ĐẶT VẤN ĐỀ Việc phát hiện ra kháng sinh và các đặc tính của chúng đã tạo ra một cuộc cách mạng lớn trong y học, cứu loài người thoát khỏi nhiều thảm dịch do vi khuẩn gây ra. Hiện nay, kháng sinh là dạng thuốc được dùng phổ biến ở nước ta, một quốc gia có mô hình bệnh tật chiếm tỷ lệ khá cao là nhiễm khuẩn. Chính việc lạm dụng kháng sinh quá mức dẫn đến tình trạng kháng thuốc nghiêm trọng. Hầu hết, các kháng sinh được sử dụng ở người và thải ra môi trường dưới nhiều hình thức khác nhau như bài tiết, tồn dư trong các dụng cụ y tế, bông, băng,... điều này đã góp phần vào sự tồn dư kháng sinh trong nước thải, đặc biệt là trong nước thải bệnh viện. Không những thế, lượng kháng sinh bằng các con đường khác nhau thải ra môi trường càng làm gia tăng tình trạng đáng lo ngại này. Ảnh hưởng của việc thải kháng sinh đến môi trường thể hiện ở các khía cạnh sau: Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật của đất 28, 29, 30, 31. Quần thể vi sinh vật đất có ý nghĩa rất quan trọng trong các chu trình chuyển hoá vật chất trong đất và cải thiện độ phì nhiêu của đất. Kháng sinh dù bằng con đường nào được thải ra môi trường đều phá vỡ sự cân bằng sinh thái hệ vi sinh vật và ảnh hưởng đến độ phì của đất, tăng ô nhiễm môi trường. Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường 28, 29, 30, 31. Kháng sinh được thải ra môi trường bằng nhiều con đường khác nhau, trong môi trường chứa rất nhiều loài vi sinh vật, trong đó có nhiều loài vi khuẩn đã có khả năng kháng một hoặc một vài loại kháng sinh, chính chúng là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường. Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm 28, 29, 30, 31.
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ NGA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TẠI HÀ NỘI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 . BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ NGA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TẠI HÀ NỘI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. Ths. Nguyễn Thanh Phương 2. Ths. Nguyễn Trung Hiếu Nơi thực hiện: 1. Phòng phân tích II- TT kiểm nghiệm Dược phẩm- Mỹ phẩm Hà Nội 2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2013 . LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn đến Ths Nguyễn Thanh Phương, Ths Nguyễn Trung Hiếu, Dược sỹ Dương Thị Vân đã trực tiếp giúp đỡ cung cấp cho em những tài liệu, hướng dẫn em những kỹ năng cần thiết để em hoàn thành khóa luận này. Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích - Trường Đại học Dược Hà Nội, các cán bộ phòng phân tích II- Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Hà Nội đã giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài. Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu nhà trường, phòng đào tạo đã tạo điều kiện tốt nhất cho em để hoàn thành quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, em vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, những người đã luôn động viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có được kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2013. Sinh viên Phạm Thị Nga. . MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ SULFAMETHOXAZOL. 3 1.1.1. Công thức cấu tạo. 3 1.1.2. Tính chất. 3 1.1.3. Cơ chế tác dụng. 4 1.1.4. Dược động học, độ ổn định. 5 1.1.5. Tác dụng dược lý. 6 1.1.6. Chỉ định. 6 1.1.7. Tác dụng không mong muốn. 6 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SULFAMETHOXAZOL. 7 1.2.1. Phương pháp đo nitrit. 7 1.2.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao. 7 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ. 8 1.3.1 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ. 9 1.3.2 Một số kỹ thuật LC-MS. 16 . CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 18 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGIÊN CỨU. 18 2.1.1. Hóa chất, thuốc thử. 18 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ. 18 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu. 19 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. 