Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng azithromycin trong chế phẩm bằng kỹ thuật quét đồng bộ phổ huỳnh quang

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HIỀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT QUÉT ĐỒNG BỘ PHỔ HUỲNH QUANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HIỀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT QUÉT ĐỒNG BỘ PHỔ HUỲNH QUANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. Ths.Nguyễn Trung Hiếu 2.Ths. Bùi Đình Sơn Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa phân tích- Trường ĐH Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ths.Nguyễn Trung Hiếu và Ths. Bùi Đình Sơn là những gười thầy đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn , giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm , giúp đỡ của thầy cô, anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa Phân Tích –Độc Chất Trường Đại Học Dược Hà Nội trong thời gian làm thực nghi ệm tại bộ môn. Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu nhà trường, thầy cô đã tạo cho em những điều kiện tốt nhất để hoàn thành khóa học tại trường. Cuối cùng em xin cảm ơn Gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian em học tập tại trường. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Tháng 5 năm 2014. Sinh viên Nguyễn Thị Hiền DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang Bảng 1 Một số chế phẩm chứa AZTR lưu hành trên thị trường. 7 Bảng 2 Một số kỹ thuật định lượng Azithromycin bằng HPLC. 8 Bảng 3 Ảnh hưởng của các nhóm thế đến hiệu quả huỳnh quang của các dẫn chất Benzen 12 Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 Bảng 3.1 Kết quả về cường độ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl ở các nồng độ khác nhau tại thời điểm 30 phút 28 Bảng 3.2 Kết quả về cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR 10mg/L trong HCl 9M, ở nhiệt độ 21-23 0 C , Δλ=30nm tại các thời điểm khảo sát 30 Bảng 3.3 Kết quả về cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR 10mg/L trong HCl 9M ở các nhiệt độ khác nhau tại các thời điểm khảo sát. 32 Bảng 3.4 Kết quả về cường độ huỳnh quang của các dung dịch dẫn xuất AZTR ở các Δλ khác nhau tại thời điểm 30 phút. 35 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 37 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ chính xác. 40 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng 42 Bảng 3.8 Kết quả định lượng một số chế phẩm chứa AZTR trên thị trường 44 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. MeOH : Methanol. AZTR : Azithromycin. Kl/kl : Khối lượng / khối lượng. RSD: Độ lệch chuẩn tương đối. TB: Trung bình. Gr (+): Vi khuẩn gram dương. Gr (-) : Vi khuẩn gram âm. HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Trang Hình 1 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang- Tăng cường độ huỳnh quang bằng hệ thống gương 13 Hình 2 Sơ đồ giải thích quét đồng bộ phổ huỳnh quang 19 Hình 3.1 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M Δλ=30nm, t=21-23 0 C, tại thời điểm 30 phút 25 Hình 3.2 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong H 2 SO 4 9M, Δλ=30nm, t=21-23 0 C, tại thời điểm 30 phút 26 Hình 3.3 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HNO 3 9M, Δλ=30nm, t=21-23 0 C, tại thời điểm 30 phút 26 Hình 3.4 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 