ các thông tin liên quan về chất phân tích hơn, tuy nhiên phương pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

Kỹ thuật này chỉ cho phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng

độ nhạy (tăng tỷ lệ tín hiệu /nhiễu đường nền) Kỹ thuật SIM nhạy hơn Full scan Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích dư lượng một chất đã biết trong một mẫu phức tạp

Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó được phân tích tiếp bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2 Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm giảm nhiễu đường nền Do đó, kỹ thuật này ngày càng được ứng dụng nhiều để phân tích định lượng nồng độ thuốc trong dịch sinh học ở các nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học của thuốc

Nhược điểm của phương pháp: Vì có độ nhạy cao nên đòi hỏi các hóa chất tinh khiết cao, dụng cụ siêu sạch, người điều khiển máy có trình độ, đã qua đào tạo chuyên môn

1.3.2.4 Kỹ thuật SRM (Selected Reaction Monitoring)

Nếu khi lấy khối phổ hai lần MS/MS mà khối phổ kế chỉ ghi nhận một mảnh ion con mà thôi thì ta nói sử dụng kỹ thuật SRM (chọn lọc ion con sau phản ứng) Đây là một kỹ thuật định lượng khá chính xác

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Hóa chất, thuốc thử

• Sulfamethoxazol (HPLC, Merck)

• Acid formic, acid acetic, amoni acetat (HPLC, Merck)

• Methanol (HPLC, Merck), acetonitril (HPLC, Merck)

• Khí nitơ

• Nước cất hai lần

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

• Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LCMS-8030

• Bộ dụng cụ chiết pha rắn với cột C18 Agilent (3ml, 200mg)

• Máy lắc siêu âm GRANT

• Cốc có mỏ 50 mL, 100 mL

• Bình nón dung tích 100 mL, 250 mL

• Ống đong dung tích 25mL ,50 mL

• Pipet chính xác loại A, pipet thẳng

• Cân phân tích METLER độ chính xác 0,0001g

• Bộ dụng cụ lọc mẫu, bộ dụng cụ lọc dung môi

• Màng lọc mẫu 0,45µm , màng lọc dung môi 0,45µm

Hình 06: Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LCMS-8030

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

• Mẫu thử: Mẫu nước thải các bệnh viện:

- Bệnh viện Đại học Y Hà Nội (ĐHY) lấy ngày 9/12/2012

- Bệnh viện Bạch Mai (BM) lấy ngày 3/3/2013

- Bệnh viện Thanh Nhàn (TN) lấy ngày 24/3/2013

Trước xử lý (TXL) và sau xử lý (SXL) qua hệ thống xử lý nước thải tại bệnh viện

• Mẫu trắng là mẫu không có kháng sinh sulfamethoxazol, các thành phần khác tương tự mẫu thử, là mẫu nước thải bệnh viện Ba Vì trước xử lý lấy ngày 23/12/2012 đã xác định không có chứa kháng sinh SMZ

 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu

2.2.2 Th ẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp phân tích đã được lựa chọn với các chỉ tiêu: Tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, tính thích hợp, độ chính xác, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), độ ổn định của phương pháp

Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng sulfamethoxazol trong nước thải tại một số bệnh viện

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

 Dùng phương pháp chiết pha rắn để chiết sulfamethoxazol từ nước

Đường chuẩn phải có hệ số tương quan r ≥ 0,998

2.3.2.3 Tính thích hợp

Tính thích hợp của hệ thống phân tích được khảo sát dựa vào số liệu phân tích 6 lần cùng một mẫu chuẩn trên các thiết bị phân tích trong cùng điều kiện, tính thích hợp xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) diện tích pic và thời gian lưu của cùng một mẫu chuẩn tiêm 6 lần trên các thiết bị phân tích trong cùng điều kiện

2.3.2.4 Độ chính xác

Độ chính xác của một phương pháp pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD %)

2.3.2.5 Độ đúng

Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, đó là tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm lại được so với lượng chất chuẩn đã thêm vào mẫu thử

2.3.2.6 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được về mặt định tính nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể LOD được xác định bằng 3 lần tỷ số giữa

độ lệch tín hiệu nền lân cận và độ nhạy chất đó Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất cần thử có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác phù hợp LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải

ít nhất gấp 10 lần tỷ số giữa độ lệch tín hiệu nền lân cận và độ nhạy của chất

đó (LOQ = 3,3 LOD)

2.3.2.7 Độ ổn định

Độ ổn định của phương pháp là khả năng cung cấp các kết quả có độ chính xác chấp nhận được dưới những điều kiện có sự thay đổi về một số điều kiện thực hiện phương pháp

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các công thức hoặc dựa vào

các hàm số trong phần mềm Microsoft Exel 2007

Tiến hành thí nghiệm n lần, thu được các kết quả xi là x1, x2 , x3 xn , khi đó:

+ Chuẩn Student:

o Khi 2 phương sai có sự đồng nhất:

Bậc tự do :

o

o

o Khi 2 phương sai không đồng nhất (khác nhau có ý nghĩa):

• Tương quan hồi qui tuyến tính

Phương trình tương quan hồi qui tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích píc sắc ký và nồng độ chất phân tích : y=ax+b

Trong đó:

• Hệ số góc (a) được tính bằng hàm Slope trong Microsoft Exel

• Hệ số chắn (b) được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoft Exel

• Hệ số tương quan (r) được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoft

Áp dụng phương pháp đã xây dựng và thẩm định, tiến hành định lượng

sulfamethoxazol trong nước thải tại một số bệnh viện khác nhau

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1.1 Xây dựng chương trình sắc ký

a Lựa chọn cột sắc ký

Qua tham khảo tài liệu [12],[17], [22], [23], [26] được công bố và điều kiện thực tế của trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Hà Nội chúng tôi chọn cột Zobrax C18 (150mm x4,6mm, 5 µm) để nghiên cứu

b Khảo sát các thành phần pha động đã được công bố trước đó

Qua tham khảo tài liệu chúng tôi chọn thành phần pha động là hỗn hợp acetonitril - nước, điều chỉnh bằng acid acetic đặc đến pH = 3

Pha dung dịch chuẩn gốc:

Dung dịch chuẩn gốc A (0,25 mg/ml): Pha dung dịch chuẩn gốc sulfamethoxazol 0,25 mg/ml:

Cân chính xác 25 mg chất chuẩn SMZ vào bình định mức 100 ml thêm khoảng 60 ml dung môi lắc đều cho tan, thêm dung môi vừa đủ, lắc đều (bằng máy siêu âm) Bảo quản dung dịch này trong tủ bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8 ᵒC

 Dung dịch chuẩn B (100 µg/ml): Hút chính xác 4 ml dd A thêm dung môi vừa đủ 10 ml, lắc đều được dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml

 Dung dịch chuẩn C (10 µg/ml): Hút chính xác 1 ml dd B thêm dung môi vừa đủ 10 ml, lắc đều được dung dịch chuẩn gốc 10 µg/ml Dung dịch này được sử dụng để tune máy ( hiệu chỉnh tín hiệu), tối ưu hoá điều kiện bắn ion và khảo sát khối phổ của sulfamethoxazol

 Pha dung dịch chuẩn của SMZ chạy sắc ký với nồng độ khoảng 0,05ppm (0,05 µg/ml): Hút chính xác 0,25 ml dung dịch chuẩn C đã pha ở trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm hỗn hợp dung môi đến vạch Tiến