19 2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích. 19 2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích. 20 2.2.4. Ứng dụng phương pháp. 20 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 20 2.3.1. Xây dựng phương pháp phân tích. 20 2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích. 20 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu. 22 2.3.4. Ứng dụng phương pháp. 23 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 24 3.1. KHẢO SÁT VÀ TÌM ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG-KHỐI PHỔ. 24 3.1.1. Xây dựng chương trình sắc ký. 24 3.1.2. Xây dựng chương trình sắc ký khối phổ. 28 3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN. 31 3.3. CHUẨN BỊ MẪU. 33 3.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH. 34 3.4.1. Tính chọn lọc. 34 3.4.2. Xác định khoảng tuyến tính. 35 3.4.3. Tính thích hợp. 37 3.4.4. Độ đúng. 37 3.4.5. Độ chính xác. 39 . 3.4.6. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ. 39 3.4.7. Khảo sát độ ổn định của sulfamethoxazol trong dung môi. 40 3.5. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG SULFAMETHOXAZOL TRONG MỘT SỐ MẪU NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN. 42 3.6. BÀN LUẬN. 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT. 46 KẾT LUẬN. 46 ĐỀ XUẤT. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO. PHỤ LỤC. . DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 01 Kết quả lựa chọn dung môi pha động 25 02 Kết quả lựa chọn tốc độ dòng 26 03 So sánh khả năng chiết 32 04 Cách pha dãy dung dịch chuẩn 33 05 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của sulfamethoxazol 36 06 Kết quả khảo sát tính thích hợp 37 07 Kết quả khảo sát độ đúng 38 08 Kết quả khảo sát độ chính xác 39 09 Độ ổn định của sulfamethoxazol trong dung môi 41 10 Kết quả hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong một số mẫu nước thải bệnh viện 43 11 Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ chất ô nhiễm Phụ lục . DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 01 Các bộ phận của detector khối phổ 11 02 Mô hình nguyên lý kỹ thuật APCI 12 03 Mô hình nguyên lý kỹ thuật ESI 13 04 Sơ đồ bộ phân tích ion bẫy tứ cực 14 05 Một số bộ phân tích khối khác 15 06 Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LCMS-8030 19 07 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN-H 2 O : 1-1) 25 08 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN- H 2 O: 8-2) 25 09 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động (ACN- H 2 O: 2-8) 26 10 Sắc ký đồ mẫu chứa SMZ với điều kiện sắc ký đã khảo sát lại. 27 11 Phổ khối của SMZ 0,05 ppm pha trong ACN: H 2 O (1:1). 29 12 Phổ khối của SMZ thu được ở các mức năng lượng va chạm CE= 25V 30 13 Sắc ký đồ mẫu trắng 34 14 Sắc ký đồ mẫu sulfamethoxazol chuẩn nồng độ 0,05 µg/ml 34 15 Sắc ký đồ mẫu thử 35 16 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ sulfamethoxazol 36 17 Sắc ký đồ khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 40 18 Sắc ký đồ mẫu thử DHY (TXL) Phụ lục 19 Sắc ký đồ mẫu thử DHY (SXL) Phụ lục 20 Sắc ký đồ mẫu thử TN (TXL) Phụ lục . 21 Sắc ký đồ mẫu thử TN (SXL) Phụ lục 22 Sắc ký đồ mẫu thử BM (TXL) Phụ lục 23 Sắc ký đồ mẫu thử BM (SXL) Phụ lục . DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN: Acetonitril. Full scan: Kỹ thuật phân tích toàn thang. HPLC: High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao). LC-MS: Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass Spectrometry). LC-MS/MS: Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (Liquid Chromatography Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry). LOQ: Giới hạn định lượng dưới (Limit of Quantitation). Lt: Lý thuyết. m/z: Khối lượng / Điện tích. RSD% : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation). SPE: Solid phase extraction (Chiết pha rắn). STT: Số thứ tự. SMZ: Sulfamethoxazol. SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation). SIM: Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion. IT.s : Cường độ tín hiệu.giây (intensity.second). SXL: Sau xử lý. TB: Trung bình. Tt: Thực tế. TXL: Trước xử lý. . [...]... tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải một số bệnh viện tại Hà Nội bằng kỹ thuật LC- MS Với các mục tiêu sau: Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng kháng sinh sulfamethoxazol bằng kỹ thuật LC- MS Thẩm định phương pháp vừa xây dựng Khảo sát hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải tại một số bệnh viện tại Hà Nội 3... lượng sulfamethoxazol trong nước thải tại một số bệnh viện 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích Dùng phương pháp chiết pha rắn để chiết sulfamethoxazol từ nước thải bệnh viện Dùng kỹ thuật LC- MS để xác định hàm lượng sulfamethoxazol trong nước thải bệnh viện 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 2.3.2.1 Tính chọn lọc Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất... Exel • Hệ số tương quan (r) được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoft 2.3.4 Ứng dụng phương pháp Áp dụng phương pháp đã xây dựng và thẩm định, tiến hành định lượng sulfamethoxazol trong nước thải tại một số bệnh viện khác nhau 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KHẢO SÁT VÀ TÌM ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ 3.1.1 Xây dựng chương trình sắc ký a Lựa chọn cột sắc ký Qua tham khảo tài... tích sulfamethoxazol 20 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích Thẩm định phương pháp phân tích đã được lựa chọn với các chỉ tiêu: Tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, tính thích hợp, độ chính xác, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), độ ổn định của phương pháp 2.2.3 Ứng dụng phương pháp Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng sulfamethoxazol. .. kháng sinh trong nước thải bệnh viện tương đối thấp nên các phương pháp trên không đáp ứng được yêu cầu Chính vì thế, cần sử dụng LC- MS với độ nhạy cao hơn để định lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải bệnh viện 8 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ [1], [8], [15] Sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS) là kỹ thuật phân tích chất dựa trên sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân... hiệu /nhiễu đường nền) Kỹ thuật SIM nhạy hơn Full scan Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích dư lượng một chất đã biết trong một mẫu phức tạp 1.3.2.3 Kỹ thuật MS/ MS Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó được phân tích tiếp bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2 Kỹ thuật MS/ MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm... còn kháng sinh dự phòng khi nhiễm khuẩn nhẹ Sulfamethoxazol là một kháng sinh thuộc nhóm sulfamid, là nhóm có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong bệnh viện để điều trị nhiễm khuẩn đặc biệt là nhiễm khuẩn tiết niệu [7] Do đó, khả năng có mặt của sulfamethoxazol trong nước thải bệnh viện là rất lớn Mặc dù, có xuất hiện trong nước thải bệnh viện nhưng hàm lượng của chúng lại rất nhỏ, những phương pháp. .. Phễu thủy tinh và các loại dụng cụ khác 19 Hình 06: Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LCMS-8030 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu • Mẫu thử: Mẫu nước thải các bệnh viện: - Bệnh viện Đại học Y Hà Nội (ĐHY) lấy ngày 9/12/2012 - Bệnh viện Bạch Mai (BM) lấy ngày 3/3 /2013 - Bệnh viện Thanh Nhàn (TN) lấy ngày 24/3 /2013 Trước xử lý (TXL) và sau xử lý (SXL) qua hệ thống xử lý nước thải tại bệnh viện • Mẫu trắng... mẫu không có kháng sinh sulfamethoxazol, các thành phần khác tương tự mẫu thử, là mẫu nước thải bệnh viện Ba Vì trước xử lý lấy ngày 23/12/2012 đã xác định không có chứa kháng sinh SMZ 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích Xây dựng chương trình sắc ký - Lựa chọn cột sắc ký - Lựa chọn thành phần phần pha động và tỷ lệ thành phần pha động - Lựa chọn tốc độ dòng Xây dựng chương... của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường [28], [29], [30], [31] Kháng sinh được thải ra môi trường bằng nhiều con đường khác nhau, trong môi trường chứa rất nhiều loài vi sinh vật, trong đó có nhiều loài vi khuẩn đã có khả năng kháng một hoặc một vài loại kháng sinh, chính chúng là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường - Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm [28], [29], . ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ NGA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH SULFAMETHOXAZOL TRONG NƯỚC THẢI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TẠI HÀ NỘI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS “ Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải một số bệnh viện tại Hà Nội bằng kỹ thuật LC-MS” Với các mục tiêu sau: Nghiên cứu xây dựng. dựng phương pháp định lượng kháng sinh sulfamethoxazol bằng kỹ thuật LC-MS. Thẩm định phương pháp vừa xây dựng. Khảo sát hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazol trong nước thải tại một số bệnh