7M, Δλ=30nm t=21-23 0 C tại thời điểm 30 phút 28 Hình 3.5 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 5M, Δλ=30nm t=21-23 0 C tại thời điểm 30 phút 28 Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng nồng độ acid HCl lên cường độ huỳnh quang của dẫn xuất AZTR 29 Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian tạo dẫn xuất lên cường độ huỳnh quang của dẫn xuất AZTR 30 Hình 3.8 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M, t=40 0 C, Δλ=30, tại thời điểm 30 phút 31 Hình 3.9 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M, t=55 0 C, Δλ=30, tại thời điểm 30 phút 32 Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR 10mg/L trong HCl 9M. 33 Hình 3.11 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M ở t=21-23 0 C, Δλ=40nm, tại thời điểm 30 phút 34 Hình 3.12 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M ở t=21-23 0 C, Δλ=35nm, tại thời điểm 30 phút 34 hình 3.13 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M ở t=21-23 0 C, Δλ=50nm, tại thời điểm 30 phút 34 Hình 3.14 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của Δ λ = λ em - λ ex lên cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR ở các nồng độ khác nhau trong HCl 9M. 35 Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR trong HCl 9M. 38 1 ĐẶT VẤN ĐỀ. Năm 1929 khi Alexander Fleming tìm ra và sau đó phân tách được penicillin đã mở ra một kỷ nguyên mới trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng, mà trước đó được coi là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên thế giới đặc biệt là ở các nước kém và đang phát triển trong đó có Việt Nam. Trong suốt những thập kỷ tiếp theo và cho đến tận ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học - kỹ thuật nhiều kháng sinh mới đã được tìm ra và cho hiệu quả điều trị ngày càng cao. Trong đó có Azithromycin (1980) là một kháng sinh macrolid bán tổng hợp được sử dụng để điều trị các loại nhiễm khuẩn như nhiễm khuẩn đường hô hấp, da, đường tiêu hóa, đường sinh dục, đặc biệt AZTR có tác dụng tốt trên vi khuẩn nội bào, các vi khuẩn cơ hội ở bệnh nhân bị nhiễm HIV [4], [15]. Hiện nay trên thị trường dược phẩm Việt Nam có nhiều loại biệt dược chứa AZTR có xuất xứ khác nhau cả trong và ngoài nước. Để kiểm tra, kiểm soát , đảm bảo chất lượng của từng loại biệt dược đang lưu hành trên thị trường và để việc sử dụng được đúng liều, đảm bảo hiệu quả điều trị thì công tác kiểm nghiệm định lượng AZTR trong chế phẩm đóng một vai trò rất quan trọng. Vì vậy nhằm mục đích cung cấp một phương pháp định lượng AZTR đơn giản, nhanh chóng , có độ chính xác cao và tại Việt Nam chưa được sử dụng nhiều, để đảm bảo công tác kiểm nghiệm, đảm bảo chất lượng chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng và khảo sát hàm lƣợng Azithromycin trong chế phẩm bằng kỹ thuật quét đồng bộ phổ huỳnh quang” với các mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định lượng AZTR bằng kỹ thuật quét đồng bộ phổ huỳnh quang. - Thẩm định phương pháp vừa xây dựng 2 - Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để định lượng một vài chế phẩm chứa AZTR đang lưu hành trên thị trường. 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1.TỔNG QUAN VỀ AZITHROMYCIN (AZTR). 1.1.1. Công thức cấu tạo [5] - Công thức phân tử: C 38 H 72 N 2 O 12 - Khối lượng phân tử: 748,98 - Tên khoa học : 10-deoxo-11-methyl-11-azaerythromycinA 1.1.2.Tính chất vật lý và hóa học  Tính chất vật lý [4],[5] - Bột kết tinh màu trắng đến trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng - Thực tế không tan trong nước rất dễ tan trong methanol, ethanol, methylen clorid, aceton, chloroform, dung dịch acid hydroclorid loãng… - Năng suất quay cực từ -45 0 đến -49 0 (dung dịch 20mg/ml trong Ethanol). - Trong cấu trúc của AZTR không có các dây nối liên hợp và các nhóm mang màu nên nó hấp thụ UV kém và không phát huỳnh quang.  Tính chất hóa học [4], [5] - Tính base do các Osamin (đường amin) gây ra và một nhóm amin như là một phần của vòng macrolacton có pKa= 8,74. - Tạo được muối dễ tan trong nước với các acid vô cơ và hữu cơ. - Phản ứng màu với acid HCl, H 2 SO 4 . Hòa tan AZTR vào HCl đặc để yên khoảng 10 phút thấy xuất hiện màu vàng. 4 1.1.3. Dƣợc động học.[4], [15] Hấp thu: - AZTR hấp thu nhanh, sinh khả dụng đường uống đạt 40% - Thức ăn làm giảm hấp thu AZTR khoảng 50%, - Sau khi dùng thuốc , nồng độ đỉnh huyết tương đạt được trong vòng từ 2 đến 3 giờ. Phân bố: - Phân bố rộng rãi trong cơ thể, chủ yếu vào các mô như phổi, amidan, tiền liệt tuyến, bạch cầu hạt, đại thực bào…. Với nồng độ cao hơn trong máu nhiều lần (khoảng 50 lần nồng độ tối đa tìm thấy trong huyết tương) , vì vậy dùng để điều trị nhiễm khuẩn nội bào tốt. - Tuy nhiên nồng độ thuốc trong hệ thống thần kinh trung ương rất thấp. Chuyển hóa- Thải trừ: - Một lượng nhỏ AZTR bị khử metyl trong gan, được đào thải qua mật ở dạng không biến đổi và một phần ở dạng chuyển hóa. - Khoảng 6% liều uống thải trừ qua nước tiểu trong vòng 72h ở dạng không biến đổi. 1.1.4. Cơ chế tác dụng [4] - AZTR tác động bằng cách gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosom ở vi khuẩn và qua đó ngăn cản quá trình tổng hợp protein của chúng. 1.1.5.Tác dụng dƣợc lý (phổ tác dụng) [4], [15] - Là một kháng sinh có hoạt phổ rộng thuộc nhóm Macrolid, được gọi là azalid. Thuốc có tác dụng diệt khuẩn mạnh. - Có tác dụng tốt trên các vi khuẩn Gram(+) như: Streptococcus, Pneumococcus, Staphylococcus aureus…. [...]... ca dung mụi cng cho kt qu tng t 1.2.1.4 Mỏy quang ph hunh quang. [1], [2] Bộ đơn sắc kích thích G-ơng Nguồn sáng Bộ đơn sắc huỳnh quang Hỡnh 1 S cu to mỏy quang ph hunh quang - Tng cng hunh quang bng h thng gng Cu to mỏy - Ngun sỏng trong mỏy quang ph hunh quang cú nhim v to ra cỏc bc x kớch thớch cn thit Ngun sỏng thng dựng l n xeon cú kh nng phỏt ra bc x trong khong rng 200-800nm nhng ph bc x khụng... cht phỏt hunh quang - Vỡ hunh quang a hng nờn cng hunh quang o dc ch l mt phn ca cng hunh quang v ngi ta thng o theo phng vuụng gúc vi chựm tia kớch thớch - Núi chung cng hunh quang ph thuc tuyn tớnh vi nng vựng nng thp S tuyn tớnh mt i khi truyn qua ch cũn di 90% (hay mt quang vt quỏ 0.05) - Trong hunh quang ngi ta dựng 2 khỏi nim ph phỏt x hunh quang ( em) v ph kớch thớch hunh quang ( ex) 11... hunh quang [1] - Thi gian hunh quang rt ngn ch khong 10 -9 giõy v s hunh quang l a hng - Hiu sut hunh quang l mt c trng vt lớ cho bit kh nng hunh quang ca mt cht v c tớnh bng t s gia s photon phỏt x v s photon hp th - Cng hunh quang l hiu sut thc nghim hot tớnh phỏt hunh quang ca mt cht khi nú c kớch thớch do c hp th mt bc x thớch hp Cng hunh quang t l vi cng bc x kớch thớch, hiu sut hunh quang. .. quang ph hunh quang phi c chun húa thng xuyờn vi cht chun - Tin hnh chun mỏy theo ti liu hng dn ca nh sn xut mỏy 1.2.1.5.ng dng ca quang ph hunh quang. [1], [2] nh tớnh [1] Cú th da vo bc súng kớch thớch v bc súng hunh quang phỏt ra nh tớnh cỏc hp cht nh lng [1], [2] - Phng phỏp hunh quang cú nhy v c hiu cao Cú th o trc tip cng hunh quang v dựng phng phỏp so sỏnh nh lng cỏc hp cht phỏt hunh quang. .. th c gim thiu - Ph hunh quang thu c trong quột ng b cú phõn gii cao hn, rừ rng, sc nột v nh pic hp hn so vi ph hunh quang thụng thng iu ny cú th c gii thớch da vo hỡnh 2 di õy - Vi nhng cht phỏt hunh quang yu quột ng b lm tng cng hunh quang Hỡnh 2 S gii thớch v quột ng b ph hunh quang Mt phõn t cú th c kớch thớch trong ton b di hp th bt u t bc súng A1, A2A9 v cho hunh quang trong khong bc súng F1,... hunh quang cú th tỏc dng vi thuc th khụng hunh quang to ra cỏc dn cht cú hunh quang hay dựng cỏc thuc th cú hunh quang o v s dng cỏc cỏch x lý thớch hp - i vi cỏc hp cht vụ c, phng phỏp o hunh quang cú th c tin hnh theo 2 kiu trc tip v giỏn tip Phng phỏp trc tip da trờn phn ng ca cht phõn tớch vi mt tỏc nhõn to phc to ra phc cht phỏt hunh quang 15 Phng phỏp giỏn tip da trờn s gim hay tt hunh quang. .. Hỡnh 3.1 Ph ng b hunh quang ca AZTR 10mg/L trong HCl 9M, =30nm, t=21-230C ti thi im 30 phỳt 26 Hỡnh 3.2 Ph ng b hunh quang ca AZTR 10mg/L trong H2SO4 9M, =30nm, t=21-230C, ti thi im 30 phỳt Hỡnh 3.3.Ph ng b hunh quang ca AZTR 10mg/L trong HNO3 9M, =30nm, t=21-230C, ti thi im 30 phỳt Nhn xột: Kho sỏt cựng mt nng lm vic AZTR 10mg/L, cựng nhit v tin hnh quột ng b ph hunh quang trong cựng mt iu kin chỳng... kin chỳng tụi nhn thy: - Ph ng b hunh quang ca AZTR trong HNO3 9M rt nhiu, cú th AZTR ó b bin i thnh cht khỏc 27 - Trong H2SO4 cú xut hin pic, tuy nhiờn cng hunh quang thp, khụng m bo tớnh chớnh xỏc cho nh lng - Trong HCl 9M cho pic cõn i, cng hunh quang cao Vỡ vy m bo nhy v tớnh chớnh xỏc ca phng phỏp chỳng tụi chn HCl to dn xut phỏt hunh quang ca AZTR trong nghiờn cu ny 3.1.2.2.Kho sỏt nng... dung dch ny trong iu kin nh mc 3.1.2.1 Kt qu: Ph ng b hunh quang ca AZTR 10mg/mL trong dung dch acid HCl cỏc nng khỏc nhau ti thi im 30 phỳt thu c Hỡnh 3.1, Hỡnh 3.4, Hỡnh 3.5 28 Hỡnh3.4 Ph ng b hunh quang ca AZTR 10mg/L trong HCl 7M, 30nm, t=21-230 C ti thi im 30 phỳt = Hỡnh 3.5 Ph ng b hunh quang ca AZTR 10mg/L trong HCl 5M, =30nm, t=21-230 C, ti thi im 30 phỳt Bng 3.1 Kt qu v cng hunh quang ca... nh thỡ c gi l k thut liờn tc bc súng õy l k thut n gin v c s dng thng xuyờn nht trong cỏc ch ng b Vỡ vy núi chung quột ng b ph hunh quang cp n k thut ny 1.2.2.2.c im ca quột ng b ph hunh quang [14] - Thu hp di quang ph: Tỏc ng ny ch yu l kt qu ca vic ng thi tng hoc gim cng hunh quang - n gin húa ph phỏt x :Trong ph hunh quang thụng thng ti 1 bc súng kớch thớch c nh ( ex) nú cú th tng cng ca tt c . dựng phƣơng pháp định lƣợng và khảo sát hàm lƣợng Azithromycin trong chế phẩm bằng kỹ thuật quét đồng bộ phổ huỳnh quang với các mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định lượng AZTR bằng kỹ thuật. 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HIỀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT QUÉT ĐỒNG BỘ PHỔ HUỲNH QUANG . BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HIỀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT QUÉT ĐỒNG BỘ PHỔ HUỲNH QUANG